Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58232

⸱

4 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Molecular and Comparative Pathobiology, National Taiwan University, 2School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 3Department of Oceanography and Asia-Pacific Ocean Research Center, National Sun Yat-sen University, 4Graduate Institute of Veterinary Pathobiology, National Chung Hsing University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół lokalizacji Ag w tkankach wątroby i nerek waleni za pomocą autometalografii. Ponadto opracowano nowy test, nazwany histologicznym testem Ag waleni (CHAA) w celu oszacowania stężeń Ag w tych tkankach.

Streszczenie

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach ochrony zdrowia, ze względu na ich silne działanie przeciwbakteryjne. Mogą one również być uwalniane do środowiska i gromadzić się w oceanie. W związku z tym AgNPs są głównym źródłem zanieczyszczenia AgNP, a świadomość społeczna na temat toksyczności Ag dla środowiska rośnie. Wcześniejsze badania wykazały bioakumulację (u producentów) i powiększenie (u konsumentów/drapieżników) Ag., jako szczytowe drapieżniki oceanu, mogły być pod negatywnym wpływem związków Ag/Ag. Chociaż stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni można mierzyć za pomocą spektroskopii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), zastosowanie ICP-MS jest ograniczone ze względu na wysoki koszt kapitałowy i wymóg przechowywania/przygotowania tkanek. Dlatego metoda autometalografii (AMG) z obrazową analizą ilościową przy użyciu tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE) może być metodą adiuwantową do lokalizacji dystrybucji Ag na poziomie podnarządowym i oszacowania stężenia Ag w tkankach waleni. Sygnały dodatnie AMG to głównie brązowe do czarnych granulki o różnych rozmiarach w cytoplazmie bliższego nabłonka kanalików nerkowych, hepatocytów i komórek Kupffera. Czasami w świetle i błonie podstawnej niektórych bliższych kanalików nerkowych obserwuje się amorficzne złotożółte do brązowych sygnały dodatnie AMG. Test do szacowania stężenia Ag nosi nazwę Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), który jest modelem regresji ustalonym na podstawie danych z obrazowej analizy ilościowej metody AMG i ICP-MS. Wykorzystanie AMG z CHAA do lokalizacji i półkwantyfikacji metali ciężkich stanowi wygodną metodologię dla badań czasoprzestrzennych i międzygatunkowych.

Wprowadzenie

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach pielęgnacyjnych, ze względu na ich silne działanie przeciwdrobnoustrojowe1,2. W związku z tym produkcja AgNPs oraz liczba produktów zawierających AgNPs zwiększają się w czasie3,4. Jednakże AgNPs mogą przedostawać się do środowiska i gromadzić się w oceanach5,6. Stały się one głównym źródłem zanieczyszczenia srebrem, a świadomość publiczna na temat toksyczności środowiskowej Ag rośnie.

Status AgNPs oraz Ag w środowisku morskim jest złożony i nieustannie się zmienia. Poprzednie badania wskazały, że AgNPs mogą pozostawać w formie cząstek, agregować, rozpuszczać się, reagować z różnymi gatunkami chemicznymi lub być regenerowane z jonów Ag+7,8. W osadach morskich znaleziono kilka rodzajów związków Ag, takich jak AgCl, które mogą być pochłaniane przez organizmy bentosowe i wnikać do łańcucha pokarmowego9,10. Zgodnie z poprzednim badaniem przeprowadzonym w obszarze laguny Chi-ku wzdłuż południowo-zachodniego wybrzeża Tajwanu, stężenia Ag w osadach morskich są niezwykle niskie i zbliżone do obfitości skorupowej, a stężenia w tkance wątroby ryb zazwyczaj znajdują się poniżej granicy wykrywalności (< 0,025 μg/g masa mokra/masa mokra)1. Jednakże badania przeprowadzone w różnych krajach wykazały stosunkowo wysokie stężenia Ag w wątrbach waleni12,13. Stężenie Ag w wątrbach waleni jest zależne od wieku, co sugeruje, że źródłem Ag w ich organizmach są najprawdopodobniej ich ofiary12. Wyniki te dodatkowo sugerują biomagnifikację Ag u zwierząt na wyższych poziomach troficznych. Walenie, jako drapieżniki szczytowe w oceanach, mogły doznać negatywnych skutków zdrowotnych spowodowanych przez Ag/związki Ag12,13,14. Co najważniejsze, podobnie jak walenie, ludzie są ssakami, a negatywne skutki zdrowotne wywołane przez Ag/związki Ag u waleni mogą wystąpić również u ludzi. Innymi słowy, walenie mogłyby pełnić rolę zwierząt wskaźnikowych dla zdrowia środowiska morskiego i ludzi. Dlatego też efekty zdrowotne, dystrybucja tkankowa i stężenie Ag u waleni budzą duże zainteresowanie.

