Artykuł metodologiczny

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

DOI:

10.3791/58239

⸱

25 sierpnia 2018

 , 
1Department of Biology, San Francisco State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach choroby przenoszone przez wektory pojawiły się ponownie i rozprzestrzeniły w zastraszającym tempie, powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność na całym świecie. W przypadku większości tych chorób brakuje skutecznych i powszechnie dostępnych szczepionek, co wymaga opracowania nowych strategii łagodzenia skutków choroby. W tym celu obiecująca metoda kontroli chorób polega na ukierunkowaniu na mikrobiom wektora, czyli społeczność drobnoustrojów zamieszkujących wektor. Mikrobiom wektorowy odgrywa kluczową rolę w dynamice patogenów, a manipulacje mikrobiomem doprowadziły do zmniejszenia liczebności wektorów lub transmisji patogenów w przypadku kilku chorób przenoszonych przez wektory. Jednak przełożenie tych odkryć na zastosowania w zakresie kontroli chorób wymaga dogłębnego zrozumienia ekologii mikroorganizmów wektorowych, historycznie ograniczonej przez niewystarczającą technologię w tej dziedzinie. Pojawienie się metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło szybkie, wysoce równoległe sekwencjonowanie różnych społeczności drobnoustrojów. Ukierunkowanie na wysoce konserwatywny gen 16S rRNA ułatwiło charakterystykę drobnoustrojów obecnych w wektorach w różnych warunkach ekologicznych i eksperymentalnych. Technika ta obejmuje amplifikację genu 16S rRNA, kodowanie kreskowe próbki za pomocą PCR, ładowanie próbek do komórki przepływowej w celu sekwencjonowania oraz podejścia bioinformatyczne w celu dopasowania danych sekwencyjnych do informacji filogenetycznej. Dzięki temu podejściu można zazwyczaj osiągnąć identyfikację na poziomie gatunku lub rodzaju dla dużej liczby powtórzeń, omijając w ten sposób wyzwania związane z niską wykrywalnością, rozdzielczością i wydajnością tradycyjnych technik hodowli, mikroskopii lub barwienia histologicznego. W związku z tym metoda ta doskonale nadaje się do charakteryzowania drobnoustrojów wektorowych w różnych warunkach, ale obecnie nie może dostarczyć informacji na temat funkcji drobnoustrojów, lokalizacji w wektorze lub odpowiedzi na leczenie antybiotykami. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie nowej generacji 16S jest potężną techniką pozwalającą lepiej zrozumieć tożsamość i rolę drobnoustrojów-wektorów w dynamice choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odrodzenie i rozprzestrzenianie się chorób przenoszonych przez wektory w ostatnich dziesięcioleciach stanowi poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia ludzi i dzikich zwierząt. Brakuje skutecznych szczepionek przeciwko większości tych chorób, a wysiłki w zakresie kontroli są utrudnione ze względu na złożoną biologiczną naturę wektorów i interakcji wektor-gospodarz. Zrozumienie roli interakcji mikrobiologicznych w obrębie wektora w przenoszeniu patogenów może pozwolić na opracowanie nowych strategii, które pozwolą obejść te wyzwania. W szczególności interakcje między komensalami mikrobiologicznymi związanymi z wektorami, symbiontami i patogenami, określanymi jako mikrobiom, mogą mieć ważne konsekwencje dla przenoszenia patogenów. Przytłaczające dowody potwierdzają to twierdzenie, z przykładami pokazującymi związek między mikrobiomem wektora a kompetencjami w zakresie chorób takich jak malaria, wirus Zika i borelioza1,2,3. Jednak przełożenie tych odkryć na strategie kontroli choroby wymaga znacznie bardziej szczegółowego zrozumienia struktury, funkcji i pochodzenia mikrobiomów wektorowych. Identyfikacja i charakterystyka zbiorowiska mikroorganizmów wektorowych w różnych warunkach ekologicznych i eksperymentalnych stanowi ważną drogę naprzód w tej dziedzinie.

