Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wyzwaniem dla naukowców było wyrażenie rekombinowanych wydzielniczych białek eukariotycznych do badań strukturalnych i biochemicznych. System ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, jest jednym z systemów używanych do ekspresji rekombinowanych eukariotycznych białek wydzielniczych z pewnymi modyfikacjami potranslacyjnymi. Białka wydzielnicze muszą być kierowane przez szlaki wydzielnicze w celu glikozylacji białek, tworzenia wiązań dwusiarczkowych i innych modyfikacji potranslacyjnych. Aby poprawić istniejącą ekspresję wydzielniczych białek roślinnych w komórkach owadów, wektor ekspresyjny bakulowirusa jest modyfikowany przez dodanie sekwencji peptydu sygnałowego GP67 lub hemoliny między promotorem a miejscami wielokrotnego klonowania. Ten nowo zaprojektowany, zmodyfikowany system wektorów z powodzeniem pozwolił uzyskać wysoką wydajność rozpuszczalnych, rekombinowanych, wydzielanych białek receptorów roślinnych Arabidopsis thaliana. Dwa z eksprymowanych białek roślinnych, zewnątrzkomórkowe domeny Arabidopsis TDR i receptorów błony plazmatycznej PRK3, skrystalizowano do badań krystalograficznych rentgenowskich. Zmodyfikowany system wektorów jest ulepszonym narzędziem, które potencjalnie może być wykorzystane do ekspresji rekombinowanych białek wydzielniczych również w królestwie zwierząt.
Wprowadzenie
Konieczne jest, aby laboratorium badawcze było w stanie produkować duże ilości jednorodnych białek rekombinowanych do charakterystyki biochemicznej i biofizycznej, szczególnie do badań krystalograficznych rentgenowskich. Istnieje wiele dobrze ugruntowanych heterologicznych systemów ekspresji, takich jak Escherichia coli, drożdże, komórki owadów, komórki ssaków, komórki roślinne itp. Wśród nich system ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, jest jedną z najczęściej stosowanych technik wytwarzania dużych ilości strukturalnie pofałdowanych rekombinowanych białek eukariotycznych o dużych rozmiarach do krystalizacji białek1.
Wektory ekspresyjne systemu ekspresji bakulowirusa są zaprojektowane tak, aby zawierały silną polihedrynę lub promotor P10, aby uzyskać wysoką wydajność rekombinowanych białek wewnątrzkomórkowych2,3. Aby wytworzyć rekombinowanego bakulowirusa, gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany do wektora owada zawierającego locus polihedryny (polh) w genomie wielonukleopolihedrowirusowym Autographa californica. Powstała konstrukcja jest następnie sekwencjonowana i weryfikowana jest jej poprawna otwarta ramka odczytu (ORF). Prawidłowy konstrukt jest następnie wprowadzany do komórki owada gospodarza w procesie transfekcji. Gen będący przedmiotem zainteresowania jest wprowadzany do genomu wirusa w drodze rekombinacji homologicznej. Zdarzenie to powoduje wytworzenie rekombinowanego genomu wirusa, który następnie replikuje się, tworząc rekombinowane cząsteczki wirusa z pączkami1.
Najczęściej używane komórki owadów w systemie ekspresji to komórki Sf9 i High Five (Hi5). Komórki Sf9 są klonalnym izolatem Sf21, pochodzącym z komórek jajnika poczwarki Spodoptera frugiperda, a komórki Hi5 są izolatem klonalnym pochodzącym z rodzicielskiej linii komórek jajnikowych Trichoplusia ni TN-3684,5. Kotransfekcja, amplifikacja wirusa i testy płytki nazębnej są przeprowadzane na komórkach Sf9, podczas gdy komórki Hi5 są zwykle wybierane do wytwarzania większych ilości rekombinowanych białek6. Warto zauważyć, że komórki Hi5 nie nadają się do generowania i amplifikacji progenii wirusa ze względu na ich skłonność do wytwarzania zmutowanych wirusów. Tradycyjnie uważa się, że zakres temperatur 25 - 30 °C jest dobry do hodowli komórek owadów. Doniesiono jednak, że 27 - 28 °C to optymalna temperatura dla wzrostu komórek owadów i infekcji7,8.
