Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58308

⸱

25 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy lokalizację immunofluorescencji dynaminy, aby zilustrować protokoły wykrywania białek w zatopionych w parafinie odcinkach najądrza myszy oraz tych z nieśmiertelnej linii komórek najądrza (mECap18). Opisano również protokoły izolacji białek wydzielniczych zarówno z płynu najądrza, jak i kondycjonowanych pożywek komórkowych.

Streszczenie

Najądrza ssaków wytwarza jeden z najbardziej złożonych płynów śródświetlnych spośród wszystkich gruczołów dokrewnych, aby wspierać dojrzewanie i magazynowanie plemników po jądrach. Taka złożoność wynika z połączonej aktywności wydzielniczej i absorpcyjnej komórek nabłonka wyściełającego. W tym miejscu opisujemy techniki analizy syntezy i wydzielania białek najądrza, koncentrując się na modelowej rodzinie białek mechanoenzymów dynaminy (DNM); duże GTPazy, które mają potencjał do regulowania dwukierunkowych zdarzeń transportu błonowego. W celu zbadania ekspresji białek w tkance najądrza opisujemy solidną metodologię znakowania immunofluorescencyjnego białek docelowych w skrawkach zatopionych w parafinie, a następnie wykrywania przestrzennego rozkładu tych białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Opisujemy również zoptymalizowaną metodologię izolacji i charakterystyki pęcherzyków podobnych do egzosomów, znanych jako najądrza, które są wydzielane do światła najądrza, aby uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej z dojrzewającymi plemnikami. Jako podejście uzupełniające opisujemy również immunofluorescencyjną detekcję białek docelowych w unieśmiertelnionej przez SV40 linii komórkowej nabłonka najądrza najądrza myszy (mECap18). Ponadto omówiono użyteczność linii komórkowej mECap18 jako odpowiedniego modelu in vitro, za pomocą którego można badać regulację aktywności wydzielniczej najądrza. W tym celu opisujemy wymagania dotyczące hodowli w celu utrzymania linii komórkowej mECap18 i stosowania selektywnych schematów hamowania farmakologicznego, które są w stanie wpływać na ich profil wydzielniczy białka. Te ostatnie można łatwo ocenić poprzez zbiór kondycjonowanej pożywki hodowlanej, stężenie wydzielanych białek poprzez wytrącanie kwasu trichlorooctowego/acetonu, a następnie ich analizę za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Twierdzimy, że te połączone metody są odpowiednie do analizy alternatywnych celów białkowych najądrza jako wstęp do określenia ich funkcjonalnej roli w dojrzewaniu i/lub przechowywaniu plemników.

Wprowadzenie

Plemniki wszystkich gatunków ssaków nabywają zdolność do wykazywania postępującej ruchliwości do przodu i zapłodnienia komórki jajowej podczas ich długotrwałego zejścia przez najądrze, wysoce wyspecjalizowany obszar męskiego systemu przewodów pozajądrowych, którego nawigacja może zająć 7 - 14 dni (w zależności od gatunku)1. Ze względu na ekstremalną kondensację ojcowskiej chromatyny i zrzucanie większości cytoplazmy, która towarzyszy cytoróżnicowaniu plemników w jądrach, ich późniejsze dojrzewanie funkcjonalne jest napędzane wyłącznie przez ich interakcję z mikrośrodowiskiem najądrza. Środowisko to jest z kolei tworzone przez aktywność wydzielniczą i absorpcyjną wyściółki somy najądrza i wykazuje wyjątkowy poziom zmienności segment-segment1. Tak więc najbardziej aktywnymi segmentami pod względem syntezy i wydzielania białek są te zlokalizowane w proksymalnej części najądrza (a mianowicie w ogonie i ciałie)2. Aktywność ta odzwierciedla profil funkcjonalny plemników, przy czym komórki po raz pierwszy zaczynają wykazywać cechy kompetencji funkcjonalnej (tj. ruchliwość postępową i zdolność do wiązania się z rozpuszczonymi w kwasie glikoproteinami zona) po przejściu przez najądrza caput epi�ymis3. Te atrybuty funkcjonalne nadal się rozwijają, zanim osiągną optymalny poziom, gdy plemniki docierają do dystalnego segmentu najądrza (ogona), w którym są przechowywane w stanie spoczynku w gotowości do wytrysku. Tworzenie i utrzymywanie tego zbiornika do przechowywania plemników jest również ściśle związane z nabłonkiem wyściółkowym, który w ogonie jest zdominowany przez silną aktywność absorpcyjną4,5. Chociaż zgłoszono różnice anatomiczne6,7,8, taki regionalny podział pracy wydaje się być cechą charakterystyczną najądrza, która jest wspólna dla większości badanych do tej pory gatunków ssaków, w tym naszego własnego9,10. Rzeczywiście, z klinicznego punktu widzenia wiadomo, że dysfunkcja najądrza ma istotny wpływ na etiologię niepłodności czynnika męskiego11, podkreślając w ten sposób znaczenie zrozumienia regulacji tej wyspecjalizowanej tkanki.