Procedura identyfikacji mikrobiologicznych mieszkańców wektora patogenu jest tutaj zapewniona poprzez wykorzystanie zachodniego kleszcza czarnonogiego, Ixodes pacificus, gatunku wektora patogenu boreliozy Borrelia burgdorferi. Chociaż kleszcze są siedliskiem większej liczby rodzajów ludzkich patogenów niż jakiekolwiek inne stawonogi, stosunkowo niewiele wiadomo na temat biologii i ekologii mikrobiomów kleszczy 4. Oczywiste jest, że kleszcze są siedliskiem różnorodnej gamy wirusów, bakterii, grzybów i pierwotniaków, w tym komensali, endosymbiontów i przejściowych mieszkańców drobnoustrojów5,4. Wcześniejsze prace wykazały silne różnice w mikrobiomach Ixodes związane z geografią, gatunkiem, płcią, etapem życia i mączką z krwi source6,7,8. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tej zmienności pozostają nieznane i wymagają bardziej szczegółowych badań nad pochodzeniem i gromadzeniem się tych zbiorowisk drobnoustrojów. Kleszcze mogą przenosić drobnoustroje poprzez transmisję pionową, kontakt z żywicielami i pobieranie z otoczenia przez przetchlinki, usta i pory odbytu9. Zrozumienie czynników kształtujących początkowe tworzenie i rozwój mikrobiomu kleszczy, w szczególności względnego udziału transmisji pionowej i środowiskowej, jest ważne dla zrozumienia naturalnych wzorców i zmian w różnorodności mikrobiomu kleszczy oraz tego, jak te społeczności oddziałują na siebie podczas przenoszenia patogenów, z możliwymi zastosowaniami w zwalczaniu chorób lub wektorów.

Potężne techniki molekularne, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, obecnie istnieją do identyfikacji społeczności mikrobiologicznych i mogą być wykorzystane do scharakteryzowania mikrobiomów wektorowych w różnych warunkach środowiskowych lub eksperymentalnych. Przed pojawieniem się tych wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania identyfikacja drobnoustrojów opierała się głównie na mikroskopii i hodowli. Podczas gdy mikroskopia jest szybką i łatwą techniką, morfologiczne metody identyfikacji drobnoustrojów są z natury subiektywne i zgrubne oraz ograniczone niską czułością i detekcją10. Metody oparte na hodowlach są szeroko stosowane do identyfikacji drobnoustrojów i mogą być wykorzystywane do określania podatności drobnoustrojów na leczenie farmakologiczne 11. Jednak ta metoda ma również niską czułość, ponieważ oszacowano, że mniej niż 2% mikroorganizmów środowiskowych można hodować w warunkach laboratoryjnych12. Metody barwienia histologicznego zostały również wykorzystane do wykrywania i lokalizowania określonych drobnoustrojów w obrębie wektorów, umożliwienia badania rozmieszczenia różnych taksonów w obrębie kleszcza oraz badania hipotez dotyczących interakcji mikrobiologicznych. Jednak do wyboru odpowiednich barwników wymagana jest wcześniejsza wiedza na temat tożsamości drobnoustrojów, co sprawia, że podejście to nie nadaje się do charakterystyki i identyfikacji drobnoustrojów. Ponadto barwienie histologiczne jest bardzo czasochłonnym, pracochłonnym procesem i nie skaluje się dobrze w przypadku dużych rozmiarów próbek. Tradycyjne podejścia molekularne, takie jak sekwencjonowanie Sangera, są podobnie ograniczone pod względem czułości i wykrywania różnych społeczności drobnoustrojów.

