Artykuł metodologiczny

Test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58324

⸱

17 grudnia 2018

 ,  , 
1Department of Biology, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z beztlenowego biosensora mikrobiologicznego całych komórek do oceny, jak różne zmienne środowiskowe wpływają na biodostępność Hg i Cd dla bakterii w środowisku beztlenowym.

Streszczenie

Biodostępność rtęci (Hg) dla mikroorganizmów jest kluczowym krokiem do toksycznej biomagnifikacji Hg w sieciach pokarmowych. Przemiany kadmu (Cd) i biodostępność dla bakterii kontrolują ilość, która gromadzi się w podstawowych uprawach spożywczych. Biodostępność tych metali zależy od ich specjacji w roztworze, ale w szczególności w warunkach beztlenowych, w których Hg jest metylowany do toksycznej monometylortęci (MeHg), a Cd utrzymuje się w ryzosferze. Bioczujniki mikrobiologiczne działające w całych komórkach dają wymierny sygnał, gdy metal dostanie się do cytozolu, a zatem są przydatnymi narzędziami do oceny biodostępności metalu. Niestety, większość prób biodetekcji była do tej pory ograniczona do środowisk tlenowych ze względu na ograniczoną zdolność istniejących białek reporterowych do funkcjonowania przy braku tlenu. W tym badaniu przedstawiamy nasze wysiłki na rzecz opracowania i optymalizacji testu biosensora całego komórkowego zdolnego do działania beztlenowego, który może wykrywać metale w warunkach beztlenowych w czasie quasi-rzeczywistym i w ciągu kilku godzin. Opisujemy, w jaki sposób bioczujnik może pomóc w ocenie, w jaki sposób zmienne chemiczne istotne dla środowiskowego obiegu metali wpływają na ich biodostępność. Poniższy protokół obejmuje metody (1) przygotowania wzorców Hg i Cd w warunkach beztlenowych, (2) przygotowania bioczujnika przy braku tlenu, (3) zaprojektowania i przeprowadzenia eksperymentu w celu określenia, w jaki sposób szereg zmiennych wpływa na biodostępność Hg lub Cd oraz (4) ilościowego określenia i interpretacji danych z biosensorów. Pokazujemy zakresy liniowe bioczujników i podajemy przykłady pokazujące zdolność metody do rozróżniania biodostępności metali i toksyczności poprzez wykorzystanie zarówno szczepów indukowanych metalami, jak i konstytutywnych.

Wprowadzenie

Rtęć (Hg) jest globalnym zanieczyszczeniem, a jej biodostępność dla mikrobów metylujących Hg jest pierwszym krokiem w kierunku jej biomagnifikacji przez sieci pokarmowe i możliwych efektów neurotoksycznych u ludzi i dzikich zwierząt1. Obecnie uważa się, że mikrobiologiczna metylacja Hg jest procesem wewnątrzkomórkowym, który wymaga: i) aby gatunek Hg był biodostępny2,3,4,5,6,7 oraz ii) aby komórka była fizjologicznie zdolna do metylacji Hg8,9,10. Kadm (Cd) ulega bioakumulacji w organizmach, ale nie ulega biomagnifikacji w sieciach pokarmowych i jest szeroko stosowany w procesach przemysłowych i handlowych, które często powodują ostre narażenie ludzi i środowiska11. Chociaż mikroorganizmy odgrywają kilka kluczowych ról w losie Hg w środowisku, większość badań nad geochemią Cd i ekotoksykologią koncentruje się na mikroorganizmach eukariontów12. Konsumpcja upraw rolnych (np. ryżu) jest głównym źródłem bezpośredniego narażenia na kadm; w tym przypadku biodostępność Cd dla mikroorganizmów ryzosfery bezpośrednio wpływa na ilość, jaką rośliny mogą gromadzić13.

Ścieżki transportu Hg są skomplikowane i mogą obejmować aktywny etap transportu14. Ostatnie prace sugerują, że gdy w grę wchodzi transporter, HgII używa transportera ZnII lub MnII7,15,16,17. Podczas gdy przypuszcza się, że CdII jest przypadkowo transportowany do cytozolu przez szlaki transportu metali dwuwartościowych (w szczególności MnII lub ZnII), mechanizmy transportu CdII wewnątrz komórek pozostają w sferze spekulacji i nie zidentyfikowano szlaku transportu specyficznego dla Cd13,18. Niezależnie od charakteru zaangażowanych transporterów, trzy czynniki mechanistyczne ostatecznie determinują zdolność metali do wnikania do komórki: i) specjacja metalu w roztworze2,6,15,16,17,19,20,21, 22,23, ii) właściwości biofizjochemiczne błony komórkowej17,24,25,26,27,28,29,30,31oraz iii) możliwość dostępu metalu do miejsca transportu7,32. Jest mało prawdopodobne, aby Cd i Hg występowały jako wolne jony w warunkach fizjologicznie istotnych dla mikroorganizmów ze względu na ich wysokie powinowactwo do rozpuszczonej materii organicznej (DOM), zanieczyszczeń chelatujących (np. EDTA) lub zredukowanych ugrupowań siarki33,34,35 (CdII może istnieć jako wolny jon lub tworzyć pary jonowe przy braku tych ligandów). Brakuje skutecznych metod określania, w jaki sposób te gatunki metali są biodostępne w warunkach istotnych dla ich losów w środowisku. Na przykład Hg jest metylowany w warunkach beztlenowych14, a zarówno kadm, jak i Hg są metalami miękkimi (lub kationami klasy B), co wymaga zbadania ich specjacji w warunkach, które zachowują integralność zredukowanych grup siarki.

