Artykuł metodologiczny

Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

DOI:

10.3791/58232

⸱

4 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Molecular and Comparative Pathobiology, National Taiwan University, 2School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 3Department of Oceanography and Asia-Pacific Ocean Research Center, National Sun Yat-sen University, 4Graduate Institute of Veterinary Pathobiology, National Chung Hsing University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół lokalizacji Ag w tkankach wątroby i nerek waleni za pomocą autometalografii. Ponadto opracowano nowy test, nazwany histologicznym testem Ag waleni (CHAA) w celu oszacowania stężeń Ag w tych tkankach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach ochrony zdrowia, ze względu na ich silne działanie przeciwbakteryjne. Mogą one również być uwalniane do środowiska i gromadzić się w oceanie. W związku z tym AgNPs są głównym źródłem zanieczyszczenia AgNP, a świadomość społeczna na temat toksyczności Ag dla środowiska rośnie. Wcześniejsze badania wykazały bioakumulację (u producentów) i powiększenie (u konsumentów/drapieżników) Ag., jako szczytowe drapieżniki oceanu, mogły być pod negatywnym wpływem związków Ag/Ag. Chociaż stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni można mierzyć za pomocą spektroskopii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), zastosowanie ICP-MS jest ograniczone ze względu na wysoki koszt kapitałowy i wymóg przechowywania/przygotowania tkanek. Dlatego metoda autometalografii (AMG) z obrazową analizą ilościową przy użyciu tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE) może być metodą adiuwantową do lokalizacji dystrybucji Ag na poziomie podnarządowym i oszacowania stężenia Ag w tkankach waleni. Sygnały dodatnie AMG to głównie brązowe do czarnych granulki o różnych rozmiarach w cytoplazmie bliższego nabłonka kanalików nerkowych, hepatocytów i komórek Kupffera. Czasami w świetle i błonie podstawnej niektórych bliższych kanalików nerkowych obserwuje się amorficzne złotożółte do brązowych sygnały dodatnie AMG. Test do szacowania stężenia Ag nosi nazwę Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), który jest modelem regresji ustalonym na podstawie danych z obrazowej analizy ilościowej metody AMG i ICP-MS. Wykorzystanie AMG z CHAA do lokalizacji i półkwantyfikacji metali ciężkich stanowi wygodną metodologię dla badań czasoprzestrzennych i międzygatunkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach ochrony zdrowia, ze względu na ich doskonałe działanie przeciwdrobnoustrojowe1,2. W związku z tym produkcja AgNP i liczba produktów zawierających AgNP są z czasem zwiększone3,4. Jednak AgNPs mogą być uwalniane do środowiska i gromadzić się w oceanie5,6. Stały się one głównym źródłem zanieczyszczenia Ag, a świadomość społeczna na temat toksyczności Ag dla środowiska rośnie.

Status AgNPs i Ag w środowisku morskim jest skomplikowany i ciągle się zmienia. Wcześniejsze badania wykazały, że AgNP mogą pozostawać jako cząstki, agregować, rozpuszczać się, reagować z różnymi formami chemicznymi lub być regenerowane z jonów Ag+7,8. Kilka rodzajów związków Ag, takich jak AgCl, znaleziono w osadach morskich, gdzie mogą być spożywane przez organizmy bentosowe i wchodzić do łańcucha pokarmowego9,10. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami przeprowadzonymi w rejonie laguny Chi-ku wzdłuż południowo-zachodniego wybrzeża Tajwanu, stężenia Ag w osadach morskich są niezwykle niskie i podobne do obfitości skorupy ziemskiej, a stężenia w tkance wątroby ryb są zwykle poniżej granicy wykrywalności (< 0,025 μg/g mokrej/mokrej)11. Jednak wcześniejsze badania przeprowadzone w różnych krajach wykazały stosunkowo wysokie stężenia Ag w wątrobach waleni12,13. Stężenie Ag w wątrobach waleni jest zależne od wieku, co sugeruje, że źródłem Ag w ich ciałach jest najprawdopodobniej ich zdobycz12. Odkrycia te sugerują biomagnifikację Ag u zwierząt na wyższych poziomach troficznych. , jako szczytowe drapieżniki w oceanie, mogły ponieść negatywne skutki zdrowotne spowodowane przez związki Ag/Ag12,13,14. Co najważniejsze, podobnie jak, ludzie są ssakami, a negatywny wpływ na zdrowie spowodowany przez związki Ag/Ag u waleni może również wystąpić u ludzi. Innymi słowy, mogą być zwierzętami wskaźnikowymi dla zdrowia środowiska morskiego i ludzi. Dlatego skutki zdrowotne, rozmieszczenie w tkankach i stężenie Ag u waleni są bardzo niepokojące.