Sekwencjonowanie nowej generacji pozwala na szybką identyfikację mikrobów z dużej liczby próbek. Obecność standardowych genów markerowych i referencyjnych baz danych dodatkowo umożliwia lepsze rozwiązanie taksonomiczne, często na poziomie rodzaju lub gatunku. Aby osiągnąć ten cel, często stosuje się małe podjednostkowe rybosomalne RNA, przy czym 16S rRNA jest najczęstsze ze względu na obecność konserwatywnych i zmiennych regionów w genie, co pozwala na tworzenie uniwersalnych starterów z unikalnymi amplikonami dla każdego gatunku bakterii13,14. Niniejszy raport szczegółowo opisuje procedurę identyfikacji taksonów w mikrobiomie kleszcza za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA nowej generacji. W szczególności protokół ten kładzie nacisk na etapy związane z przygotowaniem próbek do sekwencjonowania. Podano bardziej ogólne informacje na temat etapów sekwencjonowania i bioinformatyki, ponieważ obecnie dostępnych jest wiele platform sekwencjonowania i programów analitycznych, z których każda ma obszerną istniejącą dokumentację. Ogólna wykonalność tego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji została wykazana poprzez zastosowanie go do badania gromadzenia się społeczności drobnoustrojów w obrębie kluczowego wektora choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie kleszczy i sterylizacja powierzchni

  1. Zbieraj kleszcze, przeciągając białą szmatkę o powierzchni 1 m2 po siedlisku związanym z kleszczami, usuwając kleszcze przyczepione do gatunków żywicieli lub hodując kleszcze w lab15,16. Używaj cienkich kleszczy do manipulowania kleszczami i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
  2. Umieść kleszcze w poszczególnych probówkach do PCR i usuń zanieczyszczenia powierzchniowe, wirując przez 15 sekund kolejno za pomocą 500 μl nadtlenku wodoru (H2O2), 70% etanolu i ddH2O.
  3. Umieść kleszcze w nowej probówce do PCR i pozwól im wyschnąć na powietrzu.
  4. W tej probówce mechanicznie rozbij tkanki kleszcza, miażdżąc kleszcze moździerzem i tłuczkiem (użytym w tym badaniu), używając małych koralików w ubijaku do koralików lub przecinając kleszcza skalpelem.

2. Oczyszczanie DNA

  1. Oczyść DNA z pojedynczych kleszczy, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA. Eluta do uzyskania końcowej objętości 100 μL.
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z krokami 2.2-2.8. Alternatywne metody ekstrakcji obejmują ekstrakcję fenolowo-chloroformową17,18, wytrącanie etanolu19, lub ekstrakcja materiałem chelatującym20,21.
  2. Potwierdź pomyślne oczyszczenie DNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Do fluorometrii użyj 10 μl matrycy DNA w dwuniciowym teście DNA o objętości 190 μl. Oczekiwana wydajność wynosi 0,1-1,0 ng/μL22. Do spektrofotometrii należy użyć 1 μl matrycy DNA w ilościowym oznaczaniu kwasu nukleinowego. Oczekiwany stosunek A260/280 wynosi około 1,823.
  3. Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do amplifikacji, należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.

3. Amplifikacja genu 16S rRNA

  1. Ustawić amplikon PCR w reakcji 27,5 μl zawierającej: 5 μl każdego startera w 1 μM; 12,5 μl dostępnej w handlu mieszanki PCR; i 5 μl DNA wyekstrahowanego z pojedynczych kleszczy w stężeniu 5 ng/μl.
    UWAGA: Użyj następujących starterów do amplifikacji hiperzmiennego regionu V3-V4 genu 16S rRNA13:
    5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGGGCWGCAG-3',
    5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'
  2. Przenieść probówki do termocyklera zaprogramowanego na: początkową denaturację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 25 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 57 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 10 °C.
  3. Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma przy 460 pz, aby potwierdzić wzmocnienie.
    UWAGA: Produkt Amplicon PCR może nie być widoczny na żelu, jeśli stężenie próbki jest zbyt niskie (< 10 ng). Obecność dimerów starterów jest powszechna w próbkach o niskim stężeniu. Jeśli obecne są inne pasma niedocelowe, dostosuj temperaturę wyżarzania lub zmniejsz liczbę cykli.
  4. Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do oczyszczania, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.

