Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych są użytecznymi modelami ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Poniżej przedstawiamy wysokoprzepustowy system przesiewowy do ilościowego określania wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i wielodołkowego czytnika płytek do obrazowania z kontrolowaną temperaturą.
Artykuł metodologiczny
Skurcze syncytii kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC mierzone za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca na płytkach 384-dołkowych o kontrolowanej temperaturze
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CM) są użytecznym modelem ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Zaproponowano różne metody rejestrowania tej spontanicznej aktywności i oceny działania leku, ale wiele z tych metod cierpi z powodu ograniczonej przepustowości i/lub znaczenia fizjologicznego. Opracowaliśmy wysokoprzepustowy system badań przesiewowych w celu ilościowego określenia wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia hiPSC-CM, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i czytnika płytek wielodołkowych do obrazowania w kontrolowanej temperaturze. Opisujemy, jak przygotować płytki komórkowe i płytki złożone oraz jak uruchomić automatyczny test, aby osiągnąć wysoką czułość i odtwarzalność. Opisujemy również, jak przekształcać i analizować dane fluorescencyjne, aby zapewnić wiarygodne pomiary wpływu leku na spontaniczny rytm. Test ten może być stosowany w programach odkrywania leków w celu kierowania optymalizacją chemiczną z dala od lub w kierunku związków wpływających na czynność ludzkiego serca.
Wprowadzenie
Obecny protokół przedstawia metodę pomiaru wpływu leku na częstotliwość spontanicznego dudnienia syncytii hiPSC-CM w fizjologicznie odpowiednich rytmach. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w funkcjonalne kardiomiocyty, które spontanicznie ustanawiają syncytię bicia in vitro1,2,3,4. Te hiPSC-CM mogą być uzyskiwane w dużych ilościach za pośrednictwem dostawców komercyjnych lub poprzez produkcję w laboratorium i są użytecznym źródłem komórek do generowania modeli fizjologii i farmakologii serca człowieka. W szczególności mogą być wykorzystywane do przewidywania lub charakteryzowania skutków sercowych, które mogą wystąpić, gdy lek jest podawany ludziom5.
Częstotliwość dudnień syncytii hiPSC-CM może być mierzona w warunkach fizjologicznych za pomocą układów mikroelektrod lub wykrywania impedancji1: te nieinwazyjne techniki dostarczają bardzo szczegółowych informacji na temat efektów leku, ale są raczej mało wydajne i nie pozwalają na testowanie dużych bibliotek związków w realistycznych ograniczeniach czasowych i budżetowych. Bardziej efektywny system można opracować przy użyciu 384-dołkowego czytnika płytek do obrazowania fluorescencyjnego i czułego na Ca barwnika6, ale klasyczne czytniki płytek są utrudnione przez nieoptymalną kontrolę temperatury i częstotliwość akwizycji. Ograniczenia te ilustrują niefizjologiczne tempo dudnień (~15 uderzeń na minutę, w porównaniu do 35–55 uderzeń na minutę w kontrolowanych środowiskach1) oraz słaba rozdzielczość sygnału Ca (częstotliwość akwizycji 8 Hz jest dolną granicą nagrywania szybkości, która może osiągnąć 120 uderzeń na minutę w stymulowanych warunkach i nie może wydobyć informacji takich jak nachylenie lub czas trwania). Opisana tutaj metoda łączy w sobie rejestrowanie wzorców dudnienia w rytmach fizjologicznych i z wystarczającą rozdzielczością, aby wykluczyć te obawy.
Pozytywnym aspektem jest ta metoda, prosta, niezawodna i o wysokiej przepustowości, co pozwala na szybkie testowanie dużej liczby związków przy rozsądnych kosztach. Z drugiej strony, metoda ta wymaga szybkiego czytnika płytek ze skuteczną kontrolą temperatury, co jest kosztowną inwestycją i dostarcza niewiele mechanistycznych informacji na temat obserwowanych efektów działania leku, co może wymagać dalszych badań przy użyciu bardziej szczegółowych metod.