Biosensory mikrobiologiczne to komórki bakteryjne, które emitują wymierny sygnał w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe stężenia metalu, w tym przypadku Hg lub Cd. W związku z tym są idealnymi narzędziami do zrozumienia, w jaki sposób metale dostają się do komórki36, pod warunkiem, że warunki ekspozycji są dokładnie kontrolowane. Bioczujniki Hg zazwyczaj zawierają fuzje genów między obwodami regulatorowymi mer-operonu (w tym genami kodującymi regulator transkrypcji MerRas, a także regionami operatora i promotora operonu) a genami raportującymi (np. Geny lux, gfp, lac). Gdy rtęć jest obecna w cytoplazmie, wiąże się z MerR, co powoduje transkrypcję genów raportujących i późniejszą produkcję sygnału19,37. Specyficzne biosensory Cd są zwykle projektowane przy użyciu regulatorów transkrypcji kodowanych w kodach cadC, cadAC, zntA lub zntR38, ale warto zauważyć, że MerR ma niższe, ale wymierne powinowactwo do Cd5. Ze względu na ograniczenia tlenowe najczęściej stosowanych luminescencyjnych lub fluorescencyjnych białek reporterowych, do niedawna bioczujniki mikrobiologiczne nie były w stanie zapewnić wglądu w biotransformację metali w warunkach beztlenowych. To sprawia, że beztlenowe wykrywanie biodostępności metali jest bardzo trudne w różnych warunkach istotnych dla ich losów w środowisku, w szczególności w obecności ligandów wrażliwych na redoks (np. siarczków i tioli)4,5,39.

Aby złagodzić metodologiczną przeszkodę związaną z obrazowaniem na żywo przy braku tlenu, Drepper et al. (2007) opracowali białko fluorescencyjne na bazie flawiny (FbFp), oparte na domenie napięcia tlenu świetlnego białka SB2 z P. putida. Ta rodzina białek jest zdolna do fluorescencji przy braku tlenu40. Opierając się na pracy Dreppera i wsp., nasze laboratorium zaprojektowało bioczujnik beztlenowy pozwalający na badanie biodostępności Hg w warunkach tlenowych i beztlenowych oraz w szerokim zakresie zasolenia 17. W niniejszym artykule opisano, jak przygotować i wykorzystać bioczujnik do badania wpływu zmiennych środowiskowych na biodostępność Hg lub Cd. Chociaż opracowaliśmy bioczujnik dla HgII, zdecydowaliśmy się przeprowadzić eksperymenty z CdII jako sposób na zwrócenie uwagi czytelnika na fakt, że bioczujniki mogą również reagować na wiele stresorów, które prawdopodobnie współwystępują w matrycach środowiskowych; w tym przypadku CdII został zbadany, ponieważ wiadomo, że wiąże się z regulatorem transkrypcji MerR5. Tutaj pokazujemy reprezentatywną kalibrację i funkcjonalne zakresy liniowe w odniesieniu do każdego metalu. Podajemy również przykład, gdy wyniki biosensora są jednoznaczne (MgII i MnII dotyczące biodostępności Hg) i niejednoznaczne (ZnII dotyczące biodostępności Hg).