4. Oczyszczanie amplikonu 16S

  1. Używając nowej probówki do PCR dla każdej próbki, połącz produkt PCR z ddH2O, aby uzyskać łącznie 60 μl. W przypadku próbek o niskich stężeniach DNA należy przeprowadzić amplikonową reakcję PCR w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć odchylenie amplifikacji i połączyć próbki w celu zagęszczenia.
  2. Doprowadź kulki paramagnetyczne do temperatury pokojowej i dobrze je zwiruj przed użyciem.
  3. Dodać 48 μl kulek paramagnetycznych do 60 μl próbki i inkubować przez 5 minut. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Usunąć supernatant.
    UWAGA: To stężenie kulek ma na celu usunięcie dimerów startera (< 60 pz). W razie potrzeby dostosuj stężenie ściegów, aby usunąć inne niespecyficzne pasma.
  4. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 500 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH. Natychmiast po dodaniu EtOH do wszystkich probówek odpipetować płyn. Nie usuwaj koralików. Powtórz dodawanie i usuwanie EtOH jeszcze raz.
  5. Wysuszyć próbki na powietrzu, aby usunąć nadmiar EtOH, pozostawiając otwarte probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut lub do momentu, gdy widoczne będą małe pęknięcia w kulkach.
  6. Dodać 20 μl buforu TE i inkubować próbki z magnesu, w temperaturze pokojowej, przez 5-10 minut.
  7. Umieść rurki z powrotem na magnesie. Po oddzieleniu kulek i płynu przenieść supernatant do świeżej probówki, aby uzyskać oczyszczony produkt PCR.
  8. (Opcjonalnie) Wizualizuj produkt, aby potwierdzić pomyślne oczyszczanie amplikonu, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu. Pasmo 460 pz powinno być widoczne i nie powinno być ściemniacza startera.
  9. Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do indeksowania PCR, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.

5. Próbkowanie kodów kreskowych i oczyszczanie

  1. Przypisz unikalne kombinacje starterów do każdej próbki, wybierając startery do przodu lub do tyłu, lub jedno i drugie, z dostępnego na rynku zestawu indeksów bibliotecznych.
    UWAGA: Jednoznaczne etykietowanie próbek pozwala na różnicowanie po sekwencjonowaniu. Zestawy zazwyczaj zapewniają wystarczającą ilość starterów do sekwencjonowania 96-384 próbek.
  2. Dołączyć podwójne startery lub indeksy do próbek, wykonując PCR w reakcji 25 μl zawierającej 2,5 μl każdego startera (N7xx i S5xx), 12,5 μl dostępnej w handlu mieszanki głównej PCR, 5 μl ddH2O i 2,5 μl oczyszczonego produktu amplikonowego.
  3. Przenieść probówki do termocyklera zaprogramowanego na: wstępną denaturację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 8-14 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 10 °C.
  4. Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma przy 550 pz, aby potwierdzić wzmocnienie.
    UWAGA: Wykorzystaj wyniki wizualizacji, aby poinformować o warunkach cyklicznych indeksu PCR. Zmniejsz liczbę cykli, aby złagodzić niespecyficzne wiązanie, lub zwiększ liczbę cykli, aby uzyskać widoczne pasma dla każdej próbki.
  5. Powtórz procedurę czyszczenia wymienioną w kroku 4. Aby uniknąć rozcieńczenia podczas czyszczenia, należy wykonać indeks PCR w dwóch egzemplarzach i połączyć produkt w tym miejscu.
  6. Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do bibliotecznej kwantyfikacji i normalizacji, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.