Chociaż stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni mogą być mierzone za pomocą spektroskopii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), użycie ICP-MS jest ograniczone przez jego wysokie koszty kapitałowe (instrument i konserwacja) oraz wymagania dotyczące przechowywania/przygotowania tkanek12,15. Ponadto, zazwyczaj trudno jest zebrać kompleksowe próbki tkanek we wszystkich badaniach wyrzuconych na brzeg przypadków waleni ze względu na trudności logistyczne, niedobór siły roboczej i brak powiązanych zasobów12. Zamrożone próbki tkanek do analizy ICP-MS nie są łatwe do przechowywania ze względu na ograniczoną przestrzeń chłodniczą, a zamrożone próbki tkanek mogą zostać wyrzucone z powodu zepsutego sprzętu chłodniczego12. Wyżej wymienione przeszkody utrudniają badanie poziomów zanieczyszczeń w tkankach waleni za pomocą analizy ICP-MS z wykorzystaniem zamrożonych próbek tkanek. W przeciwieństwie do tego, próbki tkanek utrwalonych w formalinie są stosunkowo łatwe do pobrania podczas sekcji zwłok martwych waleni. Dlatego konieczne jest opracowanie łatwej w użyciu i niedrogiej metody wykrywania/pomiaru metali ciężkich w tkankach waleni przy użyciu próbek tkanek utrwalonych w formalinie.

Chociaż rozkład i stężenia metali alkalicznych i ziem alkalicznych mogą ulec zmianie podczas procesu FFPE (formina utrwalona w formalinie, parafina), zauważono tylko mniejszy wpływ na metale przejściowe, takie jak Ag16. W związku z tym tkanka FFPE została uznana za idealne źródło próbek do lokalizacji i pomiarów metali16,17. Autometalografia (AMG), proces histochemiczny, może wzmacniać metale ciężkie jako różnej wielkości złotożółte do czarnych dodatnie sygnały AMG na skrawkach tkanek FFPE, a te wzmocnione metale ciężkie można wizualizować pod mikroskopem świetlnym18,19,20,21. W związku z tym metoda AMG dostarcza informacji na temat rozkładu metali ciężkich w podnarządach. Może dostarczyć ważnych dodatkowych informacji do badania szlaków metabolicznych metali ciężkich w systemach biologicznych, ponieważ ICP-MS może mierzyć stężenie metali ciężkich tylko na poziomie narządów18. Ponadto oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu, takie jak ImageJ, zostało zastosowane do analizy ilościowej histologicznych skrawków tkanek 22,23. Różnej wielkości złotożółte do czarnych dodatnie sygnały AMG skrawków tkanek FFPE można określić ilościowo i wykorzystać do oszacowania stężeń metali ciężkich. Chociaż bezwzględnego stężenia Ag nie można bezpośrednio określić metodą AMG z obrazową analizą ilościową, można je oszacować za pomocą modelu regresji opartego na danych uzyskanych z obrazowej analizy ilościowej i ICP-MS, który nazywa się histologicznym testem Ag waleni (CHAA). Biorąc pod uwagę trudności w pomiarze stężeń Ag za pomocą analizy ICP-MS u większości wyrzuconych na brzeg waleni, CHAA jest cenną metodą adiuwantową do szacowania stężeń Ag w tkankach waleni, których nie można określić za pomocą analizy ICP-MS ze względu na brak zamrożonych próbek tkanek. W pracy opisano protokół techniki histochemicznej (metoda AMG) do lokalizacji Ag na poziomie podnarządowym oraz test o nazwie CHAA do oszacowania stężeń Ag w tkankach wątroby i nerek waleni.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający ustanowienie i zastosowanie histologicznego testu Ag u waleni (CHAA) do szacowania stężeń Ag. CHAA = histologiczny test Ag waleni, FFPE = utrwalony w formalinie, zatopiony w parafinie, ICP-MS = spektroskopia mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, a użycie próbek tkanek waleni zostało dopuszczone przez Radę Rolnictwa Tajwanu (Zezwolenie na badania 104-07.1-SB-62).