Szkoda zatem, że nasze zrozumienie fizjologii najądrza i mechanizmów regulujących kolejne fazy dojrzewania i przechowywania plemników w tej tkance pozostaje do pełnego rozwiązania. Wśród czynników ograniczających postępy w badaniach nad najądrzami jest ogólna złożoność tej tkanki oraz znajomość mechanizmów, które sprawują kontrolę regulacyjną nad jej mikrośrodowiskiem świetlnym. Anatomicznie wiemy, że poza rozróżnieniem segmentów caput, body i cauda, najądrza można dalej podzielić na kilka stref (Ryc. 1A), z których każda jest oddzielona przez septa12 i charakteryzowana dyskretnymi profilami ekspresji genów/białek13,14,15,16,17,18. Rzeczywiście, na podstawie szczegółowego profilowania transkrypcyjnego segmentalnej ekspresji genów w najądrzach, w modelach myszy i szczurów zgłoszono aż 6 i 9 odrębnych stref najądrza, odpowiednio19,20. Taka złożoność prawdopodobnie odzwierciedla skład somy najądrza, pseudostratyfikowanego nabłonka obejmującego wiele różnych typów komórek; każdy z nich różni się pod względem liczebności, rozmieszczenia i działań wydzielniczych/absorpcyjnych na całej długości obwodu. Tak więc główne komórki są zdecydowanie najliczniejszym typem komórek najądrza, stanowiącym ponad 80% wszystkich komórek nabłonkowych. W związku z tym główne komórki są odpowiedzialne za większość biosyntezy i wydzielania białek najądrza5. W przeciwieństwie do tego, populacja komórek czystych, które są drugim najliczniejszym typem komórek w somie najądrza, jest przede wszystkim zaangażowana w selektywną absorpcję składników luminalnych i zakwaszenie tego mikrośrodowiska5. Dodając kolejny poziom złożoności, androgeny i inne czynniki lumikrynowe pochodzenia jądrowego wywierają różnicową kontrolę nad każdym z tych typów komórek najądrza w zależności od ich położenia wzdłuż drogi.

Pomimo ograniczeń nałożonych przez taką złożoność, nadal czynione są znaczące postępy w rozwiązywaniu mechanistycznych podstaw funkcji najądrza. Kluczem do tych badań było zastosowanie zaawansowanych strategii spektrometrii mas w celu ustalenia inwentaryzacji proteomu najądrza na szeroką skalę, w połączeniu ze szczegółowymi analizami poszczególnych białek wybranych spośród tych wstępnych badań. Ilustracją tego podejścia jest nasza niedawna charakterystyka rodziny mechanoenzymów DNM w modelu myszy21. Nasze początkowe zainteresowanie DNM było napędzane jego podwójnym działaniem w sprzężeniu procesów egzo- i endocytotycznych. Opierając się na tych obserwacjach, byliśmy w stanie wykazać, że trzy kanoniczne izoformy DNM (DNM1 - DNM3) są wysoce eksprymowane w najądrzu myszy i odpowiednio ustawione do pełnienia ról regulacyjnych w wydzielaniu i wchłanianiu białek21. Co więcej, byliśmy w stanie wyraźnie rozróżnić każdą izoformę DNM na podstawie ich lokalizacji komórkowej i subkomórkowej, sugerując w ten sposób, że posiadają one komplementarną, a nie nadmiarową aktywność w obrębie nabłonka najądrza21.