6. Kwantyfikacja i normalizacja biblioteki

  1. Oszacuj stężenie każdego oczyszczonego produktu oznaczonego kodem kreskowym od kroku 5.5 za pomocą fluorometru lub spektrofotometru (patrz krok 2.2). Rozcieńczyć próbki w buforze TE, aby uzyskać stężenie około 1 pM.
    UWAGA: Kwantyfikacja biblioteki jest niezbędna do osiągnięcia stężenia obciążenia próbki zalecanego dla platformy sekwencjonowania. Kwantyfikacja biblioteki odbywa się za pomocą qPCR, ale oszacowanie stężenia próbki przed qPCR oszczędza odczynniki i czas. Stężenie 1 pM jest zalecane, aby zmaksymalizować dokładność kwantyfikacji biblioteki, ponieważ jest to średnie stężenie wzorców qPCR podanych w zestawie do kwantyfikacji24.
  2. Przeprowadzić qPCR w 10 μL reakcji zawierającej 6,0 μL głównej mieszanki qPCR (z zestawu do kwantyfikacji z biblioteki), 2,0 μL ddH2O i 2,0 μL próbki lub wzorca. Uruchom każdą próbkę i wzorzec w trzech egzemplarzach, aby uzyskać większą dokładność i precyzję. Każdą próbkę należy uruchomić na trzech lub więcej poziomach rozcieńczenia (np. 0,1 pm, 1 pm i 10 pm dla szacowanych stężeń początkowych), aby zapewnić dokładną ocenę ilościową.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat dostarczonych podkładów i wzorców będą się różnić w zależności od użytego zestawu do oznaczania ilościowego i są dostępne w karcie technicznej produktu. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z zestawem do oznaczania ilościowego używanym w tym badaniu.
  3. Przenieść płytkę lub probówki qPCR do przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym zaprogramowanego na: początkową denaturację 95 °C przez 5 minut; 35 cykli po 1) 95 °C przez 30 s i 2) 60 °C przez 45 s; oraz stopień dysocjacji 1) 95 °C przez 15 s, 2) 60 °C przez 30 s i 3) 95 °C przez 15 s.
  4. Obliczyć średnie stężenie początkowe dla każdej próbki, wykorzystując wartości ilościowe uzyskane na podstawie wyników qPCR i zastosowane poziomy rozcieńczenia próbki.
    UWAGA: Na przykład średnie stężenie 2 pM dla próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 000 daje pierwotne stężenie początkowe 200 nM. Jeżeli żaden z poziomów rozcieńczenia dla danej próbki nie mieści się w zakresie krzywych wzorcowych, wyniki oznaczania ilościowego mogą nie być dokładne; w takim przypadku dostosować poziomy rozcieńczenia i ponownie przeprowadzić qPCR.
  5. Rozcieńczyć każdą oczyszczoną próbkę oznaczoną kodem kreskowym do 4 nM w buforze TE, w oparciu o średnie stężenia obliczone w kroku 7.5.
    UWAGA: Na przykład, aby uzyskać średnie stężenie próbki 200 nM, rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:50 w buforze TE, aby uzyskać stężenie 4 nM. Dokładne stężenie próbki będzie się różnić w zależności od zastosowanego systemu sekwencjonowania i zestawu odczynników. Zapoznaj się z instrukcją obsługi systemu sekwencjonowania, aby uzyskać zalecane stężenie.
  6. Utwórz połączoną bibliotekę, dodając równe objętości (zwykle 5-10 μl) wszystkich indywidualnych bibliotek do jednej probówki.
    UWAGA: Ponieważ wszystkie próbki powinny mieć stężenie 4 nM, dodanie równych objętości pozwala uzyskać równe stężenie wszystkich próbek w bibliotece zbiorczej.
  7. Powtórz kroki 6.2-6.4 na połączonej bibliotece, aby potwierdzić stężenie 4 nM.
  8. Obliczyć połączone stężenie biblioteki i rozcieńczyć lub odtworzyć ostateczną, zbiorczą bibliotekę za pomocą bufora Tris, jeśli jest to konieczne do osiągnięcia 4 nM.
  9. Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do ładowania próbki, należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Sekwencjonowanie należy przeprowadzić wkrótce po oznaczeniu ilościowym, aby zminimalizować straty lub zmiany stężenia DNA podczas przechowywania.

