Artykuł metodologiczny

Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58228

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, KU Open Innovation Center, Research Institute of Medical Science, Konkuk University School of Medicine, 2Department of Emergency Medical Services, Eulji University, 3Department of Mechanical Engineering, Sungkyunkwan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mechanowrażliwe kanały jonowe są często badane pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą z zapisem patch-clamp. Jednakże, w zależności od protokołu eksperymentalnego, wynik dotyczący regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych może być błędny. W tym miejscu przedstawiamy metody zapobiegania i korygowania takich błędów wraz z podstawami teoretycznymi.

Streszczenie

Przepływ płynów jest ważnym bodźcem środowiskowym, który kontroluje wiele procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane przepływem płynów. Chociaż mechanizmy molekularne biologicznych reakcji na przepływ płynu/siłę ścinającą nie są w pełni poznane, regulacja bramkowania kanałów jonowych za pośrednictwem przepływu płynów może się do tego krytycznie przyczynić. W związku z tym badano wrażliwość kanałów jonowych na przepływ/siłę ścinającą płynu przy użyciu techniki patch-clamp. Jednak w zależności od protokołu eksperymentalnego wyniki i interpretacja danych mogą być błędne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne i teoretyczne dowody na błędy związane z przepływem płynów oraz przedstawiamy metody szacowania, zapobiegania i korygowania tych błędów. Zmiany potencjału połączeniowego między elektrodą referencyjną Ag/AgCl a płynem do kąpieli mierzono za pomocą otwartej pipety wypełnionej 3 M KCl. Przepływ płynu mógł następnie przesunąć potencjał złącza ciecz/metal do około 7 mV. I odwrotnie, mierząc przesunięcie napięcia wywołane przepływem płynu, oszacowaliśmy stężenie jonów w niezmieszanej warstwie granicznej. W warunkach statycznych rzeczywiste stężenia jonów przylegające do elektrody referencyjnej Ag/AgCl lub wlotu kanału jonowego na powierzchni błony komórkowej mogą osiągnąć nawet około 30% stężenia w warunkach przepływu. Umieszczenie mostka agarozowego 3 M KCl między płynem kąpielowym a elektrodą odniesienia mogło zapobiec temu problemowi przesunięcia potencjału złączowego. Jednak efekt niezmieszanej warstwy przylegającej do powierzchni błony komórkowej nie mógł być utrwalony w ten sposób. W tym miejscu przedstawiamy metodę pomiaru rzeczywistych stężeń jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej, podkreślając znaczenie stosowania mostka soli agarozowej podczas badania regulacji prądów jonowych wywołanej przepływem płynu. Dlatego to nowatorskie podejście, które uwzględnia rzeczywiste stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej, może dostarczyć użytecznych informacji na temat projektu eksperymentalnego i interpretacji danych związanych z regulacją naprężeń ścinających płynu w kanałach jonowych.

Wprowadzenie

Przepływ płynów jest ważną wskazówką środowiskową, która kontroluje wiele procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane przepływem płynów oraz zależna od siły ścinającej płynu przebudowa i rozwój naczyń krwionośnych1,2,3,4,5. Chociaż mechanizmy molekularne biologicznych reakcji na siłę ścinającą przepływ płynu nie są w pełni zrozumiałe, uważa się, że regulacja bramkowania kanału jonowego za pośrednictwem przepływu płynu może krytycznie przyczyniać się do reakcji wywołanych przepływem płynu5,6,7,8. Na przykład, sugeruje się, że aktywacja śródbłonkowego prostownika wewnętrznego Kir2.1 i kanałów K+ aktywowanych przez Ca2+ (KCa2.3, KCNN3) po napływie Ca2+ przez przepływ płynu przyczynia się do rozszerzenia naczyń krwionośnych wywołanego przepływem płynu6,7,8. W związku z tym wiele kanałów jonowych, zwłaszcza kanałów aktywowanych mechanicznie lub hamowanych, zostało przebadanych pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą za pomocą techniki patch-clamp6,9,10,11. Jednak w zależności od protokołu eksperymentalnego przeprowadzonego podczas rejestracji patch-clamp, wyniki i interpretacja danych dotyczących regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych mogą być błędne10,11.

