Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58317

⸱

12 sierpnia 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowany jest przepływ pracy wykorzystujący cytometrię przepływową lub wirowanie różnicowe do wykrywania, ilościowego oznaczania i izolowania ciał apoptotycznych z próbki apoptotycznej do wysokiej czystości.

Streszczenie

Ciała apoptotyczne (ApoBDs), mikropęcherzyki i egzosomy są kluczowymi członkami rodziny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, przy czym ApoBDs są jednym z największych. Zaproponowano, że ApoBD mogą wspomagać usuwanie komórek, a także komunikację międzykomórkową poprzez transport biomolekuł. Konwencjonalne podejścia stosowane do identyfikacji i izolacji ApoBD są często ograniczone ze względu na brak dokładnej kwantyfikacji i niską czystość próbki. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy w celu potwierdzenia indukcji apoptozy, walidacji powstawania ApoBD i wyizolowania ApoBD do wysokiej czystości. Przedstawimy również i porównamy metody sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i wirowania różnicowego w celu wyizolowania ApoBDs. Ponadto czystość wyizolowanych ApoBD zostanie potwierdzona przy użyciu wcześniej ustalonej metody barwienia i analizy opartej na cytometrii przepływowej. Podsumowując, przy użyciu opisanego podejścia, indukowano i zwalidowano apoptozę monocytów THP-1 i rozkład komórek apoptotycznych, a ApoBD wyizolowano z monocytów THP-1 do czystości 97-99%.

Wprowadzenie

Apoptoza, dobrze zbadana forma programowanej śmierci komórki, jest niezbędna do utrzymania fizjologicznej homeostazy i usunięcia potencjalnie szkodliwych komórek w ludzkim ciele1. Po indukcji apoptozy komórki apoptotyczne (ApoCells) mogą przejść szereg zmian morfologicznych i rozpadnąć się na małe pęcherzyki związane z błoną, zwane ApoBDs. Ogólnie rzecz biorąc, proces ten jest znany jako demontaż komórek apoptotycznych i można go podzielić na 3 odrębne etapy w zależności od morfologii2,3. Krok 1 (pęcherzyki błony komórkowej) charakteryzuje się tworzeniem na powierzchni komórki struktur przypominających balony, znanych jako pęcherzyki4,5. Krok 2 (tworzenie wypukłości apoptotycznej) obejmuje tworzenie długich wypukłości błonowych, takich jak apoptopodia, apoptopodia z koralikami i kolce mikrotubul6,7,8. Wreszcie, Krok 3 (tworzenie ApoBD) obejmuje fragmentację apoptotycznych wypukłości i/lub ApoCells w celu wygenerowania ApoBDs6,9. Wcześniejsze odkrycia sugerowały rolę ApoBD we wspomaganiu apoptotycznego usuwania komórek i pośredniczeniu w komunikacji międzykomórkowej. Na przykład, sugeruje się, że fragmentacja ApoCell na ApoBD może generować małe kawałki "wielkości kęsa", które można łatwo usunąć przez otoczenie fagocytów2,10,11. Ponadto ApoBD mogą zawierać szereg biomolekuł, takich jak DNA, RNA i białka, które mogą być transportowane do otaczających komórek, aby ułatwić komunikację między komórkami12,13,14. Aby funkcjonalnie zbadać te procesy, konieczne jest potwierdzenie trzech kluczowych parametrów, w tym (i) walidacji indukcji apoptozy i tworzenia ApoBD, (ii) izolacji ApoBD oraz (iii) potwierdzenia czystości ApoBD.