Przybliżenie 6 x 106 hiPSC-CM jest potrzebnych do jednego pomiaru na jednej 384-dołkowej płytce komórkowej. hiPSC-CM są zwykle dostarczane komercyjnie jako zamrożone porcje ~4 x 106 komórek w 1 ml. Dlatego wygodnie jest przygotować dwie płytki komórkowe z trzema zamrożonymi podwielokrotnościami. W większości przypadków, ze względu na niską zmienność tego testu, wystarczające jest wykonanie podwójnych pomiarów badanych związków i na każdej płytce komórkowej czterokrotnych pomiarów kontroli pozytywnych (forskoliny, N6-cyklopentylo-adenozyny i E-4031) oraz 20-punktowych pomiarów kontroli ujemnej (sam DMSO). W związku z tym za pomocą dwóch 384-dołkowych płytek komórkowych można ocenić maksymalnie 352 pary związek/stężenie. Poniższy protokół rozważa taki eksperyment przeprowadzony na 352 badanych związkach, dwóch płytkach komórkowych i 12 milionach komórek dostarczonych jako trzy zamrożone podwielokrotności; Można go łatwo skalować w górę, jeśli potrzebne są dodatkowe punkty danych.
Protokół
1. Przygotowanie płytek komórkowych
UWAGA: Przygotuj płytki komórkowe 3–4 tygodnie przed pomiarem efektów leku.
- Dzień 0 eksperymentu
UWAGA: Dla celów planowania, test złożony aplikacja może być wykonana w dowolnym dniu między dniami 22–28 eksperymentu.- Włączyć łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i ogrzać 40 ml pożywki galwanicznej (dostarczonej przez producenta).
UWAGA: Używaj komórek z dostarczonymi przez dostawcę pasującymi pożywkami do hodowli i konserwacji. - Rozmrozić hiPSC-CM, umieszczając krioprobówki zawierające zamrożone komórki w łaźni wodnej na 2 minuty.
- Ostrożnie przenieść zawiesiny komórek o objętości 1 ml do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
- Przemyć każdą krioprobówkę 1 ml ciepłego podłoża galwanicznego w celu odzyskania resztek komórek i dodać pożywkę do płukania do tej samej stożkowej probówki z kroku 1.1.3 zawierającej komórki.
- Ostrożnie wymieszać kolejne 8 ml ciepłej pożywki galwanicznej z zawiesiną komórkową.
- Zlicz żywe komórki za pomocą metody wykluczenia błękitu trypanowego i hematocytometru8.
UWAGA: Wymóg 6 x 106 komórek na jedną 384-dołkową płytkę komórkową uwzględnia możliwość do 20% martwych komórek wśród zamrożonych komórek, co jest maksimum z naszego doświadczenia. - Dostosuj zawiesinę komórek do 5 x 105 żywych komórek/ml za pomocą ciepłego podłoża galwanicznego.
- Rozprowadź zawiesinę komórek na dwóch 384-dołkowych płytkach komórkowych, dodając 25 μl do każdej studzienki (około 12 500 komórek na studzienkę).
UWAGA: Płytki ogniw nie muszą być wstępnie pokryte żadną matrycą (patrz Dyskusja). - Utrzymywać płytki komórkowe w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
- Włączyć łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i ogrzać 40 ml pożywki galwanicznej (dostarczonej przez producenta).
- Dzień 1 eksperymentu
- Włączyć łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i ogrzać 50 ml pożywki podtrzymującej uzupełnionej 1% v/v roztworem penicyliny i streptomycyny.
- Zastąp pożywkę galwaniczną 50 μl ciepłej pożywki konserwacyjnej w każdym dołku płytek komórkowych.
- Dni 2–21 (do 27 dnia) eksperymentu
UWAGA: hiPSC-CMs nie potrzebują żadnego pasażu w tym okresie, ponieważ są to komórki niedzielące się.- Odnawiaj połowę nośnika konserwacyjnego co 2–3 dni i odnawiaj go całkowicie w dniach 7, 14 i 21.
UWAGA: Pomiar fluorescencji można wykonać między 22 a 28 dniem eksperymentu. Dłuższe czasy trwania nie zostały wypróbowane, ale nadal mogą być w porządku.
- Odnawiaj połowę nośnika konserwacyjnego co 2–3 dni i odnawiaj go całkowicie w dniach 7, 14 i 21.
2. Przygotowanie instrumentów, płytek złożonych i płytek testowych
UWAGA: Przygotuj instrument, płytki złożone i płytki testowe w dniu pomiaru efektów działania leku, między 22 a 28 dniem eksperymentu. Należy użyć czytnika płytek fluorescencyjnych wyposażonego w regulator temperatury oraz odpowiedni zestaw filtrów fluorescencyjnych i źródło światła wzbudzającego. Na przykład użyj zestawu filtrów fluorescencyjnych Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (wzbudzenie: 472 nm; emisja: 520–560 nm) i jednostki źródła światła wzbudzenia o mocy 150 W.