Jednym ze źródeł artefaktów wywołanych przepływem płynu w zapisie patch-clamp jest potencjał połączenia między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl11. Powszechnie uważa się, że potencjał połączenia ciecz/metal między płynem do kąpieli a elektrodą Ag/AgCl jest stały, ponieważ stężenie Cl- w płynie do kąpieli jest utrzymywane na stałym poziomie, biorąc pod uwagę, że reakcja chemiczna między roztworem do kąpieli a elektrodą Ag/AgCl wynosi:

Ag + Cl- ↔ AgCl + elektron (e-) (Równanie 1)

Jednak w przypadku, gdy ogólna reakcja elektrochemiczna między roztworem do kąpieli a elektrodą odniesienia Ag/AgCl (Równanie 1) przebiega od lewej do prawej, stężenie Cl- płynu do kąpieli przylegającego do elektrody referencyjnej Ag/AgCl (niezmieszana warstwa graniczna12,13,14,15) może być znacznie niższa niż w roztworze do kąpieli, chyba że zapewniony jest wystarczający transport konwekcyjny. Używanie starej lub nieidealnej elektrody Ag/AgCl z niewystarczającym chlorowaniem Ag może zwiększyć takie ryzyko. Ten artefakt związany z przepływem płynu na elektrodzie referencyjnej można w rzeczywistości wykluczyć, po prostu umieszczając konwencjonalny mostek agarozowo-solny między płynem do kąpieli a elektrodą odniesienia, ponieważ artefakt opiera się na zmianach rzeczywistego stężenia Cl- w sąsiedztwie elektrody Ag/AgCl11. Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje, w jaki sposób zapobiegać zmianom potencjału złącza związanym z przepływem i mierzyć rzeczywiste stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej.

Po umieszczeniu agarozowego mostka KCl między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl, należy wziąć pod uwagę jeszcze jeden kluczowy czynnik: tak jak referencyjna elektroda Ag/AgCl działa jak elektroda Cl-, kanały jonowe również mogą funkcjonować jak elektroda selektywna jonowo. Sytuacja niewymieszanej warstwy granicznej między płynem kąpielowym a elektrodą odniesienia Ag/AgCl powstaje podczas przepływu jonów między roztworami zewnątrzkomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi przez błonowe kanały jonowe. Oznacza to, że należy zachować ostrożność przy interpretacji regulacji kanałów jonowych przez przepływ płynu. Jak omówiono w naszym poprzednim badaniu11, ruch jonów przez roztwór, w którym występuje gradient elektrochemiczny, może zachodzić poprzez trzy odrębne mechanizmy: dyfuzję, migrację i konwekcję, gdzie dyfuzja to ruch wywołany gradientem stężenia, migracja to ruch napędzany gradientem elektrycznym, a konwekcja to ruch przez przepływ płynu. Spośród tych trzech mechanizmów transportu, tryb konwekcji najbardziej przyczynia się do ruchu jonów11 (> 1000 razy większy niż dyfuzja lub migracja przy zwykłych ustawieniach patch-clamp). Stanowi to teoretyczną podstawę do wyjaśnienia, dlaczego potencjał połączenia między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl może występować w różnych warunkach statycznych i przepływu płynu11.

Zgodnie z hipotezą zaproponowaną powyżej, pewne efekty ułatwiające przepływ płynu na prąd kanału jonowego można wywnioskować z konwekcyjnego przywrócenia rzeczywistych stężeń jonów przylegających do wlotu kanału na powierzchni membrany (niezmieszana warstwa graniczna)10. W tym przypadku wpływ przepływu płynu na prądy kanałów jonowych wynikał po prostu ze zdarzeń elektrochemicznych, a nie z regulacji bramkowania kanałów jonowych. Podobny pomysł został wcześniej zasugerowany przez Barry'ego i współpracowników12,13,14,15 w oparciu o rygorystyczne rozważania teoretyczne i dowody eksperymentalne, znane również jako efekt warstwy niezmieszanej lub liczby transportowej. Jeśli niektóre kanały jonowe mają wystarczającą przewodność jednokanałową i wystarczająco długi czas otwarcia, aby zapewnić wystarczające szybkości transportu przez kanały (szybsze tempo transportu w membranie niż na niezmieszanej powierzchni membrany), może wystąpić efekt warstwy granicznej. W ten sposób transport zależny od konwekcji może przyczynić się do ewentualnego wywołania przepływu płynu ułatwień prądu jonowego10,12,13,14,15.