Wprowadzenie silnej sekwencji sygnałowej poprzedzającej gen jest potrzebne do wysokiej ekspresji wydzielanych białek. Sekwencja sygnałowa skutecznie prowadziłaby translowane białko rekombinowane do retikulum endoplazmatycznego w celu wydzielania białka i modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do prawidłowego fałdowania i stabilizacji3. Sekwencje peptydów sygnałowych, takie jak białko otaczające bakulowirusa GP64/67, melityna pszczoły miodnej i inne, zostały wybrane w celu ułatwienia ekspresji wydzielniczych białek rekombinowanych w systemach ekspresji, w których pośredniczy bakulowirus3. Wykazano, że wprowadzenie peptydu sygnałowego GP67 poprawia wydajność ekspresji wydzielanego białka rekombinowanego w porównaniu z użyciem wewnętrznego peptydu sygnałowego docelowego genu 9. Hemolin to białko hemolimfy gigantycznej jedwabnej Hyalophora cecropia, wywołane infekcją bakteryjną10. Ze względu na stosunkowo wysoki poziom indukowanej ekspresji, sekwencja peptydu sygnałowego genu może być wykorzystana do pośredniczenia w ekspresji wydzielania rekombinowanych białek w układzie komórkowym bakulowirusa-owada.
Receptor Receptora Czynnika Hamującego Różnicowanie Elementów Tchheary (TDR) i Kinaza Receptora Pyłkowego 3 (PRK3) należą do rodziny białek roślinnych Kinaza Receptora Powtórzeniowego Bogatych w Leucynę (LRR-RLK)11,12. W celu zbadania struktury i funkcji tej rodziny roślinnych białek receptorowych, a także w celu ułatwienia charakterystyki strukturalnej i biochemicznej innych białek wydzielanych przez rośliny, zmodyfikowano system ekspresji komórek bakulowirusa i owadów w celu poprawy jakości białka i wydajności produkcji. Domeny zewnątrzkomórkowe zarówno TDR, jak i PRK3 zostały z powodzeniem wyrażone przy użyciu dwóch zmodyfikowanych wektorów ekspresyjnych w systemie ekspresji komórek bakulowirusa-owada. Krystalizacji uległy zarówno domeny zewnątrzkomórkowe białek TDR, jak i PRK3. W artykule opisano ekspresję i oczyszczanie dużych ilości rekombinowanych wydzielanych białek roślinnych za pomocą dwóch zmodyfikowanych wektorów ekspresji bakulowirusa poprzez włączenie sekwencji sygnałowej GP67 lub hemoliny między promotorem a wieloma miejscami klonowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Używany jest system komórek owadów/bakulowirusa ze zmodyfikowanymi wektorami ekspresji do ekspresji i krystalizacji wydzielniczych białek roślinnych.
1. Modyfikacja wektora ekspresji bakulowirusa za pomocą peptydu sygnałowego GP67 do ekspresji wydzielania białek roślinnych
- Zsyntetyzuj fragment DNA zawierający miejsce cięcia 5' BglII13, sekwencję sygnału wydzielania GP67 oraz miejsce wielokrotnego klonowania z NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI i XhoI (Rysunek 1A).
UWAGA: Ponieważ zarówno DNA trawione przez BglII, jak i BamHI skutkowało tymi samymi końcami adhezyjnymi, zlinearyzowany wektor może ligować do strawionego fragmentu DNA, podczas gdy zarówno miejsca BglII, jak i BamHI w sekwencji ligacji wyżarzonej zostaną zmutowane do sekwencji, która nie jest rozszczepialna ani przez BglII, ani przez BamHI14. - Trawić 4 μg DNA za pomocą BglII i XhoI oraz 4 μg DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamHI i XhoI14. Zmieszać 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o 1x stężeniu (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu i 100 μg/ml BSA, pH 7,9 w 25 °C) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
- Oczyść wycięty fragment DNA i zlinearyzowany wektorowy DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA15.
- Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej 1x bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP i 10 mM DTT, pH 7,5 w 25 °C) i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
- Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Zbierz 5 - 10 kolonii i hoduj każdą kolonię w 2 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny przy 220 obr./min i 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin.