- Co najmniej 2 godziny przed umieszczeniem pierwszej płytki celi w czytniku płytek w celu pomiaru, włączyć czytnik i ustawić system grzewczy na 37 °C.
UWAGA: Można to również zrobić poprzedniego wieczoru. - Przygotuj kontrole pozytywne, forskolinę, N6-cyklopentylo-adenozynę i E-4031 w postaci roztworów podstawowych odpowiednio 0,33 mM w DMSO, 10 mM w DMSO i 3,33 mM w H2O.
UWAGA: Roztwory podstawowe zostaną rozcieńczone 333-krotnie do czasu dodania ich do komórek, a celem jest osiągnięcie końcowych stężeń testowych 1 μM forskoliny, 30 μM N6-cyklopentylo-adenozyny i 10 μM E-4031, które dają wiarygodne i powtarzalne efekty. - Przygotować 352 badane związki jako roztwory podstawowe DMSO przy 333-krotności planowanych stężeń testowych (np. 10 mM dla badania przy 30 μM).
UWAGA: Celem jest osiągnięcie końcowego stężenia 0,3% (v/v) DMSO w płytce komórkowej po zastosowaniu związku; jest to najwyższe stężenie DMSO, które nie wpływa na rytmiczną aktywność kardiomiocytów. Roztwory podstawowe można również przygotować dzień wcześniej. Do każdego powtórnego pomiaru wymagane jest co najmniej 5 μl roztworu podstawowego. - Przygotuj płytki złożone.
- Ogrzać 40 ml pożywki podtrzymującej uzupełnionej 1% v/v roztworem penicyliny i streptomycyny do temperatury pokojowej.
- Rozprowadzić na dwie 384-dołkowe płytki złożone, dodając 1,5 μl roztworu podstawowego na studzienkę: i) badane związki (po dwie studzienki), ii) kontrole pozytywne (forskolina, N6-cyklopentylo-adenozyna i E-4031, po cztery studzienki na płytkę złożoną) oraz iii) kontrola ujemna (DMSO, 20 dołków na płytkę złożoną).
- Odwirować płytki złożone o masie 100 x g przez 1 min.
- Do każdej studzienki dodać 37 μl pożywki konserwacyjnej o temperaturze pokojowej (3,9% DMSO w 38,5 μl na tym etapie).
- Odwirować płytki złożone o masie 100 x g przez 1 min.
- Załaduj płytki złożone do czytnika płyt.
UWAGA: Kolejne kroki należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie w płytkach złożonych.
- Przygotuj barwnik fluorescencyjny.
- Włączyć łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i ogrzać 100 ml pożywki podtrzymującej uzupełnionej 1% v/v roztworem penicyliny i streptomycyny.
- Rozpuść wrażliwy na Ca barwnik fluorescencyjny i zalać 10 ml ciepłej pożywki podtrzymującej antybiotykami.
UWAGA: Ten podstawowy nośnik fluorescencyjny zawiera barwnik fluorescencyjny wrażliwy na Ca, zwykle Fluo-4, oraz środek gaszący, a wszelkie pozostałości mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 dni.
3. Akwizycja danych
UWAGA: Przeprowadź akwizycję danych w dniu pomiaru efektów działania leku. Wykonaj kroki 3.1–.10 całkowicie dla pierwszej płytki komórki, a następnie powtórz je dla drugiej płytki komórki.
- Uruchom oprogramowanie czytnika płytek (jeśli jest to potrzebne) i załaduj końcówki pipet.
- Dostosuj ustawienia oprogramowania, aby zarejestrować 2-minutowy segment fal wapniowych z częstotliwością akwizycji co najmniej 10 Hz, aby określić podstawową szybkość dudnienia dla każdej studzienki.
- W przypadku jednej płytki komórkowej rozcieńczyć 3 ml podstawowej pożywki fluorescencyjnej w 12 ml ciepłej pożywki podtrzymującej z antybiotykami, aby uzyskać pożywkę fluorescencyjną.
- Zastąp 20 μl pożywki w każdym dołku płytki komórkowej 30 μl pożywki fluorescencyjnej.