Protokół

1. Przygotowanie pożywek wzrostowych i pożywek do ekspozycji

  1. Aby przygotować 250 mL ośrodek wzrostu:
    Uwaga: Jeśli roztwór pierwiastków śladowych #1 i roztwór pierwiastków śladowych #2 są już przygotowane, przejdź do kroku 1.1.5.
    1. Przygotuj roztwór pierwiastków śladowych #1 w czystej kolbie miarowej (200 mL), aby uzyskać końcowe stężenia molowe równe 1,5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO3i 0,1 M NaOH.
      UWAGA: Silne zasady (NaOH) są żrące. Podczas ważenia odczynników należy upewnić się, że końcowe stężenie molowe odzwierciedla zawartość kluczowych mikroelementów: Mo, Se i B.
    2. W warunkach sterylnych przefiltruj, stosując sterylną 0.22 µm polietersulfonowy filtr do strzykawki w czystej/sterylnej butelce z tworzywa sztucznego/politetrafluoroetylenu (PTFE)
    3. Przygotuj roztwór pierwiastków śladowych #2 w czystej kolbie miarowej (200 mL), aby uzyskać końcowe stężenia molowe 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO₄4, 3,25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl2i 0,1 M H2SO4.
      UWAGA: Kwasne substancje (H2SO4są żrące. Podczas ważenia odczynników należy upewnić się, że końcowe stężenie molowe odzwierciedla kluczowe mikroelementy: Mn, Zn, Co i Ni.
    4. W warunkach sterylnych przefiltrować, stosując sterylną 0.22 µm filtr strzykawkowy z polietersulfonu do czystej butelki szklanej
    5. W warunkach sterylnych, w czystej/sterylnej butelce szklanej (o pojemności co najmniej 250 mL) dodaj 200 mL wody ultraczystej, 42,5 mL soli minimalnych M9 (5x; patrz Spis materiałów), 2,5 mL 2 M glukozy, 125 µL 2 M MgSO₄4, 1200 µL 0,6 M tiominy HCl z odmrożonego (-20 °C) alikwotu, 1,25 mL 4 M NaNO3, 770 µL 0,075 M roztworu L-leucyny/L-isoleucyny/waliny 250 µL pierwiastki śladowe #1, 250 µL pierwiastka śladowego #2, oraz 250 µL 0,01 M soli sodowej EDTA
      Uwaga: wszystkie odczynniki w kroku 1.1.5 należy przygotować wcześniej i przefiltrować sterylnie, używając 0.22 µm filtr membranowy z polietersulfonu w strzykawce. Wodę ultraczystą można sterylizować za pomocą autoklawu.
    6. Weź butelkę szklaną zawierającą teraz roztwór z kroku 1.1.5, lekko zakręć ją i przeprowadź przez cykl komora beztlenowa komora powietrzna
    7. W komora beztlenowa, dodaj 15 µL 0,225 M FeSO4 w 0,2 M H2SO4, dokładnie zakręć butelkę i wstrząsaj, aż wszystkie białe osady znikną.
      Uwaga: wszystkie odczynniki w kroku 1.1.7 należy przygotować wcześniej i przefiltrować sterylnie, używając 0.22 µm filtr strzykawkowy z polietersulfonu. Przechowuj 0,225 M FeSO₄4 w 0,2 M H2SO4 w komora beztlenowa.
    8. Zdejmij nakrętkę z butelki, odczekaj 1 minutę, aby nastąpiła wymiana powietrza, załóż ponownie nakrętkę na butelkę, a następnie intensywnie wstrząśnij. Powtórz ten krok raz.
    9. Zakręć dokładnie kapsel na butelce, usuń z komora beztlenowai przechowuj butelkę w lodówce (4 °C) do czasu użycia.
    10. Ośrodek wzrostu powinien być przygotowywany ponownie raz w tygodniu poprzez powtórzenie kroków 1.1.5 do 1.1.9.
  2. Aby przygotować 100 mL ośrodek ekspozycji w 2 x 50 mL stożkowych sterylnych polipropylenowych probówkach do wirowania
    Uwaga: Zalecamy, aby ośrodek ekspozycyjny będzie przygotowane w dniu test ekspozycji aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, jednak może być przygotowany wcześniej i przechowywany w lodówce.
    1. W komora beztlenowado każdej 50 mL probówki wirowarkowej dodaj 42 mL beztlenowej wody ultra czystej, 350 µL z 1 M roztworu modyfikatora sodowego beta-glicerofosforanu z przechowywanej w temperaturze -20 °C porcji, 2 mL 1 M kwasu MOPS 50 μL 1 M (NH₄)₂SO₄4)2SO4, 125 μL 2 M glukozy, 300 μL 2,5 M KOH oraz 200 μL 2,5 M NaOH
      Uwaga: wszystkie odczynniki w kroku 1.2.1 należy przygotować wcześniej i przefiltrować sterylnie, używając 0.22 µm filtr strzykawkowy z politioeteru sulfonu. Wodę ultraczystą można sterylizować termicznie w autoklawie. Roztwory 2,5 M NaOH należy przechowywać w butelkach z tworzywa sztucznego/PTFE. Wszystkie wymienione odczynniki należy przechowywać w komora beztlenowa z wyjątkiem fosforanu sodu beta-glicerynowego, który należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Ogólnie zaleca się pozostawienie wszystkich części i pojemników plastikowych lub szklanych w komorze beztlenowej na kilka dni, aby upewnić się, że nie pozostał w nich żaden ślad tlenu.
    2. Zamknij rurki wirowarkowe o pojemności 50 mL, dokładnie wstrząśnij i pobierz próbkę 10 mL w celu zmierzenia pH. Wartość pH tego środowiska ekspozycyjnego musi zawsze wynosić 7,00 ± 0,02 w 25 ˚CJeśli wartość pH nie mieści się w tym zakresie, skoryguj objętość dodanego 2,5 M KOH, aby to naprawić.
      Uwaga: Nigdy nie miareczkuj roztworu w celu skorygowania pH za pomocą sondy pH. Sondy pH stanowią potencjalne źródło zanieczyszczenia roztworu ośrodek ekspozycyjnyWartość pH musi zawsze wynikać z dodanych odczynników w kroku 1.2.1.
  3. Przygotuj 5–10 mM roztwór NaNO₃3 roztwór macierzysty i pozostawić w komora beztlenowa do użycia w trakcie czasu test ekspozycji.
    Uwaga: Łatwiej jest rozcieńczyć bardziej stężony pierwotny roztwór NaNO3 standardowy, w przeciwieństwie do przygotowania 5-10 mM NaNO3 substancja wzorcowa pierwszorzędna