Choć stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni można zmierzyć za pomocą spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS), zastosowanie ICP-MS jest ograniczone przez wysokie koszty kapitałowe (instrumentu i konserwacji) oraz wymagania dotyczące przechowywania i przygotowania tkanek12,15. Ponadto w przypadku wszystkich dochodzeń dotyczących wyrzuconych na brzeg waleni zazwyczaj trudno jest zebrać kompleksowe próbki tkanek ze względu na trudności logistyczne, brak personelu oraz niedobór odpowiednich zasobów12. Zamrożone próbki tkanek do analizy ICP-MS nie są łatwe do przechowywania z powodu ograniczonej przestrzeni w chłodniach, a próbki te mogą zostać utracone w wyniku awarii sprzętu chłodniczego12. Wspomniane przeszkody utrudniają badanie poziomu zanieczyszczeń w tkankach waleni metodą ICP-MS z wykorzystaniem zamrożonych próbek tkanek. W przeciwieństwie do nich, próbki tkanek utrwalone w formalinie są stosunkowo łatwe do pobrania podczas nekropsji martwych waleni wyrzuconych na brzeg. W związku z tym konieczne jest opracowanie łatwej w użyciu i niedrogiej metody wykrywania i pomiaru metali ciężkich w tkankach waleni z wykorzystaniem próbek utrwalonych w formalinie.

Chociaż rozkłady w obrębie narządów oraz stężenia metali alkalicznych i alkalicznych ziem mogą ulec zmianie podczas procesu utrwalania w formalinie i zatapiania w parafinie (FFPE), odnotowano jedynie niewielkie efekty w przypadku metali przejściowych, takich jak Ag16. W związku z tym tkanka FFPE jest uważana za idealny materiał do lokalizacji i pomiaru metali16,17. Autometalografia (AMG), proces histochemiczny, pozwala na uwidocznienie metali ciężkich w postaci sygnałów AMG-dodatnich o różnej wielkości i barwie od złocistożółtej do czarnej w przekrojach tkanek FFPE, a te wzmocnione sygnały metali ciężkich można wizualizować pod mikroskopem świetlnym18,19,20,21. Zatem metoda AMG dostarcza informacji o rozkładzie metali ciężkich w obrębie narządów. Może ona dostarczyć istotnych dodatkowych informacji do badania szlaków metabolicznych metali ciężkich w systemach biologicznych, ponieważ ICP-MS pozwala na pomiar stężenia metali ciężkich jedynie na poziomie całego narządu18. Ponadto oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu, takie jak ImageJ, jest stosowane do ilościowej analizy histologicznych przekrojów tkanek2,23. Złocistożółte do czarnych sygnały AMG-dodatnie o różnej wielkości w przekrojach tkanek FFPE mogą zostać poddane kwantyfikacji i wykorzystane do szacowania stężeń metali ciężkich. Chociaż absolutne stężenie Ag nie może być bezpośrednio wyznaczone metodą AMG z analizą ilościową obrazu, można je oszacować za pomocą modelu regresji opartego na danych uzyskanych z ilościowej analizy obrazu oraz ICP-MS, co nazwano histologicznym oznaczeniem Ag u waleni (CHAA). Biorąc pod uwagę trudności w pomiarze stężeń Ag za pomocą analizy ICP-MS u większości wyrzuconych na brzeg waleni, CHAA jest wartościową metodą pomocniczą do szacowania stężeń Ag w tkankach waleni, których nie można oznaczyć metodą ICP-MS ze względu na brak zamrożonych próbek tkanek. Niniejsza publikacja opisuje protokół techniki histochemicznej (metody AMG) służącej do lokalizacji Ag na poziomie podorganowym oraz procedurę o nazwie CHAA do szacowania stężeń Ag w tkankach wątroby i nerek waleni.