Poprzednio, wiele metod, w tym cytometria przepływowa i mikroskopia elektronowa, były używane do badania apoptozy i ApoBDs15,16,17,18. Jednak wykrywanie i kwantyfikacja ApoBD są często trudne lub pomijane. Na przykład najczęściej stosowany test apoptozy oparty na cytometrii przepływowej wykorzystuje aneksynę V (A5, białko, które wiąże eksternalizację sygnału "zjadaj mnie" fosfatydyloserynę (PtdSer)) i jodek propidium barwienia kwasem nukleinowym (PI)19. Jednak przy użyciu tej uniwersalnej kombinacji barwienia analiza zakłada, że w próbce występują tylko trzy typy podzbiorów komórek (komórki żywotne, ApoCells i komórki martwicze). Ponadto, choć przez wielu badaczy uważa się je za "złoty standard" w odniesieniu do apoptozy, testy cytometrii przepływowej i późniejsza analiza danych często wykluczają ApoBD poprzez początkowy etap bramkowania, wybierając zdarzeniapośredniego wzrostu FSC/SSC. Dlatego niedawno opracowaliśmy nowatorski test cytometrii przepływowej przy użyciu A5 i TO-PRO-3, innego barwienia nukleinowego, które może być selektywnie wychwytywane przez kanały aktywowanej kaspazą 3/7 pannexin 1 (PANX1) 7,20. Ponieważ aktywacja PANX1 indukowana kaspazą 3 poprzedza ekspozycję na PtdSer we wczesnym stadium apoptozy, TO-PRO-3 w różny sposób barwi komórki apoptotyczne i martwicze. Ponadto podejście to w połączeniu z naszą nowatorską strategią bramkowania obejmuje wszystkie zdarzenia uzyskane podczas analizy danych, w wyniku czego identyfikowanych jest sześć podzbiorów komórek/cząstek, w tym: (i) żywotne komórki (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5niskie, TO-PRO-3niskie), (ii) A5- wczesne ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5niskie, TO-PRO-3pośrednie), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5wysoki, TO-PRO-3pośredni), (iv) komórki martwicze lub późne ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5wysokie, TO-PRO-3wysokie), (v) ApoBD (FSC/SSC niskie, A5pośrednie, TO-PRO-3niskie/pośrednie) i (vi) zanieczyszczenia (FSC/SSCniskie, A5niskie, TO-PRO-3niskie)20. Nasze podejście podkreśla znaczenie analizy wszystkich podzbiorów komórek/cząstek oraz, co ważniejsze, oddzielenia ApoBD od komórek i szczątków20. W ten sposób podejście to demonstruje skuteczną technikę walidacji jednoczesnej indukcji apoptozy i powstawania ApoBD.

Tradycyjnie, ApoBDs były izolowane za pomocą różnych metod wirowania różnicowego, dzięki którym ApoBDs mogą być oddzielane od komórek lub innych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w zależności od gęstości. Jednak takie metody wirowania są często ograniczone przez niską czystość ApoBD, brak etapu kwantyfikacji w celu potwierdzenia czystości próbki i/lub niemożność oddzielenia ApoBDs-specific dla typu komórki17,21,22. Dlatego niedawno opracowaliśmy dwa podejścia, oparte na FACS i nowe podejście oparte na wirowaniu różnicowym, które można połączyć z naszą wcześniej ustaloną metodą cytometrii przepływowej w celu walidacji indukcji apoptozy i czystości próbki23. Izolacja ApoBD za pomocą naszego podejścia opartego na FACS może wzbogacić ApoBD do czystości do 99% i może być sprzężona z różnymi przeciwciałami specyficznymi dla typu komórki w celu wyizolowania ApoBD z mieszanych populacji komórek, próbek tkanek i płynów ustrojowych23. Co więcej, nasze zmienione podejście do wirowania różnicowego demonstruje skuteczną metodę izolowania ApoBD do czystości >90%23.

W tym artykule szczegółowo opisujemy naszą eksperymentalną procedurę walidacji indukcji apoptozy oraz wykrywania i ilościowego określania powstawania ApoBD. Omówiono również procesy izolacji ApoBD przy użyciu metod opartych na FACS i wirowaniu różnicowym. Reprezentatywne dane pokazują, że opisana metodologia stanowi skuteczne, najnowocześniejsze narzędzie dla przyszłych badań nad ApoBD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Indukcja apoptozy