Tutaj opisujemy eksperymentalną metodologię zastosowaną do badania ekspresji DNM w najądrzach myszy z nadzieją, że ta informacja znajdzie szersze zastosowanie w charakterystyce alternatywnych białek najądrza i tym samym przyczyni się do naszego zrozumienia funkcji tego ważnego elementu męskiego układu rozrodczego. W szczególności opisujemy rozwój solidnej metodologii znakowania immunofluorescencyjnego białek docelowych w skrawkach najądrzy zatopionych w parafinie, a następnie wykrywanie przestrzennego rozkładu tych białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dalej dokumentujemy nasze ostatnio zoptymalizowane protokoły22 do izolacji i charakterystyki najądrzy; Małe pęcherzyki podobne do egzosomów, które stanowią kluczowe elementy profilu wydzielniczego najądrza i wydają się odgrywać znaczącą rolę w promowaniu dojrzewania plemników23. Jako podejście uzupełniające opisujemy również immunofluorescencyjne wykrywanie białek docelowych w unieśmiertelnionej linii komórkowej nabłonka najądrza najądrza myszy (mECap18) oraz wykorzystanie tego zasobu jako modelu do zbadania regulacji aktywności wydzielniczej najądrza in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne związane z pobieraniem tkanek zwierzęcych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle.

1. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków najądrza zatopionych w parafinie (ryc. 1 i 2)

  1. Bezpośrednio po eutanazji dorosłych myszy poprzez wdychanie CO2 (myszy szwajcarskie, w wieku powyżej 8 tygodni), ostrożnie wypreparuj najądrze (za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety) z leżącej tkanki łącznej i tłuszczu i zanurz w roztworze utrwalającym Bouina (> dziesięciokrotność objętości / masy tkanki) w celu utrwalenia na noc.
  2. Umyj tkankę 70% etanolem z 2× zmianami dziennie przez 2 dni, a następnie odwodnij przez klasyfikowany etanol (70%, 95% i 100%) w ramach przygotowań do infiltracji i zatopienia w bloku parafiny.
  3. Bloki parafiny należy rozdrobnić na grubość 4-6 μm i zamontować na szkiełkach w ramach przygotowań do barwienia immunofluorescencyjnego.
  4. W dygestorium odparafiny odparafiny najądrza należy odparafiny, dodając wystarczającą ilość ksylenu do słoika ze szkiełkiem, aby całkowicie zanurzyć wycinek tkanki (3× 5 minut za każdym razem).
  5. Ponownie uwodnić skrawki tkanki przez zanurzenie w stopniowanych roztworach etanolu rozcieńczonych w oczyszczonymH2O(100% etanol 5 min, 100% etanol 5 min, 90% etanol 1 min, 80% etanol 1 min, 70% etanol 1 min i 50% etanol 1 min).
  6. Umyj skrawki w słoiku na szkiełko raz przez 5 minut wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby całkowicie zanurzyć cały fragment tkanki (postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami dla wszystkich kolejnych płukań).
  7. Zdekantować odpowiedni roztwór do odzyskiwania antygenu (tj. 10 mmol/l cytrynianu sodu, 50 mmol/l Tris pH 10,5 lub alternatywny roztwór (roztwory) do pobierania antygenu, w zależności od antygenu, który ma być wykryty) do stojaka na szkiełka i kuchenki mikrofalowej do wrzenia. Zanurz szkiełka w tym roztworze i poddaj skrawki tkanki warunkom pobierania antygenu wywołanym ciepłem, zoptymalizowanym dla poszczególnych przeciwciał (patrz Tabela 1).
    Ostrzeżenie: Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w roztworze do pobierania antygenu podczas procesu pobierania antygenu.
  8. Wyjmij pojemnik na szkiełka z kuchenki mikrofalowej i ostudź do temperatury pokojowej.
  9. Przepłukać szkiełka za pomocą PBS i użyć płynobiegowego markera do szkiełka, aby obrysować okolice tkanki.
  10. Umieścić szkiełka w nawilżonym pojemniku (utworzonym przez zwilżoną tkankę u podstawy pojemnika) i zastosować roztwór blokujący (3% BSA/PBS, uprzednio przefiltrowany przez filtr 0,45 μm) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  11. Przepłukać szkiełka jeden raz za pomocą PBS.
  12. Inkubować skrawki z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym do eksperymentalnie zoptymalizowanego stężenia w przefiltrowanym 1% BSA/PBS w temperaturze 4 °C przez noc (1:60 dla przeciwciał anty-DNM1, DNM2 i DNM3; 1:100 dla przeciwciał anty-ATP6V1B1, szczegóły dotyczące przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów).
    Uwaga: Aby odróżnić wiązanie przeciwciał swoistych od nieswoistych, konieczne jest uwzględnienie rygorystycznie ujemnych (tj. tylko przeciwciało drugorzędowe, przeciwciało pierwszorzędowe wstępnie wchłonięte przeciwko peptydowi uodparniającemu) i kontroli pozytywnych24.
  13. Rozgrzej szkiełka, umieszczając je w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  14. Myć szkiełka 3× za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 10 minut każda.
  15. Inkubować skrawki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 1% BSA/PBS (przefiltrowanym przez filtr 0,45 μm) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (rozcieńczenie 1:400 dla wszystkich przeciwciał drugorzędowych, szczegóły dotyczące przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów).
    UWAGA: Począwszy od tego kroku, pojemnik na slajdy należy przechowywać w ciemności. W przypadku podwójnego znakowania należy wybrać kompatybilną kombinację przeciwciał drugorzędowych (tj. przeciwciała drugorzędowe muszą być wytworzone u różnych gatunków).
  16. Myć szkiełka 3× za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 10 minut każda.
  17. Wybarwić skrawki jodkiem propidyny (PI, 7,48 μmol/l) lub 4 ́,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI, 4,37 μmol/l) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu oznaczenia jądra komórkowego.
  18. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 5 minut każda.
  19. Zamontuj sekcje z 10% Mowiol 4-88 przygotowanym w roztworze 30% glicerolu w 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) i 2,5% 1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktanowym.
  20. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do obserwacji w przyszłości.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie obrazowania preparatów tak szybko, jak to możliwe po przygotowaniu, aby uniknąć nadmiernej utraty fluorescencji.