Proces analizy tkanek waleni; model regresji; stężenie Ag; wyniki ICP-MS; oprogramowanie ImageJ.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający opracowanie i zastosowanie histologicznego testu Ag dla waleni (CHAA) w celu szacowania stężeń Ag. CHAA = test histologiczny przeciwciał dla waleni, FFPE = utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, ICP-MS = spektrometria mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, a wykorzystanie próbek tkanek waleni zostało zezwolone przez Radę Rolnictwa Tajwanu (pozwolenie na badania 104-07.1-SB-62).

1. Przygotowanie próbek tkanek do analizy ICP-MS

Uwaga: Tkanki wątroby i nerek pobrano od świeżo martwych i umiarkowanie autolizowanych wyrzuconych na brzeg waleni24, w tym od 6 waleni należących do 4 różnych gatunków: 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Każdy osobnik posiadał numer polowy służący do indywidualnej identyfikacji. Przygotowanie próbek tkanek do analizy ICP-MS przeprowadzono zgodnie z metodą opracowaną w laboratorium M.H. Chen, a sama analiza ICP-MS została wykonana w tymże laboratorium1,13,25.

  1. Pobrać próbki tkanek wątroby i nerek od wyrzuconych na brzeg waleni do analizy ICP-MS i przechowywać je w temperaturze −20 °C do momentu użycia.
  2. Pobrać dopasowane pary tkanek wątroby i nerek od tych samych osobników do analizy AMG (patrz krok 2).
  3. Odciąć zewnętrzną warstwę próbek tkanek przeznaczonych do analizy ICP-MS za pomocą skalpela ze stali nierdzewnej. Wewnętrzną część próbek pociąć na małe kostki (około 1 cm3) i umieścić w plastikowych woreczkach strunowych. Zazwyczaj każdy woreczek zawiera 10 g tkanek.
  4. Przechowywać plastikowe woreczki z próbkami tkanek w temperaturze −20 °C do dalszych procedur.
  5. Umieścić próbki w postaci kostek o wymiarach 1 cm3 w systemie liofilizacji (-50 °C, pompa próżniowa o wydajności co najmniej 98 L/min, 0,02 mBar) na co najmniej 72 h, aż do całkowitego wysuszenia, potwierdzonego osiągnięciem stałej masy.
  6. Zhomogenizować wysuszone kostki do postaci proszku za pomocą homogenizatora w celu późniejszego trawienia tkanek.
  7. Odważyć 0,3 g zhomogenizowanych próbek liofilizowanych do butelek z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 30 mL i wymieszać z 10 mL 65% w/w kwasu azotowego.
  8. Zakręcić butelki PTFE, pozostawiając nakrętki lekko poluzowane.
    Uwaga: Pozwala to na wydzielenie brązowych oparów w butelkach PTFE i ich cofanie wewnątrz butelki podczas trawienia, aż opary znikną i roztwór stanie się klarowny.
  9. Podgrzewać trawione próbki na płycie grzejnej w butelkach PTFE, zwiększając temperaturę od 30 °C do 10/120 °C (zależnie od warunków powstawania brązowych oparów) przez 2 do 3 tygodni, aż brązowy gaz w butelkach PTFE stanie się bezbarwny, a ciecz w butelkach przybierze przezroczysty, zielonkawy, bladożółty kolor lub stanie się całkowicie przejrzysta.
    Uwaga: Proces grzania należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym.
  10. Podgrzewać trawione próbki w temperaturze 120 °C, aby odparować kwas azotowy w butelkach PTFE, aż pozostanie jedynie 0,5-1 mL cieczy.
    Uwaga: Proces grzania należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, stale monitorując wzrost temperatury, aby upewnić się, że z nakrętek butelek PTFE nie wycieka brązowy gaz.
  11. Dokręcić nakrętki i schłodzić próbki w temperaturze pokojowej przez około 1 h.
  12. Umieścić lejki z papierami filtracyjnymi na kolbach miarowych o pojemności 25 mL i przepłukać pozostałą ciecz 1 M HNO3 do uzyskania końcowej objętości 25 mL.
    Uwaga: Butelkę należy przepłukać co najmniej trzy razy, a nakrętkę dwa razy.
  13. Zwalidować jakość analityczną analizy ICP-MS, wykorzystując certyfikowane materiały odniesienia, w tym DOLT-2 (wątroba rekina) i DORM-2 (mięśnie rekina).
  14. Do analizy ICP-MS wykorzystać duplikaty każdej próbki analitycznej oraz triplikaty materiałów odniesienia.
  15. Obliczyć średnie stężenia Ag dla każdej próbki analitycznej i przedstawić dane jako stężenie w przeliczeniu na masę suchą (μg/g masy suchej).

