Artykuł metodologiczny

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

DOI:

10.3791/58252

⸱

5 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, The First Hospital of Jilin University, 2Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorską i łatwą metodę tworzenia trójwymiarowych (3-D) tkanek serca bez dodatkowego materiału na rusztowania. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CM), ludzkie fibroblasty serca (HCF) i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są izolowane i wykorzystywane do wytworzenia zawiesiny komórkowej z 70% iPSC-CM, 15% HCF i 15% HUVEC. Są one hodowane wspólnie w systemie "wiszącej kropli" o bardzo niskim nasadce, który zawiera mikropory do kondensacji setek sferoid jednocześnie. Komórki agregują się i spontanicznie tworzą bijące sferoidy po 3 dniach wspólnej hodowli. Sferoidy są zbierane, wysiewane do nowej jamy pleśni i hodowane na wytrząsarce w inkubatorze. Sferoidy stają się dojrzałą tkanką funkcjonalną po około 7 dniach od wysiewu. Powstałe w ten sposób wielowarstwowe tkanki składają się ze zrośniętych sferoid o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia. Ta nowa metoda ma obiecujący potencjał jako powtarzalna i opłacalna metoda tworzenia zmodyfikowanych tkanek do leczenia niewydolności serca w przyszłości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem obecnej inżynierii tkankowej serca jest opracowanie terapii zastępującej lub naprawiającej strukturę i funkcję uszkodzonej tkanki mięśnia sercowego1. Metody tworzenia trójwymiarowych modeli tkanki serca wykazujących ważne właściwości kurczliwe i elektrofizjologiczne natywnej tkanki serca szybko się rozwijają2,3. W badaniach zbadano i wykorzystano różne strategie4,5. Metody te obejmują zarówno stosowanie specyficznych syntetycznych i naturalnych bioaktywnych hydrożeli, takich jak żelatyna, kolagen, fibryna i peptydy6, po technologie osadzania biotuszem2 i technologie biodruku7.

Wykazano, że metody bez rusztowań mogą wytwarzać porównywalne tkanki jak metody oparte na biomateriale, bez wad związanych z włączaniem obcego materiału rusztowania8. Oren Caspi i wsp. wykazali, że inkorporacja różnych typów komórek umożliwia generowanie wysoce unaczynionej ludzkiej tkanki serca zaprojektowanej przez człowieka9. Chin i in. opracowali metodę druku 3D do tworzenia łat sercowych ze sferoid. Powstałe plastry składają się z kardiomiocytów, fibroblastów i komórek śródbłonka w stosunku 70:15:1510. Wykazano, że sferoidy są skutecznymi "elementami budulcowymi" w tworzeniu tkanki serca bez rusztowań, ponieważ są odporne na niedotlenienie i mają wystarczającą integralność mechaniczną do implantacji11,12. Wcześniejsze badania wykazały kilka metod wytwarzania sferoidów, w tym zastosowanie metody wiszącej kropli, kolb przędzarki13, systemy mikroprzepływowe14 oraz nieprzylegające powierzchnie hodowlane niepokryte lub pokryte mikropleśniami agarozowymi15. W tym protokole używamy urządzenia do zawieszania kropli, które zawiera mikropory do kondensacji setek sferoid jednocześnie.

To badanie przedstawia nowatorską i efektywną metodę tworzenia tkanki sercowej bez rusztowań, która obejmuje ręczne umieszczanie sferoid w kwadratowej jamie formy i inkubację tkanki na wytrząsarce w celu dojrzewania. W zwykłych warunkach hodowli statycznej dyfuzja tlenu jest ograniczona do zewnętrznych aspektów konstruktu tkankowego, co prowadzi do martwicy centralnej. Jednak w przypadku formy siatkowej wszystkie sferoidy osadzone w formie są zanurzane w mediach o stałym ruchu płynnym, co pozwala na zwiększoną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Dodatkowo ta metoda oparta na formie pozwala na jednoczesne tworzenie plastrów tkankowych o różnej wielkości przy minimalnym wysiłku ręcznym, a powstałą tkankę można łatwo usunąć z formy. Ta nowatorska metoda pozwala na wydajne i powtarzalne tworzenie wielowarstwowych plastrów serca bez rusztowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kardiomiocytów

  1. Pokryj 6-dołkowe płytki macierzą błony podstawnej i hodowlą ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), jak opisano wcześniej17.
  2. Rozróżnij hiPSC na hiPSC-CM, korzystając z wcześniej opisanych metod18.
  3. Po 16 - 18 dniach po różnicowaniu zawiesić kardiomiocyty, przepłukując każdą studzienkę 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia lub magnezu, a następnie inkubować z 1 ml / studzienkę trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przy użyciu równej objętości pożywki komórkowej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej B-27 (pożywka komórkowa RPMI/B-27). Pipetuj w górę i w dół, aby poluzować przylegające komórki.
  5. Zebrać zawieszone kardiomiocyty za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
  7. Zawiesić osad w 10 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27.
  8. Połączyć 20 μl zawiesiny komórkowej z równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.
  9. Użyj ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórkowej.