- Pipeta w górę i w dół 1x, aby wymieszać.
- Umieść płytkę ogniwa w czytniku płytek tak szybko, jak to możliwe, aby hiPSC-CM mógł zaaklimatyzować się do temperatury.
- Odczekaj 60 minut przed rozpoczęciem pobierania danych.
- Rozpocznij akwizycję danych w oprogramowaniu czytnika płytek, aby zarejestrować 2-minutowy segment fal Ca z częstotliwością akwizycji co najmniej 10 Hz, aby określić podstawową szybkość dudnienia dla każdej studzienki.
UWAGA: Dla każdej sekwencji nagrywania, upewnij się, że płyta komórki nie jest automatycznie przenoszona z urządzenia po pobraniu danych. Zapobiega to wychładzaniu się płytki ogniwa w temperaturze pokojowej. W przypadku niektórych wersji oprogramowania do odczytywania płytek może być konieczne zatrzymanie każdego nagrania przed jego całkowitym zakończeniem, aby to osiągnąć. - Dodać związki testowe i referencyjne za pomocą robota czytnika płytek, pipetując 5 μl z płytki złożonej do dołka do płytki kuwety (po dodaniu stężenie DMSO wynosi 0,3% [v/v]).
- Rozpocznij akwizycję danych w oprogramowaniu czytnika płytek, aby zarejestrować 2-minutowe segmenty fal Ca, rozpoczynające się około 5, 15, 30, 45 i 60 minut po dodaniu związku (za każdym razem upewnij się, że płytka ogniwa pozostaje w urządzeniu).
4. Analiza danych
UWAGA: Analizę danych można przeprowadzić w dowolnym momencie po pomiarze.
- Eksportuj surowe dane dla każdego okresu nagrywania z oprogramowania czytnika płyt jako pliki tekstowe ASCII.
- Zaimportuj surowe dane do oprogramowania do analizy danych.
- Dla każdej studzienki i wszystkich punktów czasowych wyodrębnij pierwotną częstotliwość dudnienia.
UWAGA: Dzięki oprogramowaniu do analizy danych wymienionemu w Tabeli Materiałów, częstotliwości dudnień można obliczyć za pomocą niestandardowej procedury analizy przy użyciu funkcji LombPeriodogram, opartej na metodzie Lomba-Scargle'a analizy spektralnej najmniejszych kwadratów7. Periodogram należy obliczyć dla zakresu częstotliwości od 0,01 do 5 Hz. Częstotliwość pierwotną można wyodrębnić z periodogramu za pomocą procedur PeakAutoFind. Ta metoda analizy zapewnia dokładniejsze pomiary częstotliwości dudnień niż metoda dostarczana opcjonalnie z oprogramowaniem do odczytywania płytek. Jednak ten ostatni może być nadal używany, jeśli dostosowywanie oprogramowania nie jest opcją. - Eksportuj podstawowe częstotliwości dudnień dla każdego okresu nagrywania z oprogramowania do analizy danych jako kopie schowka lub jako pliki tekstowe ASCII.
- Zaimportuj podstawowe częstotliwości dudnień do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego przez wklejenie schowka lub import pliku tekstowego.
UWAGA: Kroki 4.5–4.9 można wykonać w dowolnym nowoczesnym oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. - Dla każdej studzienki znormalizuj do wartości wyjściowej częstotliwość dudnienia w każdym punkcie czasowym po zastosowaniu leku (5, 15, 30, 45 i 60 min), dzieląc pierwotną częstotliwość dudnienia w tym punkcie czasu przez pierwotną częstotliwość dudnienia na początku badania.
- Obliczyć średni efekt DMSO w każdym punkcie czasowym po zastosowaniu leku (5, 15, 30, 45 i 60 min), uśredniając znormalizowane wartości dla 20 dołków, w których zastosowano DMSO.
- Dla każdej studzienki i każdego punktu czasowego po zastosowaniu leku (5, 15, 30, 45 i 60 min) odejmij średni efekt DMSO (dopasowany w czasie) dla tej samej płytki.
- Uśrednij zduplikowane pomiary.