2. Przygotowanie próbek tkanek do analizy AMG

  1. Pobrać od osiadłego walenia dopasowane pary tkanek wątroby i nerek do analizy AMG i utrwalić je w 10% neutralnym buforowanym formalinie do czasu użycia.
    Uwaga: Próbki tkanek należy przechowywać w plastikowych butelkach w 10% neutralnym buforowanym formalinie (NBF, pH 7,0) przez 24 do 48 godzin. Objętość NBF powinna być co najmniej 10 razy większa niż objętość tkanki.
  2. Przyciąć utrwalone w formalinie tkanki wątroby i nerek za pomocą jednorazowych stalowych ostrzy mikrotomicznych i umieścić przycięte fragmenty tkanek w opisanych kasetkach.
    Uwaga: Rozmiar każdego fragmentu tkanki powinien wynosić około 2 cm x 1 cm, a grubość każdego fragmentu nie powinna przekraczać 3 mm. Tkanki wątroby i nerek od tego samego osobnika należy umieścić w jednej kasetce.
  3. Odwodnić przycięte fragmenty tkanek w procesorze tkanek poprzez serię roztworów etanolu o różnym stężeniu (70% przez 1 h, 80% przez 1 h, 95% przez 1 h, 95% przez 2 h, 10% przez 1 h w 2 różnych naczyniach do barwienia oraz 100% przez 2 h), zamienniku ksylenu (przez 1 h i 2 h w różnych naczyniach do barwienia), a następnie zanurzyć odwodnione próbki tkanek w parafinie (przez 1 h i 2 h w różnych naczyniach do barwienia).
  4. Umieścić odwodnione próbki tkanek na dnie stalowych form histologicznych i zalać je parafiną.
  5. Schłodzić bloki tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) na blacie chłodzącym, aż parafina stwardnieje. Przyciąć bloki FFPE za pomocą mikrotomu, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta.
  6. Schłodzić bloki FFPE w temperaturze −20 °C przez 10 min. Wykonać seryjne cięcia bloków FFPE o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu.
  7. Napełnić kąpiel wodną wodą dwukrotnie destylowaną o temperaturze 45 °C. Podnieść taśmy z przekrojami tkanek i ułożyć je na powierzchni ciepłej wody za pomocą pęset i pędzli.
  8. Rozdzielić taśmy z przekrojami tkanek pęsetą. Umieścić przekrój na szkiełku mikroskopowym.
  9. Umieścić szkiełka mikroskopowe w suszarce do szkiełek i pozostawić przekroje do wyschnięcia przez noc w temperaturze 37 °C.
  10. Umieścić szkiełka mikroskopowe w koszykach i odparafinizować, zanurzając je w 3 różnych naczyniach do barwienia z czystym zamiennikiem ksylenu (około 20 do 250 mL) przez odpowiednio 8, 5 i 3 min.
  11. Nawodnić przekroje tkanek w koszykach, zanurzając je w różnych naczyniach do barwienia z roztworami etanolu o różnym stężeniu (dwukrotnie w 10% etanolu, raz w 90% etanolu i raz w 80% etanolu [po 1 min każde]), a następnie opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej.
    Uwaga: Roztwory te mają objętość około 20 do 250 mL w różnych naczyniach do barwienia. Dla każdego przemycia wystarczy 30 s.
  12. Opłukać przekroje tkanek w buforze fosforanowym (PBS) z 0,5% Triton X-10, kilkakrotnie przemyć w PBS, a następnie opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej.
    Uwaga: Roztwory te mają objętość około 20 do 250 mL w różnych naczyniach do barwienia. Dla każdego przemycia wystarczy 30 s.
  13. Przygotować w ciemności równe ilości trzech komponentów (inicjatora, moderatora i aktywatora) dostarczonych w zestawie do wzmacniania srebrem i dokładnie je wymieszać.
    Uwaga: Roztwory moderatora i aktywatora są lepkie, dlatego należy używać pipet z szerokimi końcówkami (lub odciąć końcówki, aby stworzyć szersze otwory). Dla każdego szkiełka zazwyczaj wystarcza 30 μL zmieszanego roztworu (w zależności od wielkości przekroju tkanki). Zatem przy użyciu 10 szkiełek ilość każdego komponentu (inicjatora, moderatora i aktywatora) wynosi 100 μL (całkowita objętość zmieszanego roztworu dla 10 szkiełek to 30 μL).
  14. Inkubować przekroje tkanek w zmieszanym roztworze przez 15 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Całkowicie pokryć przekroje tkanek na szkiełkach zmieszanym roztworem. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do fałszywie dodatnich sygnałów AMG.
  15. Przemyć szkiełka wodą dwukrotnie destylowaną i wybarwić hematoksyliną przez 10 s jako barwienie kontrastowe.
  16. Przemyć szkiełka bieżącą wodą z kranu, wysuszyć i zamontować za pomocą medium montażowego.
  17. Zbadać szkiełka pod mikroskopem świetlnym.
  18. Losowo przechwycić dziesięć obrazów histologicznych z każdego przekroju tkanki przy użyciu obiektywu 40X, wykorzystując podłączoną kamerę cyfrową z oprogramowaniem do analizy obrazu.

3. Analiza półilościowa obrazów histologicznych w celu wyznaczenia dodatnich wartości AMG

Uwaga: Wartość dodatnia AMG oznacza procent powierzchni z sygnałami dodatnimi dla AMG.