2 Izolacja najądrzy z najądrza myszy (Rysunek 3)

  1. Bezpośrednio po eutanazji dorosłych myszy poprzez inhalację CO2 (myszy szwajcarskie w wieku powyżej 8 tygodni) należy przeprowadzić perfuzję ich naczyń krwionośnych za pomocą PBS (wstępnie podgrzanego do 37 °C), aby zminimalizować zanieczyszczenie krwi tkanką najądrza.
    UWAGA: Osocze krwi zawiera różne populacje egzosomów, które są podobnej wielkości do epijąposomów25. Skuteczność usuwania krwi z tkanki najądrza można uzyskać poprzez inspekcję początkowego segmentu, wysoce unaczynionego segmentu najądrza położonego proksymalnie do segmentu kaputowego (tj. Strefa 1 w Rysunek 1A)
  2. Ostrożnie wypreparuj najądrze z pokrywającego go tłuszczu i tkanki łącznej, a następnie spłucz zmodyfikowanym podłożem Biggersa, Whittena i Whittinghama (BWW; pH 7,4, osmolalność 300 mmol/kg wody26,27), aby zmniejszyć ryzyko powierzchniowego zanieczyszczenia krwi.
  3. Osusz tkankę najądrza, aby usunąć nadmiar pożywki, rozetnij najądrza caput (tj. strefy 2-5 w Rysunek 1A) i przenieś na świeżą szalkę Petriego (35 × 10 mm) zawierającą pożywkę BWW. Upewnij się, że ilość podłoża jest wystarczająca do ostatecznego odzyskania.
    Uwaga: W przypadku 6 najądrzy caput zaleca się użycie 1,1 ml pożywki, aby umożliwić odzyskanie ~900 μl, które jest następnie równomiernie dzielone i nakładane na 2 wcześniej przygotowane gradienty (patrz krok 2.9).
  4. Wykonaj kilka małych nacięć w tkance caput za pomocą żyletki. Nie rozdrabniaj tkanki, a tym samym unikaj zanieczyszczenia próbki nadmierną zawartością cytozolu. Inkubować płytkę zawierającą tkankę z łagodnym mieszaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu uwolnienia zawartości światła.
  5. Przefiltruj powstałą zawiesinę przez membrany 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
  6. Zebrać filtrat i poddać go kolejnym etapom wirowania w temperaturze 4 °C ze zwiększającą się prędkością w celu wyeliminowania resztek komórkowych (tj. 500 × g, 2 000 × g, 4 000 × g, 8 000 × g, 5 min każdy; 17 000 × g przez 20 minut, a na koniec 17 000 × g przez dodatkowe 10 minut lub do momentu, gdy po odwirowaniu nie powstanie osadek).
    UWAGA: Ważne jest, aby ocenić kolor osadu po początkowym etapie wirowania 500 × g, aby upewnić się, że występuje minimalne zanieczyszczenie krwi. Wyrzucić wszystkie próbki, w których ten osad wykazuje różowe zabarwienie.
  7. Przygotować nieciągłe gradienty jodiksanolu (składające się z 40%, 20%, 10%, 5% warstw) przez rozcieńczenie pożywki o gradionym gradienci gęstości (zawierającej 60% (w/v) wodnego roztworu jodiksanolu) roztworem 0,25 mol/l sacharozy i 10 mmol/l Tris (pH 7,5).
  8. Przygotować gradient w probówce ultrawirówkowej (11 × 35 mm), z każdą frakcją 450 μl (Rysunek 3). Sprawdź wzrokowo gradient po nałożeniu każdej frakcji, aby upewnić się, że interfejsy zostały pomyślnie utworzone między każdą warstwą przed załadowaniem próbki płynu najądrza. Przygotować każdy gradient na świeżo w dniu użycia, jednak próbkę płynu świetlnego najądrza można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 godzin przed załadowaniem.
  9. Ostrożnie dodać 450 μl zawiesiny płynu świetlnego najądrza (odpowiadającej materiałowi pobranemu z caput 3 najądrzy) na szczycie pojedynczego gradientu.
  10. Ultraodwirować gradienty w temperaturze 160 000 × g w temperaturze 4 °C przez 18 h.