W tym badaniu podkreślamy znaczenie użycia mostka solnego z agaru lub agarozy podczas badania regulacji prądów jonowych wywołanej przepływem płynu. Udostępniamy również metodę pomiaru rzeczywistych stężeń jonów w niezmieszanej warstwie granicznej przylegającej do elektrody referencyjnej Ag/AgCl i membranowych kanałów jonowych. Co więcej, teoretyczna interpretacja modulacji prądów kanałów jonowych indukowanej przepływem płynu (tj. hipoteza konwekcji lub efekt liczby transportu warstwy niezmieszanej) może dostarczyć cennych informacji dla projektowania i interpretacji badań nad regulacją siły ścinającej kanałów jonowych. Zgodnie z efektem liczby transportu warstwy granicznej bez mieszania, przewidujemy, że prądy kanałów jonowych przez wszystkie typy kanałów jonowych błony mogą być ułatwione przez przepływ płynu, niezależnie od ich biologicznej wrażliwości na siłę ścinającą przepływ płynu, ale tylko wtedy, gdy kanały jonowe mają wystarczającą przewodność jednokanałową i długi czas otwarcia. Wyższe gęstości prądu kanału jonowego mogą zwiększać efekt niezmieszanej warstwy granicznej na powierzchni błony komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Konkuk.

1. Mostki soli agarozowej między roztworem kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl

UWAGA: Mostki solne Agarose 3M KCl są produkowane zgodnie z wcześniejszym opisem12 z niewielkimi zmianami.

  1. Tworzenie mostów
    1. Zegnij rurki kapilarne ze szkła ogniowego, aby odpowiednio uformować kształt litery U. Wewnętrzna średnica kapilar powinna być wystarczająco duża, aby zmniejszyć rezystancję szeregową podczas rejestrowania dużych prądów jonowych. Zwykle dopuszczalne są rurki o średnicy wewnętrznej 2-5 mm.
  2. Przygotowanie roztworu agarozy 3 M KCl
    1. Przygotować 100 ml 3 M roztworu KCl (dopuszczalne jest również 1 M lub 2 M).
    2. Waga 3 g agarozy.
    3. Rozpuścić agarozę w 100 ml KCl (tj. 3% agarozy) na gorącej płycie w temperaturze od 90 do 100 °C.
  3. Obciążenie mostów agarozą 3 M KCl
    1. Aby ułatwić załadunek, zanurz szklane mostki w kształcie litery U w roztworze agarozy-KCl.
      UWAGA: Łatwo jest wykopać szklane mostki, jeśli roztwór agarozy-KCl znajduje się w płytkim i szerokim pojemniku.
    2. Przechowuj je przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby agaroza stwardniała i stwardniała.
    3. Ostrożnie wykop szklane mostki obciążone agarozą KCl z zestawu/utwardzonej soli agarozowej.
  4. Przechowywanie mostów
    1. Przygotować wystarczającą ilość (tj. 500 ml) roztworu 3 M KCl w butelce z szeroką szyjką.
    2. Przygotowane mostki agarozowo-solne przechowuj w butelce w lodówce.

2. Zastosowanie siły ścinającej przepływu płynu do komórek w komorze zaciskania łat

UWAGA: Schemat eksperymentalny układu zacisku krosowego jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Umieścić pojemnik załadowany roztworem do kąpieli (objętość i wysokość powinny być już zmierzone) nad komorą zacisku krosowego.
  2. Napełnij komorę zacisku krosowego roztworem do kąpieli, odsysając rurkę.
  3. Aby zatrzymać przepływ płynu, przypnij rurkę z boku pojemnika, aby zablokować przepływ płynu, a następnie przypnij rurkę po stronie ssącej, aby jednocześnie zatrzymać ssanie. Jest to "stacjonarny" warunek sterowania.
  4. Aby zastosować siłę ścinającą przepływ płynu, otwórz jednocześnie obie rurki po stronie zbiornika i ssawki.
  5. Przed lub po przyłożeniu siły ścinającej przepływu płynu do ogniwa zmierz natężenie przepływu w ml/min.
  6. Oblicz natężenie przepływu, mierząc spadek objętości płynu w danym czasie.
  7. Na podstawie zmierzonego natężenia przepływu i geometrii (struktury) komory kąpielowej należy oszacować siłę ścinającą wywieraną na komórkę przez przepływ płynu (patrz punkt dyskusji).
  8. Alternatywnie, aby kontrolować natężenie przepływu (dla kroków 2.3-2.6), użyj pompy perfuzyjnej. W takim przypadku należy uważać, aby zapewnić stały, a nie pulsacyjny przepływ.