- Wyekstrahuj DNA każdego plazmidu za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA17 i potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
- Amplifikacja PCR fragmentu genu A. thaliana TDR kodującego reszty 30 - 642 z syntetycznego konstruktu genu TDR (starter do przodu: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, starter odwrotny: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplifikuj DNA przez 30 cykli w buforze reakcyjnym polimerazy DNA zawierającym 0,5 mM mieszaniny dNTP, 0,2 μM starterów, 0,1 μg matrycowego DNA, 0,4 mM MgCl2 i 1 jednostkę reakcyjną polimerazy DNA.
- W przypadku etapów cyklu PCR należy ustawić początkową denaturację na 95 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
- Trawić zarówno fragment PCR, jak i zmodyfikowany wektor za pomocą enzymów endonukleazy restrykcyjnej NotI i BamHI. Liguj fragment genu za pomocą wektora zlinearyzowanego. Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
- Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Potwierdź prawidłowe klony za pomocą sekwencjonowania DNA.
2. Modyfikacja wektora ekspresji bakulowirusa za pomocą peptydu sygnałowego hemoliny owadów do ekspresji wydzielania białek roślinnych
- Zsyntetyzuj fragment DNA zawierający miejsce cięcia 5' BglII13, sekwencję sygnałową wydzielania hemoliny owadów oraz miejsce wielokrotnego klonowania z NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI i XhoI (Rysunek 1B).
- Trawić 4 μg DNA za pomocą BglII i XhoI oraz 4 μg DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamHI i XhoI14. Zmieszać 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o 1x stężeniu (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu i 100 μg/ml BSA, pH 7,9 w 25 °C) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
- Oczyść wycięty fragment DNA i zlinearyzowany wektorowy DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA15.
- Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej 1x bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP i 10 mM DTT, pH 7,5 w 25 °C) i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
- Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α i wybierz kolonie na płytce agarowej ampicyliny-LB. Zbierz 5 - 10 kolonii i hoduj każdą kolonię w pożywce LB o pojemności 2 ml zawierającej 100 μg/ml ampicyliny przy 220 obr./min i 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin.
- Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do miniprepu DNA17 i potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
- PCR-amplify A. thaliana Kinaza Receptora Pyłkowego 3 (PRK3) fragment genu kodujący reszty 20 - 237 z syntetycznego konstruktu genu PRK3 (starter do przodu: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, starter odwrotny: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplifikuj DNA przez 30 cykli w buforze reakcyjnym polimerazy DNA zawierającym 0,5 mM mieszaniny dNTP, 0,2 μM starterów, 0,1 μg matrycowego DNA, 0,4 mM MgCl2 i 1 jednostkę reakcyjną polimerazy DNA.
- Dla etapów cyklu PCR należy ustawić początkową denaturację na 95 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s w każdym cyklu, a końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
- Trawić zarówno fragment PCR, jak i zmodyfikowany wektor za pomocą enzymów endonukleazy restrykcyjnej NotI i BamHI. Liguj fragment genu za pomocą wektora zlinearyzowanego. Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
- Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Potwierdź prawidłowe klony za pomocą sekwencjonowania DNA.
3. Produkcja i amplifikacja konstruktów bakulowirusa zawierających kasetę ekspresji rekombinowanego białka
- Użyj 100 ng plazmidu konstruktu, aby przekształcić 40 μl komórek kompetentnych DH10Bac zgodnie z protokołem systemu ekspresji bakulowirusa1. Inkubować płytki transformacyjne w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
- Weź dwie białe kolonie z każdej płytki transformacyjnej, zaszczep każdą kolonię w 2 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Postępuj zgodnie z protokołem systemu ekspresji bakulowirusa1, aby wyodrębnić i zweryfikować DNA bakcydu. Podwielokrotność każdego DNA należy umieścić w dwóch probówkach o pojemności 20 μl każda i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Poniższe kroki wymagają działania aseptycznego. - Hoduj monowarstwę komórek Sf9 w pożywce hodowlanej z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 μg/ml (lub 100 I.U./ml) antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi w temperaturze od 27 °C do 80% zbiegu w 6-dołkowej płytce. Oszacuj procent zbiegu na podstawie procentu pokrytego obszaru na płytce kultury tkankowej.
- Przygotuj następujące roztwory w dwóch sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
- Probówka 1: Do każdej transfekcji rozcieńczyć 20 μl bakmidowego DNA w 100 μl nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Delikatnie wymieszać rozcieńczenie, przesuwając bok tuby.
- Probówka 2: Dla każdej transfekcji rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji lipidów w 100 μl nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Dokładnie wymieszać rozcieńczenie, pipetując w górę i w dół przez 6 razy.