  1. Do analizy obrazów histologicznych należy wykorzystać oprogramowanie do analizy obrazu (ImageJ).
  2. Otwórz obraz histologiczny, wybierając File | Open.
  3. Rozdziel wybrany obraz na trzy kanały kolorystyczne (czerwony, niebieski i zielony), wybierając Image | Type | RGB Stack.
  4. Ilościowo określ sygnały pozytywne dla AMG, korzystając z kanału niebieskiego. Sygnały fałszywie dodatnie w jądrach są zazwyczaj zredukowane w kanale niebieskim, gdy do kontrastowania jąder zastosowano barwienie hematoksyliną (Rycina 2).
  5. Zmierz procent powierzchni z sygnałami pozytywnymi dla AMG na każdym obrazie histologicznym za pomocą narzędzia progowania (Image | Adjust | Threshold).
  6. Ręcznie dostosuj wartość odcięcia progu dla każdego obrazu histologicznego (od 90 do 10) w zależności od obecności obszarów fałszywie dodatnich w jądrach i/lub erytrocytach.
    Uwaga: W ustawieniach domyślnych sygnały pozytywne dla AMG powinny być podświetlone na czerwono.
  7. Wybierz Analyze | Set Measurements i zaznacz pole Area Fraction, aby określić, że rejestrowana ma być frakcja powierzchni.
  8. Wybierz Analyze | Measure. Procentowy obszar pozytywny każdego obrazu histologicznego zostanie wyświetlony w kolumnie %Area w oknie Result.
  9. Oblicz średnią procentową powierzchnię pozytywną z 10 obrazów histologicznych dla każdego przekroju tkanki i przyjmij ten wynik jako wartość pozytywną dla AMG dla każdego przekroju tkanki.

Obraz mikroskopowy, podział kanałów kolorów; niebieski PPA 6,32, zielony 8,05, czerwony 6,76; schemat analizy komórek.
Rycina 2: Obecność fałszywie dodatnich sygnałów jądrowych w różnych kanałach kolorystycznych (kontrastowe barwienie: hematoksylina). Reprezentatywne fałszywie dodatnie sygnały jądrowe zaznaczono żółtymi strzałkami. PPA = procent dodatnich obszarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Ustanowienie histologicznego testu przeciwciał dla waleni (CHAA) za pomocą modelu regresji

Uwaga: Poniższa analiza została przeprowadzona w programie Prism 6.01 dla systemu Windows.

  1. Oceń korelację pomiędzy wynikami ICP-MS a wartościami dodatnimi AMG.
  2. Otwórz oprogramowanie, utwórz nowy plik projektu i wybierz XY oraz Korelacja (Correlation).
  3. Wprowadź dane, w tym wyniki ICP-MS oraz wartości dodatnie AMG.
  4. Naciśnij Analiza (Analysis) i wybierz Korelacja (Correlation) w kategorii Analiza XY (XY Analysis), aby przeanalizować siłę powiązania między wynikami ICP-MS a wartościami dodatnimi AMG za pomocą analizy korelacji Pearsona.
    Uwaga: Wyniki ICP-MS i wartości dodatnie AMG muszą być ze sobą dodatnio skorelowane; w przeciwnym razie nie należy opracowywać kolejnego modelu regresji.
  5. Statystycznie porównaj modele regresji, w tym regresję liniową, kwadratową, sześcianową oraz regresję liniową przechodzącą przez początek układu współrzędnych, korzystając z oprogramowania statystycznego12,26,27.
    Uwaga: Jeśli model regresji generuje nierealistyczne stężenie Ag, należy go odrzucić12.
  6. Wróć do tabeli danych (lewy panel) i wybierz Analiza (Analysis) | Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) (Nonlinear regression (curve fit)) w kategorii Analiza XY (XY Analysis) | OK.
  7. W oknie Parametry: Regresja nieliniowa (Parameters: Nonlinear regression) wybierz odpowiedni model regresji na stronie Dopasowanie (Fit), a następnie porównaj różne modele regresji na stronie Porównaj (Compare).
  8. Na stronie Porównaj (Compare) wybierz metody porównawcze, w tym test F dla nadmiarowej sumy kwadratów oraz kryterium informacyjne Akaike (AIC). Na podstawie wyników metod porównawczych zastosuj stosowny model regresji w metodzie CHAA.
  9. Oszacuj stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanym stężeniu Ag, korzystając z metody CHAA.
  10. Oceń dokładność i precyzję metody CHAA dla tkanek wątroby i nerek. Różnica między precyzją a dokładnością została przedstawiona na Rysunku 3.
  11. Dokładność: Oblicz średnie odchylenie standardowe (SD) z różnic pomiędzy znanymi a oszacowanymi stężeniami Ag.
  12. Precyzja: Przeprowadź pomiary wielokrotne (co najmniej w trzech powtórzeniach) wartości dodatnich AMG dla seryjnych skrawków z tych samych tkanek FFPE. Oblicz średnie SD pomiarów z tkanek wątroby lub nerek z różnic pomiędzy znanymi a oszacowanymi stężeniami Ag.
    Uwaga: Metody oceny dokładności i precyzji przedstawiono na Rysunku 4.