    UWAGA: Ponieważ wirowanie to odbywa się z bardzo dużą prędkością, wszystkie probówki ultrawirówek muszą być sparowane i precyzyjnie wyważone. Sprawdź rurki, aby upewnić się, że są wolne od widocznych uszkodzeń, które mogłyby zagrozić ich integralności.
  11. Delikatnie usuń 12 równych frakcji (każda składa się z 185 μl), zaczynając od najwyższej warstwy i postępując w kierunku dołu gradientu. W stosownych przypadkach należy zgrupować równoważne frakcje odzyskane z każdego gradientu (do dwóch spadków).
    Uwaga: Mysie najądrza są najbardziej wzbogacone we frakcjach 9 - 1122, patrz Rysunek 4 i dyskusja.
  12. Po odzyskaniu i połączeniu frakcji 9 – 11 rozcieńczyć do 2 ml PBS i ultraodwirować próbki w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C przez 3 godziny (probówka 13 × 56 mm) w celu osadzenia najądrzy.
    UWAGA: Ponieważ osad najądrza może być trudny do zauważenia, upewnij się, że orientacja rurek jest odnotowana podczas umieszczania ich w wirniku i zaznacz rurkę, aby wskazać oczekiwaną pozycję osadu najądrza. Upewnij się, że każda rurka zawiera wystarczającą objętość (tj. przekraczającą 50% jej całkowitej pojemności), aby wykluczyć ryzyko zapadnięcia się rurki.
  13. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu najądrza.
  14. Oceń czystość najądrza (Rysunek 4).
  15. Zawiesić osad najądrza w żądanym podłożu zgodnie z dalszymi aplikacjami. Na przykład, pożywka BWW jest zwykle stosowana w eksperymentach obejmujących jednoczesną inkubację z plemnikami lub alternatywnie odpowiedni bufor do lizy w ramach przygotowań do ustąpienia proteomu najądrza za pomocą SDS-PAGE.

3. Barwienie immunofluorescencyjne komórek mECap18

  1. Przygotowanie sterylnych szkiełek nakrywkowych (do przeprowadzenia w kapturze do hodowli komórkowych)
    1. Namocz szkiełka nakrywkowe (12 × 12 mm) w 70% etanolu na 10 minut i zdezynfekuj przez suszenie w wysokiej temperaturze nad lampą etanolową.
    2. Schłodzić szkiełko nakrywkowe przez 10 s przed przeniesieniem do płytki 12-dołkowej.
    3. Nałożyć sterylny roztwór poli-L-lizyny na przykrycie szkiełka nakrywkowego i odstawić na 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić roztwór poli-L-lizyny i przepłukać szkiełko nakrywkowe sterylnymH2Olub odpowiednim podłożem.
  2. Przygotowanie komórek mECap18
    1. Umieścić podwielokrotności 2 × 10 5 komórek mECap18 w każdym dołku płytki 12-dołkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe.
    2. Hodowla komórek za pomocą pożywki komórkowej mECap18 (DMEM uzupełniony 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu, 1% penicyliny/streptomycyny i 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-onC-IIIN) zawierających 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc.
    3. Gdy komórki przylgną do szkiełka nakrywkowego, wyrzuć pożywkę i dwukrotnie przepłucz komórki PBS.
    4. Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS, aby zanurzyć całe szkiełko nakrywkowe i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    5. Wylać roztwór PFA i dwukrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe w PBS.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Przepuszczalność komórek mECap18 przez zanurzenie w 0,1% Triton X-100 w PBS na 10 minut.
    2. Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS.
    3. Zablokuj komórki mECap18 za pomocą 3% BSA i przystąp do znakowania immunologicznego komórek, wykorzystując protokoły równoważne do opisanych dla odcinków tkanki najądrza.