  1. Odwirować próbkę komórek o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant w celu usunięcia wszelkich istniejących wcześniej resztek komórek.
    UWAGA: W przypadku stosowania komórek przylegających, należy wcześniej wysiać komórki i przemyć 1x roztworem buforowanym fosforanem (PBS) przed indukcją apoptozy.
  2. Określ numer komórki i zbierz komórki.
    UWAGA: W zależności od testu po izolacji zalecamy początkową liczbę komórek co najmniej 1 x 107 komórek.
  3. Zawiesić w kompletnych pożywkach (odpowiednie podłoże zawierające 10% (obj./obj.) płodowej surowicy cielęcej, 50 j.m./ml penicyliny, 50 μg/ml mieszaniny streptomycyny) do uzyskania końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.
  4. Podwielokrotność ~ 2 x 106 komórek na dołek płytki 6-dołkowej.
  5. Aby wywołać apoptozę, zdejmij pokrywę płytki i naświetlaj komórki o sile 150 mJ/cm2 za pomocą promiennika UV. Powinno to zająć około 30-60 s.
    UWAGA: Przed napromienianiem upewnij się, że ~0,5 x 106 komórek jest zachowanych do kontroli komórek "nieleczonych".
    UWAGA: Apoptoza może być również indukowana za pomocą innych metod, takich jak anty-Fas lub głód surowicy6.
  6. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 2-8 godzin, w zależności od linii komórkowej.
  7. Za pomocą laboratoryjnego mikroskopu świetlnego wizualizuj komórki, aby potwierdzić obecność morfologii apoptozy, takich jak pęcherzyki, tworzenie apoptopodiów i tworzenie ApoBD.
    UWAGA: Wystarczające jest 40-krotne powiększenie
  8. Za pomocą pipety P1000 odpipetuj i zbierz próbki apoptotyczne.
  9. Umyj płytkę 1x PBS i połącz z pozostałą próbką, aby zapewnić maksymalną wydajność.
  10. Zbierz ~1/10th dla kontroli "Whole Apoptotic Sample" (WAS).
  11. Pobrać próbkę "niepoddaną obróbce".
  12. Odwirować zarówno próbki WAS, jak i próbki niepoddane działaniu substancji przy 3 000 x g przez 6 minut.
  13. Zawiesić w 1 ml 1x PBS i odstawić na lód.
  14. W przypadku izolacji ApoBD przejdź do kroku 2 lub 3 z pozostałą próbką apoptozy.