2. Przygotowanie fibroblastów

  1. Rozpocznij hodowlę ludzkiej linii komórkowej fibroblastów serca (HCF) (typ komorowy dorosłego), jak opisano wcześniej16.
  2. Zawiesić HCF, inkubując je z odpowiednią ilością trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej16. W przypadku kolby T175 użyto 10 ml trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek.
  3. Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przy użyciu równej objętości pożywki, następnie przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu.
  4. Zawiesić osad w 10 ml pożywki wzrostowej fibroblastów (patrz Tabela Materiałów).
  5. Połączyć 20 μl zawiesiny komórek HCF z równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.
  6. Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność nowej zawiesiny komórek.

3. Przygotowanie komórek śródbłonka

  1. Zainicjuj hodowlę linii komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), jak opisano wcześniej17. Zawiesić HUVEC, inkubując je z odpowiednią ilością trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej17. Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów) za pomocą równej objętości pożywki, następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad.
    UWAGA: W przypadku kolby T175 użyto 10 ml trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek.
  2. Zawiesić osad w 10 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).
  3. Połączyć 20 μl zawiesiny HUVEC i zabarwić ją równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.
  4. Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.

4. Tworzenie sferoid wiszących kropli

  1. Umieść wiszące urządzenie do kroplowania, które zawiera 850 mikroporów (każdy o średnicy 350 μm) w sterylnych płytkach 6-dołkowych.
  2. Wyizoluj trzy typy komórek, jak opisano powyżej: hiPSC-CM, HCF i HUVEC. Połącz je w proporcji 70% iPSC-CM, 15% HCF i 15% HUVEC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z pożywką komórkową RPMI/B-27 w stężeniu 2 475 000 komórek na ml.
  3. Dozować 4 ml zawiesiny komórek (2 475 000 komórek na ml) do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce (o średnicy mikroporów 350 μm) osadzonej na płytce 6-dołkowej.
  4. Sferoidy utworzą się spontanicznie w ciągu 12 godzin od dozowania zawiesiny komórek do wiszącego urządzenia kroplowego. Kontynuować hodowlę przez łącznie 72 godziny (3 dni) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w celu dojrzewania sferoid.
  5. Po 72 godzinach hodowli zbierz sferoidy przez pory na dnie systemu wiszących kropli, umieszczając urządzenie w naczyniu z podłożem i delikatnie je obracając, aby uwolnić sferoidy z wiszącego urządzenia kroplowego.

5. Tworzenie łat 3D przy użyciu nowatorskiej formy sieciowej

  1. Podstawa, dolna kwadratowa płyta, dolna siatka i 10 warstwowych siatek bocznych są montowane w celu stworzenia nowatorskiej formy za pomocą pary sterylnych kleszczyków. Najpierw ułóż i wyrównaj podstawę, dolną kwadratową płytę i dolną siatkę za pomocą słupków narożnych. Następnie ułóż i ułóż 10 bocznych siatek w naprzemiennych kierunkach, aby utworzyć siatkę z drobnych zębów ze stali nierdzewnej.
  2. Przepłucz podstawę napełniającą PBS lub medium, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe, a następnie przenieś zmontowaną formę na podstawę napełniającą.
  3. Zwilż wnękę formy siatkowej PBS lub pożywką w ten sam sposób. Powoli napełniaj sferoidy do założonej wnęki o pożądanym rozmiarze (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm lub 6 x 6 x 1 mm).
    Uwaga: Upewnij się, że 120% przewidywanej objętości sferoid jest wprowadzane do wnęki, tak aby agregaty komórek były ściśle połączone i pozostały statyczne.
  4. Zamontuj górną siatkę i górną kwadratową płytę na słupkach narożnych i zabezpiecz korki i rurki mocujące, aby zapobiec wypłukaniu sferoid.
  5. Przenieś napełniony system formy siatkowej na 6-dołkową płytkę z 6 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27 lub do sterylnego pojemnika z wystarczającą ilością pożywki, aby pokryć całą zmontowaną formę.
  6. Inkubować 6-dołkową płytkę z wypełnionym systemem pleśni na wahadłowej wytrząsarce przez 7 - 10 dni w temperaturze 3 000 - 4 000 x g.
    UWAGA: Czas trwania inkubacji zależy od wielkości plastrów sercowych. W przypadku większych plastrów czas inkubacji będzie musiał zostać wydłużony w celu dojrzewania plastra sercowego.