UWAGA: Jeśli związek zmienia częstotliwość lub oprogramowanie nie może znaleźć częstotliwości podstawowej po dodaniu złożonego, wizualne badanie wzorca dudnienia może ocenić, czy związek spowodował arytmie.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny zapis fal wapniowych (Ca) w stanie wyjściowym na jednej płytce 384-dołkowej. W większości przypadków we wszystkich dołkach obserwuje się regularną częstość skurczów przy niewielkiej zmienności w obrębie płytki (średnia ± SD = 40,1 ± 3,5 bpm; zakres = 34–54 bpm). Bardzo rzadko (w mniej niż 1 na 10 eksperymentów) w kilku dołkach (mniej niż 5) występuje arytmia lub brak rytmu. Na trzech płytkach 384-dołkowych przetestowano również kardiomiocyty od innego dostawcy (patrz Tabela materiałów) i uzyskano bardzo podobne wartości bazowe dla spontanicznego bicia.
Blokery kanałów jonowych serca wpływają na rytm kardiomiocytów w sposób powtarzalny5. Amlodypina, bloker wolnych kanałów Ca9, przyspiesza rytm o ponad 10% w sposób zależny od stężenia aż do 1 µM (Rysunek 2A). Efekt ten jest w pełni rozwinięty w ciągu pierwszych 5 min, jednak wzrasta on jeszcze o około 50% w ciągu kolejnych 30 min przed stabilizacją. Powyżej 1 µM amlodypina zatrzymuje bicie (linie przerywane), co jest spodziewane, biorąc pod uwagę, że cykl Ca jest krytyczny dla skurczów spontanicznych. Inne selektywne blokery kanałów Ca z grupy dihydropirydyn wywołują bardzo podobne efekty.
E-4031, bloker szybkich kanałów potasowych opóźnionego prostowania10, spowalnia rytm o około 65–70% w sposób zależny od stężenia, aż do poziomu 10 µM (Rycyna 2B). Efekt ten rozwija się w ciągu pierwszych 5 min i nie zmienia się w ciągu kolejnych 60 min. Inne selektywne blokery IKr wywołują podobne efekty, choć maksymalna redukcja częstotliwości może się różnić (np., 35–40% dla cisaprydu, 70% dla E-4031 oraz 90% - 95% dla dofetylidu). Przyczyna tej rozbieżności nie jest znana.
Tetrodotoksyna, bloker szybkich kanałów Na11, spowalnia rytm o około 15% w sposób zależny od stężenia, w zakresie od 1–30 µM (Rysunek 2C). Efekt ten rozwija się w pełni w ciągu pierwszych 5 min i nie zmienia się znacząco w ciągu kolejnych 60 min. Jednak powyżej 30 µM tetrodotoksyna zatrzymuje bicie w ciągu pierwszych 5 min, podczas gdy po 30 min zatrzymuje je przy stężeniu powyżej 1 µM. Inne blokery kanałów Na, takie jak lidokaina lub meksyletyna, wywołują podobne efekty typu wszystko albo nic.
Bepridil, mieszany bloker kanałów Na, Ca i K w sercu9, wywołuje również efekt wszystko albo nic (Rysunek 2D). Sugeruje to, że w tej preparacji głównym działaniem bepridilu jest blokada kanałów Na. Nie obserwuje się przyspieszenia wynikającego z blokady kanałów Ca, a bardziej stopniowe spowolnienie spowodowane blokadą IKr wydaje się być maskowane przez efekt blokady kanałów Na.