7. Denaturacja i rozcieńczanie biblioteki oraz sekwencjonowanie (wykonywane tego samego dnia)

  1. Denaturuj połączoną bibliotekę 4 nM z kroku 6.9 za pomocą NaOH.
    UWAGA: Te końcowe kroki przygotowania biblioteki różnią się dla każdego systemu sekwencjonowania. Zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika systemu sekwencjonowania, aby uzyskać bardziej szczegółowe i zaktualizowane protokoły. Nowi użytkownicy prawdopodobnie będą musieli zostać przeszkoleni w zakresie korzystania z platformy sekwencjonowania lub mogą wysłać swoje biblioteki do podstawowego narzędzia sekwencjonowania.
  2. Rozcieńczyć zdenaturowaną bibliotekę do żądanego stężenia wsadowego za pomocą buforu znajdującego się w zestawie odczynników do sekwencjonowania (tabela materiałów).
    UWAGA: Optymalne stężenia obciążenia różnią się w zależności od systemu sekwencjonowania i zwykle wahają się od 1 do 250 pM25.
  3. Dedenaturować i rozcieńczyć kontrolę sekwencjonowania.
    UWAGA: Dodanie kontrolki sekwencjonowania koryguje problemy z sekwencjonowaniem wynikające z bibliotek o niskiej różnorodności. Denaturować kontrolę sekwencjonowania za pomocą NaOH i rozcieńczyć do tego samego stężenia co biblioteka.
  4. Połącz bibliotekę i kontrolę sekwencjonowania.
    UWAGA: Stosunek kontroli sekwencjonowania do połączonej biblioteki będzie zależał od różnorodności biblioteki i używanego systemu sekwencjonowania, ale zazwyczaj jest to 1:126.
  5. Załaduj połączoną bibliotekę i mieszaninę kontrolną sekwencjonowania do komórki przepływowej sekwencjonowania.

8. Analiza sekwencji amplikonów

  1. Oceń ogólny sukces przebiegu, badając metryki przebiegu w środowisku przetwarzania w chmurze odpowiadające używanemu systemowi sekwencjonowania.
    UWAGA: Wskaźniki uruchamiania, takie jak liczba odczytów sekwencjonowania, będą się różnić w zależności od użytej platformy sekwencjonowania i zestawu odczynników. Wartości docelowe dla powszechnych systemów sekwencjonowania podano w tabeli 1.
  2. Pobierz surowe dane sekwencjonowania i żądane oprogramowanie bioinformatyczne typu open source, Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)27 lub Mothur28.
    UWAGA: Zarówno QIIME, jak i Mothur są open-source i można je pobrać bezpłatnie. Szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tych programów można znaleźć w Internecie i są wystarczająco szczegółowe dla początkujących użytkowników. Poniższe kroki stanowią szeroki przegląd procesu bioinformatycznego prowadzonego w QIIME. Znajomość Pythona nie jest konieczna, ale ułatwi implementację następujących skryptów
  3. Utwórz i zweryfikuj plik mapowania za pomocą skryptu "validate_mapping_file.py" w QIIME.
    UWAGA: Plik mapowania zawiera wszystkie metadane niezbędne do przeprowadzenia analizy danych, w tym identyfikator próbki, sekwencje starterów amplikonów i opis próbki. Na etapie walidacji sprawdzane jest, czy wszystkie niezbędne dane zostały wprowadzone w odpowiednim formacie.
  4. Demultipleksuj i filtruj sekwencje za pomocą skryptu "split_libraries.py" (Rysunek 1).
    UWAGA: Ten skrypt przypisuje odczyty z kodami kreskowymi do próbek na podstawie kombinacji starterów indeksowych i identyfikatorów próbek wprowadzonych w pliku mapowania. Wykonuje również kilka kroków filtrowania jakości w celu kontrolowania błędu sekwencjonowania w oparciu o zdefiniowane przez użytkownika wartości odcięcia dla minimalnego wyniku jakości, długości sekwencji i przycinania końców.
  5. Przypisz operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) do sekwencji za pomocą skryptu "pick_open_references_otus.py".
    UWAGA: W tym kroku sekwencje są grupowane względem kolekcji sekwencji referencyjnych na podstawie progu tożsamości (zwykle 97%). Odczyty, które nie są zgodne z kolekcją sekwencji odwołań, są grupowane względem siebie. Dostępne są również opcje kompletacji de novo i OTU z zamkniętym odniesieniem, ale programiści QIIME zalecają pobieranie z otwartymi referencjami.
  6. Znormalizuj tabelę OTU za pomocą skryptu "alpha_rarefaction.py" lub "normalize_table.py".
    UWAGA: Ten krok koryguje zmiany w sumach kolumn lub całkowitych odczytach sekwencji na próbkę, które wynikają z nowoczesnych technologii sekwencjonowania. Normalizację można przeprowadzić przy użyciu tradycyjnego rozrzedzenia lub za pomocą alternatywnych metod, takich jak skalowanie sum skumulowanych.
  7. Wykonaj jednocześnie kilka analiz różnorodności alfa, beta i różnorodności taksonomicznej za pomocą skryptu "core_diversity_analysis.py".
    UWAGA: Alternatywnie analizy te mogą być uruchamiane oddzielnie za pomocą poszczególnych skryptów (np. "alpha_diversity.py").

