Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem prezentowanej metody jest pokazanie, po raz pierwszy, przeszczepu nowonarodzonego thymi do przedniej komory oka izogenicznych dorosłych myszy w celu in vivo podłużnego monitorowania dynamiki tymocytów w czasie rzeczywistym w unaczynionym segmencie grasicy. Po przeszczepie laserowa mikroskopia skaningowa (LSM) przez rogówkę umożliwia nieinwazyjne wielokrotne obrazowanie in vivo na poziomie rozdzielczości komórkowej. Co ważne, podejście to dodaje do wcześniejszych modeli obrazowania dojrzewania limfocytów T przyżyciowych możliwość ciągłej rekrutacji komórek progenitorowych i rejestracji wyjścia dojrzałych komórek T u tego samego zwierzęcia. Dodatkowymi zaletami systemu są przezroczystość przeszczepionego obszaru, pozwalająca na makroskopowe szybkie monitorowanie wszczepionej tkanki oraz dostępność do implantu pozwalająca na miejscowe i dodatkowo ogólnoustrojowe leczenie. Głównym ograniczeniem jest objętość tkanki, która mieści się w zmniejszonej przestrzeni komory oka, co wymaga przycinania płata. Integralność narządów jest maksymalizowana poprzez preparowanie płatów grasicy we wzorcach, które wcześniej okazały się funkcjonalne dla produkcji dojrzałych komórek T. Technika ta jest potencjalnie odpowiednia do badania środowiska istotnych z medycznego punktu widzenia pytań związanych z funkcją grasicy, które obejmują autoimmunizację, niedobór odporności i tolerancję centralną; procesy, które pozostają mechanicznie słabo zdefiniowane. Dokładna analiza mechanizmów kierujących migracją, różnicowaniem i selekcją tymocytów powinna doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na rozwijające się limfocyty T.
Wprowadzenie
Wewnątrzgrasicze różnicowanie limfocytów T i selekcja subpopulacji komórek T stanowią kluczowe procesy dla rozwoju i utrzymania odporności komórkowej u kręgowców1. Proces ten obejmuje złożoną sekwencję ściśle zorganizowanych zdarzeń, w tym rekrutację komórek progenitorowych z krwiobiegu, proliferację i migrację komórek, różnicową ekspresję białek błonowych i masową zaprogramowaną śmierć komórki w celu selekcji podzbiorów. Rezultatem jest uwolnienie dojrzałych limfocytów T reagujących na szerokie spektrum obcych antygenów, wykazując jednocześnie zminimalizowane odpowiedzi na własne peptydy, które ostatecznie kolonizują obwodowe narządy limfatycz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Uniwersytetu w Miami zatwierdził wszystkie eksperymenty zgodnie z wytycznymi IACUC.
1. Izolacja i przycinanie noworodków
- Przygotuj wszystkie odczynniki i narzędzia w autoklawie lub innymi metodami, zapewniając sterylne warunki.
- Aby zminimalizować zanieczyszczenia, wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać pod kapturem z przepływem laminarnym.
- Przed eutanazją myszy dawców napełnij sterylne naczynie o średnicy 60 mm sterylnym, wstępnie schłodzonym 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4) i umieść ją na lodzie. Będzie on służył do....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
grasiczkę od noworodków myszy izolowano z myszy B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/Jas zgodnie z opisem w niniejszym protokole (kroki 1.1-1.9). U tych myszy transgenicznych promotor beta-aktyny kurczaka kieruje ekspresją wariantu czerwonego białka fluorescencyjnego DsRed. MST, pod wpływem wczesnego wzmacniacza cytomegalowirusa (CMV), ułatwia śledzenie implantów.
Aby zapobiec odrzuceniu tkanki, jako gospodarzy wybrano osobniki.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na znaczenie procesu dojrzewania limfocytów T dla indywidualnej kompetencjiimmunologicznej4 oraz przypuszczalny wpływ dynamiki komórek prekursorowych na dojrzałe limfocyty T wytwarzane przez grasicę 2,3, zainwestowano szeroko zakrojone wysiłki w celu opracowania alternatyw dla klasycznego podejścia opartego na migawkach tkanek stałych.
Chociaż wycinki tkanek i inne eksplantaty są wyraźnie lepsze w odt.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) i R21ES025673 (AC), oraz przez grant BEST/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Walencja, Hiszpania) (EO). Autorzy dziękują zespołowi SENT z Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Walencja, Hiszpania oraz Alberto Hernandezowi z Centro de Investigación Príncipe Felipe, Walencja, Hiszpania za pomoc w filmowaniu i montażu wideo.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Waporyzator izofluoranu z izofluoranem | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Luneta sekcyjna ze źródłem światła | Zeiss | Stemi 305 | |
| Kleszczyki do precyzyjnego wypreparowania | WPI | 500455 | |
| Średnie kleszczyki preparacyjne | WPI | 501252 | |
| Kleszczyki preparacyjne z zakrzywioną końcówką | WPI | 15917 | |
| Nożyczki Vannas | WPI | 503371 | |
| Nożyczki preparacyjne | WPI | 503243 | |
| Skalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm Igły 18G | BD | 304622 | |
| Jednorazowa pipeta transferowa | Thermofisher | 201C | |
| Poduszka grzewcza i lampa grzewcza | Kent Scientific Corp | Podczerwień | |
| Etanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterylne naczynie | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterylne 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterylne chusteczki | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Leki przeciwbólowe | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Roztwór soli fizjologicznej lub Viscotears | Novartis | N/A | |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica | MZ FLIII | |
| Adapter do trzymania głowicy | Narishige | SG-4N-S | |
| Maska przeciwgazowa | Narishige | GM-4_S | |
| Mikroskop konfokalny | Leica | TCS SP5 II | |
| Okap z przepływem laminarnym | Telstar | BIO IIA |
Bibliografia
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