- Połącz oba roztwory, delikatnie je wymieszaj, pipetując powoli w górę iw dół przez 3x i inkubuj przez 20 - 40 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj każdą studzienkę komórek jednowarstwowych Sf9 2x 3 ml nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Do każdej transfekcji dodać 0,8 ml nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków do każdej probówki zawierającej mieszaninę lipid-DNA. Delikatnie wymieszać zawartość probówek, pipetując powoli w górę i w dół przez 3 razy. Odessać media płuczące z płytek i nałożyć próbki na mieszaninę transfekcyjną.
- Po dodaniu mieszaniny do transfekcji inkubować transfekowaną płytkę przez 5 godzin w temperaturze 27 °C. Zastąp pożywkę do transfekcji kompletną pożywką do hodowli komórkowych Sf9 zawierającą 10% FBS i 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyki penicylinowo-streptomycynowe. Inkubować transfekowaną płytkę w temperaturze 27 °C przez 4 dni.
- Zebrać i amplifikować rekombinowanego bakulowirusa.
- Zebrać supernatant z zakażonej płytki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml po 4 dniach inkubacji. Obracać supernatant w temperaturze 1010 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Wyrzucić osad i zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.
UWAGA: To jest wirus P0. Może być podawany i przechowywany w temperaturze -80 °C przez dłuższy okres czasu. - Aby amplifikować każdy rekombinowany wirus, wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 80% konfluencji. Odessać pożywkę z płytki, dodać 2 ml wirusa P0 do komórek przylegających do płytki i inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 °C. Kołysz płytką co 15 minut, aby wymieszać podłoże z komórkami.
- Dodać 25 ml kompletnej pożywki Grace's zawierającej 10% FBS i 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyków penicylinowo-streptomycynowych. Inkubować płytkę przez 3 dni w inkubatorze o temperaturze 27 °C w celu uzyskania wirusa pasażu P1.
- Zebrać supernatant z zakażonej płytki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 1010 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.
UWAGA: Wirus P1 może być podawany na porcje i przechowywany w temperaturze -80 °C przez dłuższy okres czasu. - Aby amplifikować wirusa z pasażu P1 do P2, należy wyhodować monowarstwę komórek Sf9 na płytce o średnicy 150 mm do 90% konfluencji, odessać pożywkę z płytki, dodać 2 ml wirusa P1 do płytki i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 °C.
- Powtórzyć kroki 3.8.2 i 3.8.3 w celu uzyskania pasaży P2 i P3 wirusów. Nie należy przechowywać wirusa P3 dłużej niż 2 miesiące.
- Zebrać supernatant z zakażonej płytki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml po 4 dniach inkubacji. Obracać supernatant w temperaturze 1010 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Wyrzucić osad i zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.
4. Ekspresja białek, oczyszczanie za pomocą NiNTA i krystalizacja
- Wyhodować 1 l komórek owadów Hi5 w pożywce hodowlanej z 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyków penicylinowo-streptomycynowych do gęstości 2 x 10,6 przy 100 obr./min w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 27 °C. Wirować komórki w temperaturze 570 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 20 ml świeżo wyprodukowanego wirusa P3 i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Delikatnie potrząśnij butelką wirową, aby ponownie zawiesić komórki 1x co 15 minut.
- Przenieść komórki do 1 l pożywki hodowlanej z antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi o stężeniu 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml), hodować komórki z prędkością 100 obr./min w inkubatorze o temperaturze 27 °C przez 72 godziny. Wirować komórki w temperaturze 1,010 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.
- Za pomocą pasków wskaźnika pH należy dostosować pH supernatantu do 8,0, dodając 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH i dodać bufor wiążący o końcowym stężeniu, zawierający 20 mM buforu Tris o pH 8,0, 100 mM NaCl i 5 mM imidazolu. Dodać pewną ilość żywicy NiNTA (10 - 40 ml) w oparciu o szacowaną wydajność eksprymowanego białka rekombinowanego znakowanego His.
- Mieszać roztwór na mieszadle magnetycznym z małą prędkością w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Przemyć żywicę i wymyć związane białko zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania NiNTA18.
- Oczyszczone białko należy poddać chromatografii jonowymiennej i chromatografii filtracji żelowej, a także innym metodom oczyszczania białek, aby uzyskać jednorodną próbkę.