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łącznie 42 kleszcze z trzech oddzielnych lęgów jaj i dwóch okresów ekspozycji środowiskowej, 0 i 2 tygodnie w glebie, zostały przetworzone do sekwencjonowania mikrobiomu. Każda grupa badana, uważana za pojedynczy czas lęgu i ekspozycji, zawierała 6-8 powtórzonych próbek kleszczy. Te przetworzone ekstrakty z kleszczy zostały załadowane do sekwenatora nowej generacji i dały 12 885 713 odczytów sparowanych końców przechodzących przez filtr. W tej serii uwzględniono 3 kontrole ujemne z etapu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie 16S rRNA nowej generacji stało się standardowym podejściem do identyfikacji drobnoustrojów i umożliwiło zbadanie, w jaki sposób mikrobiomy wektorowe wpływają na przenoszenie patogenów. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje zastosowanie tej metody do badania gromadzenia się społeczności drobnoustrojów u I. pacificus, gatunku wektora boreliozy; Można go jednak łatwo zastosować do badania innych gatunków kleszczy lub gatunków wektorów stawonogów.

Rzeczywiście,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty National Science Foundation dla A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa przedmiotuKatalog firmy materiałowej/sprzętowej#
1DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504
2Qubit 4 FluorometrThermoFisher ScientificQ3326
3NanoDrop 8000 SpektrofotometrThermoFisher ScientificND-8000-GL
42x KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapa BiosystemsKK2501
Koraliki 5 AMPure XPAgen CourtA63880 
6Stojak magnetycznyThermoFisher ScientificMR02
6Bufor TETeknovaT0223
7Zestaw indeksów NexteraIlluminaFC-121-1011
8Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPARocheKK4824
9System MiSeqIlluminaSY-410-1003
10Zestaw odczynników MiSeq v3 IlluminaMS-102-3001
1110 mM Tris-HCl z animacją 0,1% 20TeknovaT7724

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
  2. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
  3. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  4. Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
  5. Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
  6. van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
  7. Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
  8. Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
  9. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  10. Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
  11. Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
  12. Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
  13. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
  14. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  15. Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
  16. Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
  17. Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
  18. Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
  19. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  20. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
  21. Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
  22. Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
  23. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  24. TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
  25. Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
  26. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
  27. Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  28. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
  29. Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
  30. Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
  31. Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
  33. Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
  34. Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
  35. Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
  36. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564(2014).
  37. Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
  38. Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
  39. McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
  40. Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
  41. Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
  42. Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
  43. Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
  44. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  45. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
  46. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
  47. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19(2010).
  48. Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
  49. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie 16S rRNAmikrobiom wektoraPCR amplikonowyekstrakcja DNAelektroforeza elowakulki paramagnetycznekwantyfikacja qPCRprzygotowanie bibliotekisekwencjonowanie w kom rce przep ywowej

Powiązane artykuły