Rysunek 1: Reprezentatywne podstawowe fale Ca w obrębie płytki 384-dołkowej. (AWszystkie dołki na płytce wykazują regularną częstotliwość skurczów przy niewielkiej zmienności. Obraz ten został pobrany bezpośrednio z oprogramowania czytnika płytek. Każdy ślad ma czas trwania 10 s. Intensywność fluorescencji jest dowolna (względne jednostki światła pochodne skali szarości kamery wideo).BTo powiększenie jednego śladu z 10 s pokazuje niski poziom szumów sygnału. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne efekty działania blokerów kanałów jonowych serca. Panele te przedstawiają krzywe zależność odpowiedzi od stężenia z (A) selektywny bloker kanałów wapniowych amlodypinę, (B) selektywny bloker kanałów IKr E-4031, (C) selektywny bloker kanałów Na TTX oraz (D) nieselektywny bloker kanałów beprydyl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Dwa aspekty są najbardziej krytyczne dla udanego rejestrowania częstotliwości dudnień. Pierwszym z nich jest zachowanie ostrożności przy posiewaniu komórek i hodowli. W szczególności ważne jest, aby podczas wymiany pożywki starać się unikać zarysowania warstwy komórek na dnie studzienek. Dopuszczalne jest dotykanie pipetami dna studzienek, ale za każdym razem należy używać tego samego kąta, powodując w ten sposób jedynie niewielką rysę w warstwie komórek i nie wpływając na wydajność testu. Drugim krytycznym aspektem uzyskania powtarzalnych jednorodnych rytmów jest zapewnienie dobrej kontroli temperatury w temperaturze 37 °C na całej płytce celi przez cały czas trwania pomiaru. Nie udało nam się uzyskać tej jednorodności przy użyciu innych urządzeń niż zastosowany tutaj czytnik płytek, ale może to być wykonalne przy specjalnych modyfikacjach regulacji temperatury: sprawiłoby to, że przedstawiony tutaj protokół byłby bardziej użyteczny niż jedna marka czytnika płytek. Aby osiągnąć stabilność temperatury na czas trwania eksperymentu z użytym tutaj urządzeniem, konieczne było zatrzymanie każdego nagrania przed jego zakończeniem; W przeciwnym razie robot wysunąłby zmierzoną płytkę ogniwa. Ten problem techniczny może zniknąć wraz z następną wersją oprogramowania do odczytywania płyt, ale na razie pozostaje krytyczny. Jeśli płytka kuwety zostanie omyłkowo przeniesiona na zewnątrz czytnika płytek, należy ją jak najszybciej załadować z powrotem do środka. Niemniej jednak jakość eksperymentu ulegnie pogorszeniu, ponieważ zmiany temperatury niezwykle szybko wpływają na szybkość dudnienia.
Niektóre inne aspekty, które nie zostały dokładnie przetestowane, mogą być mniej ważne. Na przykład producenci hiPSC-CM zalecają powlekanie płytek do hodowli komórkowych przed wysiewem komórek, ale w tym konkretnym teście powlekanie nie zostało zastosowane, ponieważ komórki dość łatwo przylegają do różnych powierzchni i bardzo trudno jest prawidłowo pokryć płytki 384-dołkowe. Jednak powlekanie płytki komórkowej może być nadal dopuszczalne, a nawet może poprawić jakość testu. Nigdy również nie testowaliśmy, czy rozpuszczalniki inne niż DMSO byłyby dopuszczalne, ale na podstawie doświadczeń z innymi technologiami zapisu oczekuje się, że podobne stężenia EtOH lub MeOH również będą tolerowane. Zazwyczaj używamy hiPSC-CM tego samego producenta, a testowane były ogniwa tylko od jednego dodatkowego dostawcy, które wydawały się działać w podobny sposób. Podobnie, użyliśmy tylko niewielkiej liczby różnych partii hiPSC-CM, które zostały wybrane poprzez ich wstępne sprawdzenie w celu sprawdzenia, czy zachowują się podobnie do początkowej partii. Jedna lub dwie partie zostały uznane za nieodpowiednie, ponieważ ich syncytia miała słabą stabilność lub odtwarzalność w zastosowanych tutaj warunkach hodowli. Poza tym farmakologia wydawała się bardzo podobna we wszystkich partiach podczas testowania ograniczonego panelu "typowych" związków (forskolina, N6-cyklopentylo-adenozyna i E-4031, a także endotelina, izoproterenol, amlodypina i ponesimod). Użyliśmy tylko hiPSC-CM pochodzącego od zdrowych dawców. Być może warto ocenić, czy hiPSC-CM pochodzący od pacjentów z chorobami serca zapewni inne wyniki, chociaż nie zaobserwowano różnicy między zdrowymi dawcami a pacjentami podczas oceny kardiotoksyczności inhibitorów kinazy tyrozynowej12. Wreszcie, zwykle czekamy 22-28 dni w hodowli przed zmierzeniem efektów leku: w naszym doświadczeniu z zapisami impedancji tych samych komórek, stan ustalony dla niskiej impedancji (wskaźnik stabilności warstwy komórkowej) i szybkiej impedancji (wskaźnik częstotliwości dudnienia) jest osiągany po 12-15 dniach w hodowli. Zdecydowaliśmy się jednak poczekać 22–28 dni, ponieważ jest to czas, w którym profil ekspresji kanałów sercowych i markerów dojrzewania ustabilizował się13. Nie zbadano, czy porównywalne wyniki zostałyby uzyskane, gdyby ogniwa zostały użyte wcześniej lub później.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje bardzo prosty pomiar szybkości spontanicznego dudnienia hiPSC-CM w celu oceny potencjalnego wpływu leku na elektrofizjologię serca człowieka. Jej główne zalety w porównaniu z innymi metodologiami to: i) jest podatna na wysokoprzepustowe środowisko badań przesiewowych, ii) rejestruje aktywność kardiomiocytów i działanie leków w temperaturach fizjologicznych oraz iii) nie wymaga specjalistycznej wiedzy elektrofizjologicznej do wykonania lub oceny wyników.