Schemat koncepcyjny precyzji i dokładności; wykresy tarcz ilustrujące dane precyzyjne i nieprecyzyjne oraz dokładne i niedokładne.
Rycina 3: Różnica między dokładnością a precyzją. Dokładność określa, jak blisko wartości rzeczywistej znajduje się pomiar (t. j. stężenie Ag oznaczone metodą ICP-MS); precyzja oznacza powtarzalność pomiaru (t. j. spójność powtarzalnych pomiarów dodatnich wartości AMG z trzech powtórzeń próbek tkanek). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres stężenia Ag w próbkach tkanek; metoda ICP-MS i CHAA; wzory na dokładność i precyzję.
Rysunek 4: Schemat przedstawiający metody oceny dokładności i precyzji. CHAA = analiz biologicznych Ag u waleni; FFPE = utrwalone formaliną i zatopione w parafinie; ICP-MS = spektrometria mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej; Ai = każda z wartości stężeń Ag wyznaczonych metodą ICP-MS dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; Bi = każda z wartości stężeń Ag oszacowanych metodą CHAA dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; Ci, Di i Ei = każda z wartości stężeń Ag oszacowanych metodą CHAA dla próbek wykonanych w trzech powtórzeniach dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; i = od 1 do n. Surowe dane z testów dokładności i precyzji znajdują się w sekcji wyników reprezentatywnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Oznaczanie stężenia Ag metodą CHAA.