UWAGA: W przypadku ektodomeny TDR jako żelowy bufor filtracyjny zastosowano 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl. Dla ektodomeny PRK3 jako preferowany żelowy bufor filtracyjny zastosowano 20 mM bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1, do ekspresji białek wydzielanych wykorzystano dwa zmodyfikowane wektory ekspresyjne bakulowirusowe pFastBac1, zawierające sekwencję sygnałową GP67 lub hemoliny, aby zastąpić rodzimą sekwencję sygnałową genu docelowego. Wykazano, że wirusowe GP67 i owadzie geny hemoliny zapewniają wysoki poziom ekspresji wydzielniczej w komórkach. Przewiduje się, że białka fuzyjne z dowolną z tych dwóch sekwencji sygnałowych będą charakteryzować się ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Biorąc pod uwagę różnorodność wielkości i stabilności tysięcy białek obecnych w systemach biologicznych, często laboratorium badawcze decyduje, który heterologiczny system ekspresji należy wybrać do ekspresji określonego białka. System ekspresji E. coli jest często pierwszym wyborem do ekspresji białek ze względu na krótki cykl życia bakterii, niski koszt pożywki hodowlanej i względną łatwość skalowania19. Jednak w przypadku ekspresji dużych białek eukariotycznych o rozmiarach większych n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez nowe fundusze na rozpoczęcie nauki przez Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej dla Guozhou Xu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wytrząsarka inkubatora | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Inkubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Wirówka | BECKMAN | Model J-6 | z obrotowym wirnikiem kubełkowym |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | Do amplifikacji PCR |
| DNA Termocykler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | Do amplifikacji PCR |
| wytrząsarki inkubatora | New Brunswick Scientific | Model I 24 | Do uprawy kultur baceria |
| Synteza DNA klienta | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Endonukleaza restrykcyjna |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Endonukleaza restrykcyjna |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Endonukleaza restrykcyjna |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Endonukleaza restrykcyjna |
| Ligaza DNA T4 | Nowa Anglia Biolabs | M0202T | Ligacja DNA |
| QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu | Qiagen | 28704 | Oczyszczanie DNA z żelu Agorase |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Oczyszczanie plazmidowego DNA z hodowli bakterii |
| Agaroza | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | Do elektroferozy żelu DNA |
| MAX Wydajność DH5α kompetentna komórka | Invitrogen | 18-258-012 | Do transformacji mieszaniny ligacji DNA |
| Lennox L LB Bulion | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | Do wytwarzania kultur bakterii |
| Sól sodowa ampicyliny | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antybiotyki |
| Siarczan Kanamycyny | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antybiotyki |
| Tetracyklina | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antybiotyki |
| Gentamycyna | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antybiotyki |
| MAX Skuteczność DH10Bac kompetentne komórki | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | Do wytwarzania bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | Do transformacji DNA |
| Odczynnik CellFECTIN II | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Odczynnik do transfekcji komórek owadów |
| System ekspresji Bac-to-Bac | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Zestaw do ekspresji komórek bakulowirusa i owadów |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | Do izolacji współistniejącego DNA Bacmid |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | Do izolacji powtarzającego się Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Wektor ekspresyjny Baculorirus |
| Komórki Sf9 Thermo | Ogniwa monowarstwowe Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 |
| Ogniwa Hi5 | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Komórki owadzie High Five |
| Grace' s pożywka dla owadów, nieuzupełniona | pożywka Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 transfekcja komórek |
| Grace' s pożywka dla owadów, uzupełniona | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 jednowarstwowa pożywka do hodowli komórkowych kompletna |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 zawiesinowa pożywka do hodowli komórkowych bez FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 pożywka do hodowli komórkowych |
| Penicylina-Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10 000 I.U./ml) |
| L-Glutamina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certyfikowane | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| Płytki 6-dołkowe | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Płytki płaskodenne |
| 150 mm | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/opakowanie |
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml | USA Scientific | 1415-2500 | 500 probówek / worek |
| 15 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką | USA Scientific | 1475-0511 | 25 probówek / worek |
| 50 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką | USA Scientific | 1500-1211 | 25 probówek / worek |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | Paski wskaźnikowe pH z żywicy NiNTA |
| EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 - 14 |
Bibliografia
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317(2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796(2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