6. Usunięcie łatki z nowej formy sieciowej

  1. Wyjmij system formy z podłoża i umieść go na wysterylizowanej macie manipulacyjnej w sterylnym naczyniu o średnicy 10 cm.
  2. Wyjmij rurkę mocującą, korki, górną kwadratową płytkę i górną siatkę. Ostrożnie wysuń warstwowe siatki boczne jedna po drugiej za pomocą sterylnych kleszczy. Po deniuulacji uzyskuje się nienaruszoną łatkę serca na szczycie dolnej siatki.
  3. Podnieś dolną siatkę z plastrem za pomocą sterylnych kleszczyków i przenieś dolną siatkę do 35-milimetrowego naczynia z 5 ml pożywki RPMI/B27. Delikatnie poluzuj plaster z dolnej siatki, powoli obracając siatkę w naczyniu lub za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Po oderwaniu od dolnej siatki tkanka serca może być hodowana za pomocą pożywki RPMI/B27.
  4. Kontynuuj inkubację swobodnie unoszącej się trójwymiarowej łaty serca w naczyniu o średnicy 35 mm. Funkcjonalne dudnienie synchroniczne można zaobserwować już po 24 godzinach od wyjęcia z formy.
  5. Po wyjęciu łaty z formy siatkowej należy zwrócić uwagę, że jej kształt jest zachowany z zachowaniem integralności, a intensywność synchronicznego bicia wzrasta z czasem.
    UWAGA: Plastry serca oparte na pleśni 3D wykazywały integrację elektryczną składowych kardiosfer po dekaniulacji. Zaobserwowaliśmy częstotliwość dudnień w zakresie od 60 do 80 uderzeń na minutę, która utrzymywała się przez ponad 60 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych eksperymentach użyliśmy zawiesiny komórkowej 70% iPSC-CMs, 15% HCF i 15% HUVEC w pożywce komórkowej RPMI/B-27 w stężeniu 2 475 000 komórek na ml. Po utworzeniu zawiesiny komórek dozowaliśmy 4 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce, jak opisano w kroku 4.3 protokołu. Zastosowanie systemu wiszących kropli spowodowało spontaniczne powstanie setek bijących sferoid po 3 dniach hodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie tej metody polega na jej odtwarzalności i skuteczności uzyskanej wielowarstwowej tkanki serca. W dziedzinie inżynierii tkankowej serca jednym z obecnych celów jest zidentyfikowanie metody konstruowania bijących, wielowarstwowych i funkcjonalnych trójwymiarowych plastrów serca. Przedstawiamy wydajną i powtarzalną metodę tworzenia wielowarstwowych tkanek serca poprzez bezpośrednie ręczne wysiewanie sferoid złożonych z kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów do nowej formy siatkowej. Forma siatkowa stoso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy podają następujące źródło finansowania: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie fibroblasty serca (HCF)Sciencell6310
FM-2 Składa się z podłoża podstawowegoSciencell2331HCF Pożywki
hodowlanej Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)LonzaCC-2935
EGM+Bullet Kit LonzaCC5035HUVEC pożywka
hodowlana E8 pożywka InvitrogenA1517001Pożywka hodowlana HiPSC
Geltrex InvitrogenA1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)Thermo Fisher12604013Trypsyna i odczynnik do dysocjacji komórek
Pożywka RPMI PożywkaInvitrogen11875093RPMI z suplementem B-27 to pożywka hodowlana hiPSC-CM
Suplement B-27 (50x)Pożywka Thermo Fisher17504044RPMI z suplementem B-27 to pożywka hodowlana hiPSC-CM
Błękit trypanowy Roztwór, 0,4%Thermo Fisher15250061
Nowatorska forma siatkowa TissueByNet Co., LtdNM25-1
Wisząca płytka opadającaKuraray Co., LtdMPc350
Płytki 6-dołkowe Sigma-AldrichCLS-3516

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Scaffold free Cardiac TissueNet Mold MethodHanging Drop SystemSpheroid FormationiPSC CMs HCFs HUVECsUltra low AttachmentMicropore DeviceStainless Steel NetsTissue MaturationBeating Spheroids

Powiązane artykuły