  1. Pobrać tkankę wątroby i nerek od wyrzuconych na brzeg waleni i utrwalić je w 10% neutralnym buforowanym formalinie.
  2. Przetworzyć utrwalone w formalinie tkanki w sposób rutynowy (patrz krok 2).
  3. Oszacować stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanym stężeniu Ag za pomocą CHAA (patrz kroki 3 i 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy sygnałów dodatnich AMG w tkankach wątroby i nerek waleni przedstawiono na Rysunku 5. Sygnały dodatnie AMG obejmują brązowe lub czarne ziarnistości o różnej wielkości w cytoplazmie nabłonka cewien proximalnych nerek, hepatocytów i komórek Kupffera. Sporadycznie w świetle i błonie podstawnej niektórych cewek proximalnych nerek odnotowano amorficzne, złotożółte lub brązowe sygnały dodatnie AMG. Występuje dodatnia korelacja między wynikami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem pracy w artykule jest opracowanie metody adiuwantowej do oceny rozmieszczenia Ag na poziomie podnarządowym oraz oszacowanie stężeń Ag w tkankach waleni. Obecne protokoły obejmują: 1) Oznaczanie stężeń Ag w tkankach waleni za pomocą ICP-MS, 2) Analizę AMG próbek tkanek dopasowanych parami o znanych stężeniach Ag, 3) Ustanowienie modelu regresji (CHAA) do szacowania stężeń Ag za pomocą dodatnich wartości AMG, 4) Ocenę dokładności i precyzji CHAA oraz 5) Oszacowanie stężeń Ag za pomocą CHAA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Tajwańskiej Sieci Tkania Waleni za zbieranie i przechowywanie próbek, w tym Tajwańskiej Społeczności Waleni, Tajpej; Laboratorium Badań Waleni (Prof. Lien-Siang Chou), Instytutowi Ekologii i Biologii Ewolucyjnej, Narodowemu Uniwersytetowi Tajwańskiego, Tajpej; Narodowemu Muzeum Nauk Przyrodniczych (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; oraz Centrum Biologii Morskiej i Badań nad Waleniami, Narodowemu Uniwersytetowi Cheng-Kung. Dziękujemy również Biuru Leśnictwa, Radzie Rolnictwa, Executive Yuan za ich pozwolenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HQ Srebrny zestaw wzmacniającyNanosondy#2012
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Parafina
100% etanolMuto Pure Chemical Co., Ltd4026
Non-XyleneMuto Pure Chemical Co., Ltd4328
Prowadnica pokryta silanemMuto Pure Chemical Co., Ltd511614
Szkło nakrywkowe (25 x 50 mm)Muto Pure Chemical Co., Ltd24501
MalinolMuto Pure Chemical Co., Ltd20092
GM Barwienie hematoksylinąMuto Pure Chemical Co., Ltd3008-1
10% neutralny buforowany roztwór formalinyChin I Pao Co., Ltd---
Tip (1000 μ L)MDBio, Inc.1000
PIPETMAN Klasyczny P1000Gilson, Inc.
15 ml probówka wirówkowaGeneDireX, Inc.PC115-0500
Wątroba koleniaNarodowa Rada ds. Badań Naukowych KanadyDOLT-2
Mięsień koleniaKrajowa Rada ds. Badań Naukowych KanadyDORM-2
Spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)PerkinElmer Inc.PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6-litrowy system liofilizacjiLabconco7752030Do liofilizacji
MARKA® Kolba miarowa SILBERBRANDMerckZ326283
30 ml fiolka standardowa, płaskie wnętrze z zamknięciem 33 mmSavillex Corporation200-030-12Do diagestii
Kwas azotowy, superpur®, 65.0%Merck1.00441Do diagestii
Gorąca płyta/mieszadłaCorning®PC-220Do diagestii