1. Przygotowanie próbki tkanki do analizy ICP-MS

Uwaga: Tkanki wątroby i nerek zostały pobrane od świeżo martwych i umiarkowanie autolizowanych wyrzuconych na brzeg waleni24, w tym 6 wyrzuconych na brzeg waleni 4 różnych gatunków, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Każdy wyrzucony na brzeg waleń miał numer pola do indywidualnej identyfikacji. Przygotowanie próbki tkanki do analizy ICP-MS było zgodne z metodą ustaloną w laboratorium M.H. Chena, a laboratorium M.H. Chena przeprowadziło analizę ICP-MS11,13,25.

  1. Pobrać tkanki wątroby i nerek do analizy ICP-MS od wyrzuconych na brzeg waleni i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Zbierz dopasowane parami tkanki wątroby i nerek od tych samych osieroconych waleni do analizy AMG (patrz krok 2).
  3. Przyciąć zewnętrzną warstwę próbek tkanek pobranych do analizy ICP-MS za pomocą skalpela ze stali nierdzewnej. Pokrój wewnętrzną część próbek tkanek w drobną kostkę (około 1cm3) i umieść je w plastikowych torebkach z zamkiem błyskawicznym. Zwykle każda torebka zawiera 10 g chusteczek.
  4. Przechowywać plastikowe torby zawierające próbki tkanek w temperaturze -20 °C do kolejnych zabiegów.
  5. Umieścić próbki o długości 1 cmi 3 kostki w układzie liofilizacji (-50 °C, pompa próżniowa o wydajności co najmniej 98 l/min, 0,002 mBar) przez co najmniej 72 godziny, aż do całkowitego wyschnięcia, ważąc do stałej.
  6. Homogenizuj wysuszone kostki na proszek za pomocą homogenizatora w celu późniejszego trawienia tkankowego.
  7. Odważyć 0,3 g homogenizowanych próbek liofilizowanych w butelkach z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 30 ml i wymieszać je z 10 ml kwasu azotowego o stężeniu 65% wagowym.
  8. Załóż zamknięcia na butelki z PTFE, ale pozostaw je niedokręcone.
    Uwaga: Pozwala to na tworzenie się brązowego oparu w butelkach z PTFE i refluksowanie wewnątrz butelki w celu trawienia, aż brązowy opar zniknie i stanie się przezroczysty.
  9. Podgrzewać strawione próbki na płycie grzejnej, od 30 °C do 110/120 °C (w zależności od warunków tworzenia się brązowych oparów) w butelkach z PTFE przez 2 do 3 tygodni, aż brązowawy gaz w butelkach z PTFE stanie się bezbarwny, a ciecz w butelkach z PTFE stanie się półprzezroczysta, zielonkawa, bladożółta lub całkowicie klarowna.
    Uwaga: Przeprowadź proces ogrzewania w dygestoriach chemicznych.
  10. Podgrzać strawione próbki w temperaturze 120 °C, aby odparować kwas azotowy w butelkach z PTFE, aż pozostanie tylko 0,5-1 ml.
    Uwaga: Przeprowadź proces ogrzewania w dygestoriach chemicznych i zawsze monitoruj wzrost temperatury, aby upewnić się, że z zamknięć butli PTFE nie wycieka brązowawy gaz.
  11. Dokręć zamknięcia i schładzaj je w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę.
  12. Umieścić lejki z bibułą filtracyjną na kolbach miarowych o pojemności 25 ml i przepłukać pozostałą ciecz 1 M HNO3 do końcowej objętości 25 ml.
    Uwaga: Umyj butelkę co najmniej trzy razy, a zamknięcie dwukrotnie.
  13. Walidacja jakości analitycznej analizy ICP-MS przy użyciu standardowych materiałów referencyjnych, w tym DOLT-2 (wątroba kolenia) i DORM-2 (mięsień kolenia).
  14. Do analizy ICP-MS należy użyć duplikatów każdej próbki analitycznej i trzech egzemplarzy wzorcowych materiałów odniesienia.
  15. Uśrednić stężenia Ag w każdej próbce analitycznej i przedstawić dane jako stężenie bazowe suchej masy (μg/g suchej masy).