3. Pomiar zmian potencjału złącza ciekło-metalowego przez przepływ płynu między roztworem kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl (Rysunek 3A)

  1. Stosować elektrodę lub granulat Ag/AgCl, który jest dostępny w gotowych produktach, bez mostka solnego agarozy.
  2. Przygotować normalną fizjologiczną sól fizjologiczną do komory kąpielowej (np. 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukozy; pH dostosowane do 7,4 z NaOH).
  3. Umieścić pipetę krosową zawierającą 3 M roztwór KCl w komorze, aby zminimalizować przesunięcie potencjału połączenia między pipetą a roztworami do kąpieli.
  4. Ustawić napięcie-clamp amplifier na prąd clamp tryb ("I = 0" lub "CC").
  5. Po zniwelowaniu początkowego potencjału przesunięcia zmierz zmiany napięcia wywołane różnymi natężeniami przepływu.
  6. Aby sprawdzić, czy zmiany napięcia są potencjałami złącza ciecz/metal, należy ponownie zbadać wpływ przepływu płynu na potencjał złącza za pomocą mostka agarozowo-solnego między roztworem kąpieli a elektrodą Ag/AgCl.

4. Eksperymentalne oszacowanie rzeczywistego stężenia Cl- w niezmieszanej warstwie przylegającej do elektrody Ag/AgCl w warunkach statycznych (Rysunek 3B)

  1. Na podstawie wyników kroku 3 narysuj zależności potencjał-natężenie przepływu złącza i oszacuj maksymalną (nasyconą) wartość przesunięcia potencjału złącza przez natężenie przepływu płynu nadziemnego.
  2. Przygotować roztwory o różnych stężeniach Cl (tj. 50, 99, 147, 195 i 288 mM NaCl).
  3. Zmieniając stężenie Cl- w płynie do kąpieli, narysuj zależność potencjał-[Cl-]. Należy pamiętać, że szybkość płynu powinna być stała i wystarczająco wysoka (> 30 ml/min), aby zapobiec spadkowi stężenia Cl- do stężenia sąsiedniej elektrody referencyjnej Ag/AgCl.
  4. Na podstawie dwóch krzywych zależności oszacuj zmiany stężenia Cl- na podstawie zmierzonego przesunięcia potencjału złącza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ca2+ kanały typu L zależne od napięcia w konfiguracji whole-cell2+ kanał (VDCC)LPrądy rejestrowano w enzymatycznie rozproszonych miocytach tętnic krezkowych szczura, zgodnie z wcześniejszym opisem11Miocyty tętnicze poddano dializie przy użyciu roztworu do pipety bogatego w Cs w konfiguracji z nystatyną (perforowanej), stosując roztwór kąpielowy pozbawiony kationów dwuwartościowych, aby ułatwić przepływ prądu przez VDCC.L

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu zademonstrowaliśmy metodę pomiaru rzeczywistego stężenia Cl- w niezmieszanej warstwie przylegającej do elektrody referencyjnej Ag/AgCl poprzez określenie potencjału złącza ciekłego metalu za pomocą otwartej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wysokim stężeniem KCl. Zmiana stężenia Cl- w warstwie granicznej może spowodować przesunięcie potencjału złącza podczas przełączania z warunków statycznych na warunki przepływu płynu. Proste użycie agarozowego mostka KCl między elektrodą odnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Program Centrum Badawczego Pioneer (2011-0027921), przez Programy Badań Nauk Podstawowych (2015R1C1A1A02036887 i NRF-2016R1A2B4014795) przez Narodową Fundację Badawczą Korei finansowane przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości oraz przez grant Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych przez Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), finansowane przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (HI15C1540).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RC-11 otwarta komora kąpielowaWarner instruments, USAW4 64-0307
Ag/AgCl granulat elektrodyWorld Precision Instruments, USAEP1
AgarozaSigma-aldrich, Stany ZjednoczoneA9793
Wzmacniacz cęgowynapięcia HEKA, NiemcyEPC8
Wzmacniacz cęgowyMolecular Devices, USAAxopatch 200B
Pompa cieczyKNF Flodos, SzwajcariaFEM08

Bibliografia

  1. Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
  2. Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
  3. Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
  4. Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
  5. Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
  6. Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  7. Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
  8. Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
  9. Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
  10. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585(2016).
  11. Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
  12. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
  13. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
  14. Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
  15. Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
  16. Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
  17. A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
  18. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
  19. Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar st enia jon wregulacja przep ywu p ynubramkowanie kana w jonowychprzesuni cie potencja u z czowegoagarozowy mostek solnypotencja z czowy metalu ciek egopr dy VDCC Lpr dy Kerr 2 1

Powiązane artykuły