2. Izolacja ApoBD za pomocą FACS

  1. Odwirować całą próbkę o masie 3 000 x g przez 6 minut.
  2. Usunąć większość supernatantu, nie naruszając osadu.
  3. Zawiesić ponownie w roztworze barwiącym zawierającym 1 ml buforu wiążącego 1x A5, 75 μl A5-FITC i 2 μl TO-PRO-3 na 1x107 komórek.
  4. Próbkę inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Dodać 1-2 ml 1x buforu wiążącego A5 i odwirować próbkę o stężeniu 3 000 x g przez 6 minut, aby usunąć nadmiar plamy.
    UWAGA: W przypadku mieszanych populacji komórek lub próbek tkanek należy przeprowadzić etap barwienia przeciwciał przy użyciu kombinacji markerów specyficznych dla typu komórki w buforze wiążącym 1x A5 i inkubować na lodzie przez 20 minut (lub zgodnie z protokołem producenta) przed odwirowaniem przy 3,000 x g przez 6 minut.
  6. Zawiesić osad próbki w 3 ml buforu FACS (1x PBS, 1x bufor wiążący A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) na 1x107 komórek.
  7. Przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm do okrągłodennej probówki polipropylenowej (cytometria przepływowa) i przechowywać próbki na lodzie i w ciemności.
  8. Włącz maszynę FACS i wykonaj standardową konfigurację za pomocą dyszy 100 μm, wykonaj opóźnienie upuszczania i zapewnij stabilny strumień.
  9. Załaduj próbkę i ustaw prędkość akwizycji na ~1000 zdarzeń/s.
  10. Dostosuj napięcia FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) i FITC (A5) oraz zdarzenia położenia na wykresach FACS, aby zapewnić wyraźne rozdzielenie populacji.
  11. Rekord 20 000 wydarzeń.
  12. Ustaw strategię bramkowania, jak w części 4.
  13. W układzie sortowania dodaj końcową bramkę ApoBD jako żądaną populację sortowania.
  14. Rozpocznij pobieranie próbki i wykonaj sortowanie testowe, zbierając 5 000-10 000 ApoBD do nowej probówki zawierającej ~250 μl buforu FACS.
  15. Wykonaj płukanie wsteczne systemu i załaduj posortowane ApoBD.
  16. Pobieranie i rejestrowanie sortowania testowego ApoBDs.
  17. Sprawdź, czy czystość ApoBD wynosi ~99%, porównując FSC (oś y) z A5 (zdarzenia na osi x).
    UWAGA: Barwienie A5 może się nieznacznie zmniejszyć podczas ponownej analizy próbek z powodu wybielania laserowego.
  18. Po osiągnięciu wysokiej czystości załaduj oryginalną próbkę i kontynuuj sortowanie, aż do uzyskania żądanej liczby ApoBDs.
    UWAGA: W razie potrzeby można przeprowadzić podwójne sortowanie w celu jednoczesnego wyizolowania ApoCells i ApoBDs.
    UWAGA: W przypadku sortowania przez długi okres czasu zalecamy inkubację probówki zbiorczej w temperaturze 4 °C.
  19. Po zakończeniu sortowania zbierz niewielką porcję ApoBD po sortowaniu, po sortowaniu ApoCells, Untreated i WAS, aby zweryfikować apoptozę i potwierdzić czystość po sortowaniu.
    UWAGA: Chociaż czystość sortowania testowego i końcowego nie powinna się znacząco różnić, zależy to od ustawień strumienia i stabilności.

3. Izolacja ApoBD za pomocą wirowania różnicowego

  1. Pozostałą próbkę apoptotyczną odwirować przy 300 x g przez 10 minut.
  2. Zebrać supernatant, pozostawiając ~500 μl, aby uniknąć rozerwania osadu komórkowego, i dodać do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Usunąć pozostałe 500 μl i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml 1x PBS (odpowiada to 'frakcji wzbogaconej w ApoCell'.
  4. Odwirować zebrany sklarowany supernatant przez 20 minut przy stężeniu 3 000 g.
  5. Sprawdzić, czy nie ma osadu i ostrożnie usunąć supernatant (supernatant może zawierać małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, w tym mikropęcherzyki i egzosomy).
  6. Zawiesić osad w 1 ml 1x PBS (odpowiada to frakcji "wzbogaconej w ApoBD")
  7. Zbierz 100 μl każdej żywej, WAS, wzbogaconej ApoCell i wzbogaconej ApoBD w nowej okrągłodennej probówce z polistyrenu (cytometria przepływowa).
  8. Dodać 100 μl barwnika zawierającego 2x bufor wiążący A5, 1:100 A5-FITC i 1:1,000 TO-PRO-3
  9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
  10. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, stosując strategię bramkowania, jak opisano powyżej, w celu walidacji pomyślnej indukcji apoptozy i czystości frakcji wzbogaconej w ApoBD.