2. Przygotowanie próbki tkanki do analizy AMG

  1. Zbierz dopasowane parami tkanki wątroby i nerek do analizy AMG od wyrzuconych waleni i utrwal je w 10% neutralnej buforowanej formalinie do czasu użycia.
    Uwaga: Przechowuj próbki tkanek w plastikowych butelkach w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF, pH 7,0) przez 24 do 48 godzin. Objętość NBF powinna być co najmniej 10 razy większa niż objętość tkanki.
  2. Przytnij tkanki wątroby i nerek utrwalone formaliną za pomocą jednorazowych ostrzy mikrotomu ze stali nierdzewnej i umieść przycięte skrawki tkanek w kasetach z etykietami.
    Uwaga: Rozmiar każdego skrawka tkanki powinien wynosić około 2 cm x 1 cm, a grubość każdego odcinka tkanki nie powinna przekraczać 3 mm. Umieść tkanki wątroby i nerek od tej samej osoby w tej samej kasecie.
  3. Odwodnić przycięte skrawki tkanek za pomocą procesora tkanek za pomocą serii stopniowanych naczyń do barwienia (70% przez 1 godzinę, 80% przez 1 godzinę, 95% przez 1 godzinę, 95% przez 2 godziny, 100% przez 1 godzinę x 2 naczynia do barwienia i 100% przez 2 godziny), nieksylen (przez 1 godzinę i 2 godziny w różnych naczyniach do barwienia) i zanurz odwodnione próbki tkanek w parafinie (przez 1 godzinę i 2 godziny w różnych naczyniach do barwienia).
  4. Umieść odwodnione próbki tkanek na dnie stalowych form histologicznych i zanurz odwodnione próbki tkanek w parafinie.
  5. Schłodź bloki tkanek zatopione w parafinie w formalinie (FFPE) na zimnej płycie, aż parafina zestali się. Przytnij bloki FFPE za pomocą mikrotomu, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta.
  6. Schłodzić bloki FFPE w temperaturze -20 °C przez 10 minut. Przeciąć bloki FFPE w temperaturze 5 μm za pomocą mikrotomu.
  7. Napełnić łaźnię wodną wodą podwójnie destylowaną o temperaturze 45 °C. Za pomocą pęsety i szczoteczki podnieś wstęgi skrawków tkanek i spraw, by unosiły się na powierzchni ciepłej wody.
  8. Oddziel wstążki skrawków tkanek pęsetą. Umieść wycinek na szkiełku mikroskopowym.
  9. Umieścić szkiełka mikroskopowe na podgrzewaczu do szkiełek i pozostawić skrawki do wyschnięcia przez noc w temperaturze 37 °C.
  10. Umieść szkiełka mikroskopowe w stojakach na szkiełka i odparafinowaj je, mocząc je w 3 różnych naczyniach barwiących z czystego nie-ksylenu (około 200 do 250 ml) przez 8, 5 i 3 minuty.
  11. Uwodnić skrawki tkanek w stojakach na szkiełka, mocząc je w różnych naczyniach barwiących z sortowanymi roztworami etanolu (100% etanolu dwa razy, 90% etanolu raz i 80% etanolu raz [1 min każdy]) i opłucz je w wodzie podwójnie destylowanej.
    Uwaga: Roztwory te mają około 200 do 250 ml w różnych naczyniach do barwienia. Na każde pranie wystarczy 30 sekund.
  12. Wypłukać skrawki tkanek w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 0,5% Triton X-100, kilkakrotnie przemyć PBS, a następnie wypłukać w wodzie podwójnie destylowanej.
    Uwaga: Roztwory te mają około 200 do 250 ml w różnych naczyniach do barwienia. Dla każdego z nich wystarczy 30 sekund.
  13. Przygotuj równe ilości trzech składników (inicjatora, moderatora i aktywatora) dostarczonych przez srebrny zestaw wzmacniający w ciemności i dokładnie je wymieszaj.
    Uwaga: Roztwory moderatora i aktywatora są lepkie, dlatego należy użyć pipety z szerokimi otworami na końcówki (lub przyciąć końcówki, aby uzyskać szersze otwory). Na każde szkiełko zwykle wystarcza 300 μl zmieszanego roztworu (w zależności od wielkości wycinka tkanki). Dlatego, jeśli używa się 10 szkiełek, ilość każdego składnika (inicjatora, moderatora i aktywatora) wynosi 1000 μl (zmieszany roztwór to 3000 μl na 10 szkiełek).
  14. Inkubować skrawki tkanek w zmieszanym roztworze przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Całkowicie pokryj skrawki tkanek na szkiełkach zmieszanym roztworem. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do fałszywie dodatnich sygnałów AMG.
  15. Umyj szkiełka wodą podwójnie destylowaną i zabarwij je w hematoksylinie przez 10 s jako przeciwbarwienie.
  16. Umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu, osusz je i zamontuj za pomocą medium montażowego.
  17. Zbadaj szkiełka pod mikroskopem świetlnym.
  18. Losowo uchwyć dziesięć obrazów histologicznych za pomocą soczewki obiektywu 40X z każdego odcinka tkanki za pomocą podłączonej kamery cyfrowej z oprogramowaniem do obrazowania komputerowego.