W badaniu walidacyjnym przeprowadzonym z wieloma lekami zatwierdzonymi do stosowania u ludzi wykazaliśmy, że test reaguje na leki stosowane w medycynie ludzkiej, zgodnie z przewidywaniami wynikającymi z istniejących danych klinicznych5. Ponieważ metoda ta uwzględnia wszystkie potencjalne skutki dla rytmu serca, uzupełnia ona inicjatywę kompleksowego testu proarytmicznego in vitro ()14 , która w szczególności ocenia potencjał proarytmiczny.
W przyszłości metoda ta może dostarczyć dalszych informacji na temat sposobu działania leków, które wpływają na tempo spontanicznego dudnienia. Jest prawdopodobne, że dodatkowe informacje mechanistyczne są obecne w zapisach fluorescencyjnych stanów nieustalonych Ca (np. w ich amplitudzie lub kształcie). Jeśli zapisy fluorescencji są wykonywane z wyższymi szybkościami akwizycji (np. 30 Hz), parametry te są łatwe do wyodrębnienia oprócz szybkości dudnienia, a korelacja zmian tych parametrów ze znanymi efektami klinicznie stosowanych leków może być interesująca.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FDSS7000 czytnik płytek fluorescencyjnych | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | brak pozycji | |
| FDSS7000 zestaw filtrów fluorescencyjnych Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | zainstalowany początkowo w urządzeniu | |
| FDSS7000 regulatorem temperatury | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | A10118-09 | |
| FDSS7000 150-W wzbudzone źródło światła | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | C11653-11 | |
| FDSS7000 końcówki do pipet do płytek 384-dołkowych | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | A8687-62 | |
| Oprogramowanie do analizy przebiegów dla kardiomiocytów | Hamamatsu Photonics (Massy, Francja) | U8524-12 | opcjonalna alternatywa dla oprogramowania |
| Igor ProOprogramowanie do analizy danych Igor Pro | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) | Najnowsza wersja | |
| iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | zawiera komórki, posiewy i podłoża do konserwacji |
| Cor.4U Zestaw kardiomiocytów | Ncardia Niemcy (Kolonia, Niemcy) | Ax-B-HC02-4M | Zawiera komórki, pożywki galwaniczne i konserwacyjne alternatywa dla iCell-Cardiomyocytes |
| 384-dołkowe płytki do hodowli komórkowych | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Niemcy) | 781091 | |
| 384-dołkowe płytki złożone | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Niemcy) | 781280 | |
| FLIPR Zestaw do oznaczania wapnia 4 | Urządzenia molekularne (Sunnyvale, Kalifornia) | R8142 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Szwajcaria) | F6886 | |
| N6-cyklopentylo-adenozyna | Sigma-Aldrich (Buchs, Szwajcaria) | C8031 | |
| E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Szwajcaria) | BML-KC158 | |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Szwajcaria) | 15140-122 | |
| Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Szwajcaria) | 15250061 |
Bibliografia
- Guo, L. Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).
- Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes. Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).
- Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).
- Ma, J. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sube, R., Ertel, E. A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs. Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23(2017).
- Sirenko, O. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).
- VanderPlas, J. T. Understanding the Lomb-Scargle Periodogram. Cornell Univeristy Library. , arXiv:1703.09824 (2017).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).
- Ertel, E. A., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. Calcium Channel Blockers. Godfraind, T. , Springer. Basel, Switzerland. 11-80 (2004).
- Sanguinetti, M. C. Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs. Hypertension. 19, 228-236 (1992).
- Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels. Marine Drugs. 15 (10), (2017).
- Sharma, A. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Puppala, D. Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue. Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).
- CIPA. , Available from: http://cipaproject.org (2016).
Przedruki i uprawnienia