4. Strategia bramkowania cytometrii przepływowej

  1. Wykreślić TO-PRO-3 (oś y) w stosunku do FSC (oś x), aby oddzielić komórki martwicze (wysoki TO-PRO-3) od wszystkich innych zdarzeń nieprzepuszczalnych (TO-PRO-3niski/pośredni
    2. ).
  2. Zaznacz wszystkie zdarzenia nieprzepuszczalne i wykreśl SSC względem A5. Bramka dwie populacje, w tym populacja 1 (P1), SSCpośrednie/wysokie, A5niskie/pośrednie komórki i populacja 2 (P2), wszystkie inne zdarzenia.
  3. Z P2 wykreśl TO-PRO-3 względem A5 i wybierz zdarzeniapośrednie/wysokie A5, aby wykluczyć wszystkie szczątki komórek.
  4. Zaznacz wszystkie pozytywne zdarzenia A5 i wykreśl FSC w stosunku do A5. Oddziel ApoBD (FSC niski) od ApoCells (FSC pośredni/wysoki).
    UWAGA: W przypadku bramkowania ApoBD w celu izolacji ApoBD za pomocą podejścia opartego na FACS, zalecamy ostatni krok, wybierając ApoBD i porównując TO-PRO-3 z A5 i wybierając wszystkie zdarzenia. Gwarantuje to, że końcowa bramka sortująca wykorzystuje parametry fluorescencji, a nie FSC/SSC.
  5. Aby przeprowadzić analizę żywotnych komórek, wybierz P1 i wykonaj jedną z dwóch strategii bramkowania. W celu ogólnej analizy żywotnych komórek, należy wykreślić FSC w stosunku do A5 i wybrać wszystkie ogniwaFSC pośrednie/wysokie, usuwając w ten sposób pozostałe resztki komórek. Alternatywnie, w celu dogłębnej analizy, żywe komórki można oddzielić od wczesnych ApoCells A5, wykreślając TO-PRO-3 w stosunku do FSC. Wybierz ogniwa TO-PRO-3o niskiej żywotności i komórki TO-PRO-3pośrednie,pośrednie FSC/o wysokiej zawartości A5 - wczesne ApoCells.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując procedurę opisaną w niniejszym materiale, indukowano apoptozę monocytów THP-1, a następnie wykrywano i izolowano ApoBD za pomocą metody FACS lub różnicowego wirowania (Rycina 1). W pierwszej kolejności apoptozę indukowano poprzez naświetlanie promieniami UV, a próbki pobierano po 2-3 h inkubacji, gdy komórki wykazywały morfologię apoptotyczną, w tym pęcherzykowanie, tworzenie wypustek błony apoptotycznej oraz generowanie ApoBD6

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od czasu jej wczesnego opisu w latach pięćdziesiątych XX wieku, dziedzina apoptozy znacznie się rozwinęła, stając się znaczącym obszarem badawczym. Pomimo szerokiego zainteresowania i szeroko zakrojonych wysiłków, niektóre aspekty apoptozy, w szczególności powstawanie ApoBDs, nie zostały dobrze zbadane ze względu na brak odpowiednich metodologii. Obejmują one w szczególności ograniczenie w jednoczesnym śledzeniu progresji apoptozy i powstawania ApoBD przy użyciu tradycyjnej cytometrii przepływowej A5/PI oraz zanieczyszcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To działanie było wspierane przez granty z National Health and Medical Research Council (GNT1125033 i GNT1140187) oraz Australian Research Council (DP170103790) dla I.K.H.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki, np. hodowane ludzkie monocyty THP-1 (numer klonu: TIB-202)ATCC-RPMI
1640 mediumLife Technologies22400-089
Mieszanina penicyliny i streptomycynyLife Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS--
Annexin V FITCBD
jodekLife TechnologiesT3605TO-PRO-3 może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Unikaj bezpośredniego kontaktu.
10x Bufor wiążący Annexin VBD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
Probówka wirówkowa (15 mL)Cellstar
(1,5 mL)Sarstedt72.690.001
Inkubator do hodowli tkankowych (37 ° C, 5% CO2)-
WirówkaBeckman Coulter392932
FACS ARIA III Cytometr przepływowy, skonfigurowany z dwoma laserami do wykrywania FITC i APCBD Bioscience-FACS
Canto II Cytometr przepływowy, skonfigurowany z dwoma laserami do wykrywania FITC i APCOprogramowanie BD Bioscience-FACS
Diva 6.1.1BD Bioscience-
Oprogramowanie FlowJo 8.8.6
  UV Stratalinker 1800Stratagene-
Bioscience-TO-PRO-3 Probówka do mikrowirówek 188271 --

Bibliografia

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439(2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81(2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846(2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Cytometria przepływowaizolacja FACSwirowanie różnicoweindukcja apoptozymonocyty THP-1pęcherzyki zewnątrzkomórkowesortowanie komórekanaliza czystościstrategia bramkowania
Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.