4. Izolacja białek z kondycjonowanej pożywki do hodowli komórkowych

  1. Pobieranie kondycjonowanej pożywki do hodowli komórkowych
    1. Pasaż 4 × 10 5 komórek mECap18 w każdym dołku na płytce 6-dołkowej z pożywką komórkową mECap18 uzupełnioną 10% FBS przez 24 godziny.
    2. Umyj komórki mECap18 trzykrotnie pożywką komórkową mECap18 (przygotowaną bez FBS) w celu usunięcia pozostałości FBS i wszelkich związanych z nim zanieczyszczeń białkowych.
    3. Dodać 1,5 ml pożywki komórkowej mECap18 (przygotowanej bez FBS) do każdej studzienki i inkubować z komórkami mECap18 przez 12 godzin w inkubatorze w temperaturze 37°C w temperaturze 5% CO2,
      Uwaga: Komórki mECap18 na tym etapie mogą być oceniane pod kątem różnych antygenów docelowych zgodnie z projektem eksperymentalnym.
    4. Po 12 godzinach inkubacji zebrać pożywkę komórkową i odwirować w stężeniu 2 000 × g przez 10 minut, aby usunąć wszystkie resztki komórkowe.
      Uwaga: Czas trwania inkubacji może być zmieniany zgodnie z planem doświadczalnym/oceną punktu końcowego oraz z uwzględnieniem tolerancji komórki na zastosowane leczenie. Zaleca się dostosowanie czasu inkubacji w oparciu o określone schematy doświadczalne, aby zapewnić osiągnięcie optymalnych wyników.
    5. Oceń żywotność komórek mECap18 za pomocą standardowego testu wykluczania błękitu trypanowego28. Wyrzuć cały materiał, w którym żywotność komórek spadła poniżej 90%, aby wyeliminować odchylenia wprowadzone przez białka uwolnione z martwych lub umierających komórek.
    6. Wyizolować białka z pożywki komórkowej w następujący sposób lub zakonserwować pożywkę w temperaturze -80 °C.
  2. Izolacja białek (do przeprowadzenia w dygestorium)
    1. Dodać 20% objętości schłodzonego 100% kwasu trichlorooctowego do 80% objętości kondycjonowanej pożywki komórkowej, aby wytrącić białka uwolnione z hodowanych komórek mECap18. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, stale mieszając.
    2. Po inkubacji, białko wytrącone w osadach przez odwirowanie (17 000 × g, 4 °C przez 10 min).
      Uwaga: Ze względu na ograniczoną ilość białka, które ma być wydzielane do pożywki, możliwe jest, że osad nie będzie łatwo uwidoczniony po odwirowaniu. Dlatego konieczne jest prawidłowe ustawienie probówki przed odwirowaniem i ostrożnie, aby nie zakłócić miejsca oczekiwania na osad podczas usuwania supernatantu.
    3. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad schłodzonym acetonem przed ponownym odwirowaniem (17 000 × g, 4 °C przez 10 minut).
    4. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant przed wysuszeniem na powietrzu wszelkich pozostałości acetonu w dygestorium.
    5. Zawiesić osad białkowy w odpowiednim buforze ekstrakcyjnym w celu przygotowania do analizy końcowej w celu wykrycia pełnych profili białek wydzielniczych i/lub poszczególnych białek docelowych (np. SDS-PAGE, immunoblotting).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 oraz Rysunek 2 przedstawiają reprezentatywne wyniki lokalizacji immunofluorescencyjnej DNM w głowie najądrza myszy. Każda z trzech badanych izoform DNM wykazuje odmienne profile lokalizacji. Tak więc DNM1 charakteryzuje się stosunkowo umiarkowanym, rozproszonym znakowaniem komórek najądrza w obrębie segmentu początkowego i głowy najądrza (Rysunek 2A). W przeciwieństwie do n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania te obejmowały wykorzystanie utrwalonej tkanki najądrza Bouina, która została poddana zatapianiu parafiny i standardowym protokołom sekcji. Roztwór utrwalający Bouina składa się z mieszaniny formaldehydu, kwasu pikrynowego i kwasu octowego, przy czym każdy składnik ma określoną i komplementarną funkcję. W ten sposób formaldehyd reaguje z aminami pierwszorzędowymi, tworząc wiązania krzyżowe białek, kwas pikrynowy powoli wnika w tkankę, tworząc sole, a tym samym koagulację podstawowych białek i odwrotnie, kwas octow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Narodowej Radzie Zdrowia i Badań Medycznych Australii APP1103176 za wsparcie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało Dynamin 1Abcamab108458Gatunek żywiciela: Królik, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalne
przeciwciało Dynamin 2Santa Cruzsc-6400Gatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, Klasa: przeciwciało poliklonalne
Dynamin 3Proteintech14737-1-APsilny>Gatunek żywiciela: Królik, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalne
przeciwciało ATP6V1B1Santa Cruzsc-21206Gatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalne
przeciwciało CD9BD Pharmingen553758Gatunek gospodarza: Szczur, Izotyp: IgG, Klasa: monoklonalne
przeciwciało flotylliny-1SigmaF1180Gatunek żywiciela: Królik, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalne
przeciwciało ALOX15Abcamab80221Gatunek gospodarza: Królik, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalne
przeciwciało TUBBSanta Cruzsc-5274Gatunek gospodarza: Mysz, Izotyp: IgG, Klasa: przeciwciało monoklonalne
PSMD7Abcamab11436Gatunek żywiciela: Królik, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalny
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Gatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalny
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Gatunek żywiciela: Osioł, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalny
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Gatunek żywiciela: Osioł, Isotyp: IgG, klasa: poliklonalna
przeciw szczurom Alexa Fluor 594ThermoA11007gatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalny
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LGatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, klasa: poliklonalna
anty szczura HRPMilliporeDC01Lgatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, Klasa: poliklonalny
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Gatunek żywiciela: Koza, Izotyp: IgG, klasa: poliklonalna
4', 6-diamidyn-2-fenyloindolowa (DAPI)SigmaD9564
jodek propydyny (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906
płodowa surowica bydlęca (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutaminaThermo25030-081
penicylina/streptomycynaThermo15140-122
5&alfa;-androstan-17β-ol-3-onC-IIINSigmaA8380
pirogronian soduThermo11360-070
Trypsyna-etylenodiaminatetraoctowa kwas (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyd (PFA)EMS15710
KsylenVWR Chemicals1330-20-7
EtanolVWR Chemicals64-17-5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)SigmaP4417
Cytrynian soduSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlicerolSigmaG5516
1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktanSigmaD2522
Poli-L-gizynaSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan niebieskiSigmaT6146
Kwas trichlorooctowySigmaT9159
AcetonAjax FinechemA6-2,5 L GL
SacharozaSigmaS0389
Poly (alkohol winylowy)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Mikroskopia fluorescencyjnaZeissZeiss Axio Imager A1
UltrawirówkaBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MikrowirówkiEppendorf5424R
InkubatorHeracell150
Duża wytrząsarka orbitalnaRatekOM7
MikrofalówkaLGMS3840SR /00
Laboratoryjny miernik pHLabPHM220
Płynoodporny marker do slajdówDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
Płytka 6-dołkowaCELLSTAR657160
Płytka 12-dołkowaCELLSTAR665180
SzkiełkoSlide Mikro-GlassSF41296PLMK
0,45 i mikro; m filtrMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Probówka ultrawirówkowa (2,2 ml, 11 &; 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Probówka do ultrawirówek (3,2 ml, 13 &; 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Sitko komórkowe 70 µ m NylonFALCON352350
szalka Petriego 35 & razy; 10 mm z krzywkamiSARSTED82.1135.500
Słoik przesuwnyTRAJAN#23 319 00
<

Bibliografia

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia immunofluorescencyjnaizolacja epididymosom wgradient ultrawirowanialinia kom rkowa mECap18znakowanie immunofluorescencyjneanaliza sekrecji bia ekimmunoblotting SDS PAGEwytr canie kwasem tr jchlorooctowymsekcja tkanki naj drza
Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.