3. Analiza półilościowa dla dodatnich wartości AMG obrazów histologicznych

Uwaga: wartość dodatnia AMG oznacza procent obszaru z pozytywnymi sygnałami AMG.

  1. Użyj oprogramowania do analizy obrazu (ImageJ) do analizy obrazów histologicznych.
  2. Otwórz obraz histologiczny, naciskając Plik | Otwarty.
  3. Podziel wybrany obraz na trzy kanały kolorów (czerwony, niebieski i zielony), naciskając Obraz | Rodzaj | Stos RGB.
  4. Określ ilościowo pozytywne sygnały AMG za pomocą kanału niebieskiego. Jądrowe sygnały fałszywie dodatnie są zwykle zmniejszane pod niebieskim kanałem, gdy barwienie hematoksyliną jest stosowane jako przeciwbarwienie jądrowe (ryc. 2).
  5. Zmierz procent obszaru z dodatnimi sygnałami AMG w każdym obrazie histologicznym za pomocą narzędzia progowego (Obraz | Dostosuj | Próg).
  6. Ręcznie dostosuj wartość odcięcia progu dla każdego obrazu histologicznego (od 90 do 110) w oparciu o obecność obszarów fałszywie dodatnich w jądrach i/lub krwinkach czerwonych.
    Uwaga: W ustawieniach domyślnych dodatnie sygnały AMG powinny być podświetlone na czerwono.
  7. Naciśnij przycisk Analizuj | Ustaw Pomiary i zaznacz pole wyboru Ułamek powierzchni, aby określić, że rejestrowany jest ułamek powierzchni.
  8. Naciśnij przycisk Analizuj | Miara. Dodatni obszar procentowy każdego obrazu histologicznego jest wyświetlany w kolumnie %Area okna Wynik.
  9. Uśrednić dodatnie obszary procentowe z 10 obrazów histologicznych z każdego odcinka tkanki i zdefiniować wynik jako dodatnią wartość AMG dla każdego odcinka tkanki.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Obecność jądrowych sygnałów fałszywie dodatnich w różnych kanałach kolorystycznych (barwienie przeciwstawne: barwienie hematoksyliną). Reprezentatywne jądrowe sygnały fałszywie dodatnie są oznaczone żółtymi strzałkami. PPA = dodatni odsetek obszarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Opracowanie testu histologicznego Ag dla waleni (CHAA) za pomocą modelu regresji

Uwaga: Poniższa analiza jest wykonywana w Prism 6.01 dla Windows.