Mieszalnik laboratoryjny o wysokim ścinaniuSilversonSL2TDo homogenizacji
Sterylny słoik na próbki polipropylenowe (250 ml)Thermo Scientific™6186L05Do homogenizacji
Aparat cyfrowyNikon CorporationDS-Fi2
Mikroskop świetlnyNikon CorporationECLIPSE Ni-U
Shandon™ Fizyna i handel; 325 ręczny mikrotomThermo Scientific™
Akumulator Cut® SRM i handel; 200 mikrotom obrotowySakura1429
Ostrze mikrotomu S35FEATHER®207500000
Naczynie do barwienia szkiełek i pokrywaLaboratoria Badań Mózgu#3215
Stalowy stojak do barwieniaLaboratoria Badań Mózgu#3003
Centrum zatapiania ShandonThermo Scientific™S-EC
Shandon Cytadela & reg; przetwórca tkanekThermo Scientific™
Podgrzewacz do slajdówLab-Line Instruments26005
Łaźnia wodnaShandon Capshaw3964
Bibuła filtracyjnaMerck1541-070
Prism 6.01 dla systemu WindowsOprogramowanieOprogramowanie statystyczne
ImageJNational Institutes of Health
Stal nierdzewna forma do zatapiania tkanekShenyang Roundfin Trade Co., LtdRD-TBM003Do emeddingu parafiny
F123602A78100001H69800003 GraphPad

Bibliografia

  1. McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
  2. Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
  3. Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
  4. Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
  5. Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
  6. Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
  7. Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
  8. Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
  9. Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
  10. Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
  11. Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
  12. Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
  13. Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
  14. Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
  15. Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
  16. Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
  17. Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
  18. Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
  19. Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
  20. Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
  21. Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
  22. Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92(2013).
  23. Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46(2016).
  24. Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
  25. Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
  26. Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
  27. Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6(2010).
  28. Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
  29. Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
  30. Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
  31. Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanocz steczki srebralokalizacja metali ci kichilo ciowa analiza obrazuutrwalenie w formalinie i zatopienie w parafiniespektrometria mas z plazm sprz on indukcyjniehistologiczne badanie srebraprocesowanie tkanekmikroskopia wietlna
Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.