  1. Oceń korelację między wynikami dodatnich wartości ICP-MS i AMG.
  2. Otwórz oprogramowanie, utwórz nowy plik projektu i wybierz XY i Korelacja.
  3. Dane wejściowe, w tym wyniki dodatnich wartości ICP-MS i AMG.
  4. Naciśnij Analiza i wybierz Korelacja w kategorii Analiza XY, aby przeanalizować siłę związku między wynikami dodatnich wartości ICP-MS i AMG za pomocą analizy korelacji Pearsona.
    Uwaga: Wyniki dodatnich wartości ICP-MS i AMG muszą być ze sobą dodatnio skorelowane; W przeciwnym razie nie należy opracowywać kolejnego modelu regresji.
  5. Statystyczne porównanie modeli regresji, w tym regresji liniowej, regresji kwadratowej, regresji sześciennej i regresji liniowej przez początek, za pomocą oprogramowania statystycznego12,26,27.
    Uwaga: Jeśli model regresji generuje nierealistyczne stężenie Ag, model regresji powinien zostać porzucony12.
  6. Wróć do tabeli danych (lewy panel) i naciśnij Analiza | Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) w kategorii Analiza XY | Dobrze.
  7. W oknie Parametry: Regresja nieliniowa wybierz inny model regresji na stronie Dopasuj, a następnie porównaj różne modele regresji na stronie Porównaj.
  8. Na stronie Porównanie wybierz metody porównania, w tym dodatkowy test sumy kwadratów F i kryterium informacyjne Akaike (AIC). Zgodnie z wynikami metod porównawczych, należy zastosować stosunkowo odpowiedni model regresji w CHAA.
  9. Oszacować stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanych stężeniach Ag za pomocą CHAA.
  10. Oceń dokładność i precyzję CHAA dla tkanek wątroby i nerek. Różnicę między precyzją a dokładnością zilustrowano na rysunku 3.
  11. Dokładność: Oblicz średnie odchylenie standardowe (SD) na podstawie różnic między znanymi i szacowanymi stężeniami Ag.
  12. Precyzja: Wykonać powtórny pomiar (co najmniej trzykrotnie) dodatnich wartości AMG seryjnych odcinków z tych samych tkanek FFPE. Obliczyć średnią SD z pomiarów w tkankach wątroby lub nerek na podstawie różnic między znanymi i szacowanymi stężeniami Ag
    Uwaga: Metody oceny dokładności i precyzji przedstawiono na rysunku 4.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Różnica między dokładnością a precyzją. Dokładność oznacza, jak bardzo pomiar jest bliski wartości rzeczywistej (tj. stężenia Ag określonego przez ICP-MS); precyzja oznacza powtarzalność pomiaru (tj. spójność między powtarzanymi pomiarami dodatnich wartości AMG z potrójnych odcinków tkanki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Schemat przedstawiający metody oceny dokładności i precyzji. CHAA = histologiczny test Ag u waleni; FFPE = Utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie; ICP-MS = spektroskopia mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie; Ai = każde ze stężeń Ag określonych przez ICP-MS dla każdej próbki tkanki dopasowanej parą; Bi = każde ze stężeń Ag oszacowanych za pomocą CHAA w każdej próbce tkanki dopasowanej do pary; Ci, Di i Ei = każde ze stężeń Ag oszacowanych za pomocą CHAA trzech próbek z każdej próbki tkanki dopasowanej do pary; i = 1 do n. Prosimy o zapoznanie się z surowymi danymi dotyczącymi testów dokładności i precyzji w sekcji reprezentatywnych wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Szacowanie stężeń Ag przez CHAA.

  1. Zbierz tkanki wątroby i nerek od wyrzuconych na brzeg waleni i utrwal je w 10% neutralnej buforowanej formalinie.
  2. Rutynowo przetwarzaj tkanki utrwalone w formalinie (patrz krok 2).
  3. Oszacować stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanych stężeniach Ag za pomocą CHAA (patrz kroki 3 i 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne obrazy pozytywnych sygnałów AMG w tkankach wątroby i nerek waleni są pokazane w Rysunek 5. Sygnały dodatnie AMG obejmują różnej wielkości brązowe lub czarne granulki o różnych rozmiarach w cytoplazmie bliższego nabłonka kanalików nerkowych, hepatocytów i komórek Kupffera. Czasami w świetle i błonie podstawnej niektórych proksymalnych kanalików nerkowych obserwuje się amorficzne, złotożółte do brązowych sygnały dodatnie AMG. Istnieje dodatnia k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem pracy w artykule jest opracowanie metody adiuwantowej do oceny rozmieszczenia Ag na poziomie podnarządowym oraz oszacowanie stężeń Ag w tkankach waleni. Obecne protokoły obejmują: 1) Oznaczanie stężeń Ag w tkankach waleni za pomocą ICP-MS, 2) Analizę AMG próbek tkanek dopasowanych parami o znanych stężeniach Ag, 3) Ustanowienie modelu regresji (CHAA) do szacowania stężeń Ag za pomocą dodatnich wartości AMG, 4) Ocenę dokładności i precyzji CHAA oraz 5) Oszacowanie stężeń Ag za pomocą CHAA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Tajwańskiej Sieci Tkania Waleni za zbieranie i przechowywanie próbek, w tym Tajwańskiej Społeczności Waleni, Tajpej; Laboratorium Badań Waleni (Prof. Lien-Siang Chou), Instytutowi Ekologii i Biologii Ewolucyjnej, Narodowemu Uniwersytetowi Tajwańskiego, Tajpej; Narodowemu Muzeum Nauk Przyrodniczych (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; oraz Centrum Biologii Morskiej i Badań nad Waleniami, Narodowemu Uniwersytetowi Cheng-Kung. Dziękujemy również Biuru Leśnictwa, Radzie Rolnictwa, Executive Yuan za ich pozwolenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HQ Srebrny zestaw wzmacniającyNanosondy#2012
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Parafina
100% etanolMuto Pure Chemical Co., Ltd4026
Non-XyleneMuto Pure Chemical Co., Ltd4328
Prowadnica pokryta silanemMuto Pure Chemical Co., Ltd511614
Szkło nakrywkowe (25 x 50 mm)Muto Pure Chemical Co., Ltd24501
MalinolMuto Pure Chemical Co., Ltd20092
GM Barwienie hematoksylinąMuto Pure Chemical Co., Ltd3008-1
10% neutralny buforowany roztwór formalinyChin I Pao Co., Ltd---
Tip (1000 μ L)MDBio, Inc.1000
PIPETMAN Klasyczny P1000Gilson, Inc.
15 ml probówka wirówkowaGeneDireX, Inc.PC115-0500
Wątroba koleniaNarodowa Rada ds. Badań Naukowych KanadyDOLT-2
Mięsień koleniaKrajowa Rada ds. Badań Naukowych KanadyDORM-2
Spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)PerkinElmer Inc.PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6-litrowy system liofilizacjiLabconco7752030Do liofilizacji
MARKA® Kolba miarowa SILBERBRANDMerckZ326283
30 ml fiolka standardowa, płaskie wnętrze z zamknięciem 33 mmSavillex Corporation200-030-12Do diagestii
Kwas azotowy, superpur®, 65.0%Merck1.00441Do diagestii
Gorąca płyta/mieszadłaCorning®PC-220Do diagestii
Mieszalnik laboratoryjny o wysokim ścinaniuSilversonSL2TDo homogenizacji
Sterylny słoik na próbki polipropylenowe (250 ml)Thermo Scientific™6186L05Do homogenizacji
Aparat cyfrowyNikon CorporationDS-Fi2
Mikroskop świetlnyNikon CorporationECLIPSE Ni-U
Shandon™ Fizyna i handel; 325 ręczny mikrotomThermo Scientific™
Akumulator Cut® SRM i handel; 200 mikrotom obrotowySakura1429
Ostrze mikrotomu S35FEATHER®207500000
Naczynie do barwienia szkiełek i pokrywaLaboratoria Badań Mózgu#3215
Stalowy stojak do barwieniaLaboratoria Badań Mózgu#3003
Centrum zatapiania ShandonThermo Scientific™S-EC
Shandon Cytadela & reg; przetwórca tkanekThermo Scientific™
Podgrzewacz do slajdówLab-Line Instruments26005
Łaźnia wodnaShandon Capshaw3964
Bibuła filtracyjnaMerck1541-070
Prism 6.01 dla systemu WindowsOprogramowanieOprogramowanie statystyczne
ImageJNational Institutes of Health
Stal nierdzewna forma do zatapiania tkanekShenyang Roundfin Trade Co., LtdRD-TBM003Do emeddingu parafiny
F123602A78100001H69800003 GraphPad

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
  2. Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
  3. Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
  4. Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
  5. Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
  6. Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
  7. Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
  8. Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
  9. Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
  10. Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
  11. Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
  12. Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
  13. Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
  14. Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
  15. Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
  16. Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
  17. Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
  18. Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
  19. Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
  20. Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
  21. Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
  22. Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92(2013).
  23. Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46(2016).
  24. Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
  25. Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
  26. Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
  27. Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6(2010).
  28. Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
  29. Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
  30. Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
  31. Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz steczki srebralokalizacja metali ci kichilo ciowa analiza obrazuutrwalenie w formalinie i zatopienie w parafiniespektrometria mas z plazm sprz on indukcyjniehistologiczne badanie srebraprocesowanie tkanekmikroskopia wietlna

Powiązane artykuły