2. Przygotowanie standardów rtęci i kadmu.

  1. Przygotowanie roztworu rtęci (HgII) o stężeniu 4–8 µM w 0,2 M H2SO4.
    1. Przygotuj roztwór wzorcowy Hg2+, sporządzając milimolowy (1–10 mM) roztwór HgCl2, HgNO3 lub HgSO4 w 0,2 M H2SO4.
      UWAGA: Rtęć jest wysoce toksyczna, a H2SO4 jest żrąca. Pracuj pod wyciągiem, stosując cały wymagany sprzęt ochrony indywidualnej.
    2. W butelce z PTFE rozcieńcz roztwór wzorcowy z punktu 2.1.1. za pomocą 0,2 M H2SO4, aby uzyskać stężenie w zakresie 4–8 µM Hg2+.
      Uwaga: Kwas użyty do rozcieńczania musi być kwasem siarkowym (H2SO4) o stopniu czystości analitycznej.
    3. Stężenie rtęci z punktu 2.1.2. należy zweryfikować za pomocą analizatora rtęci (zobacz Tabelę materiałów).
      Uwaga: Do weryfikacji stężenia rtęci można zastosować inne metody.
  2. Przygotowanie roztworu CdII o stężeniu 10 µM w 10 mM H2SO4.
    1. Przygotuj roztwór wzorcowy CdCl2 (w zakresie 10–50 mM, aby dokładnie odważyć proszek) w 0,1 M H2SO4.
    2. W serii rozcieńczeń szeregowych w czystych, przemytych kwasem fiolkach szklanych borokrzemowych o pojemności 20 mL z czarnymi śrubowymi korkami fenolowymi z wkładkami gumowymi pokrytymi PTFE, rozcieńcz roztwór wzorcowy z punktu 2.2.1. do stężenia 10 µM Cd2+. Upewnij się, że stężenie H2SO4 w każdym kolejnym rozcieńczeniu szeregowym pozostaje na poziomie 10 mM.

3. Przygotowanie biosensora do badania ekspozycji beztlenowej

  1. Posiej hodowlę zamarzniętą w -80 °C z bioczujnikiem indukowalnym przez rtęć (E. coli NEB5α zawierającym PUC57merR-PpFbFp) oraz bioczujnikiem wyrażanym konstytutywnie (E. coli NEB5α zawierającym PUC19Balch-PpFbFp) na szalki z podłożem Lysogeny Broth zawierającym 120 µg/mL ampiczyny. Szczegóły produkcji tych bioczujników zawarte są w naszej uprzednio opublikowanej pracy17.
  2. O godz. 16:30–17:00 zaszczep kulturę w 10 ml LB (+ amp) i hoduj całą noc.
    Uwaga: Rozpoczęcie od płytki zajmuje 2 dni przygotować hodowlę beztlenową dla test ekspozycji (czyli kultura rozpoczęta w poniedziałek po południu (16:30–17:00) będzie gotowa do test ekspozycji około południa w środę). Poniższe kroki to niezbędne techniki mikrobiologiczne wymagane do przygotowania hodowli w dniu Test ekspozycji.
    1. Weź jedną kolonię z hodowli na płytce i dodaj do 10 mL bulionu Lysogeny (LB) z 21 µL 100 mg/mL roztworu zapasowego chlorku ampicyny (końcowe stężenie 210 µg/mL amp) w sterylnym pojemniku do hodowli.
    2. Umieść hodowlę w inkubatorze/kołysce i inkubuj całą noc w temperaturze +37 °C przy mieszaniu 220 rpm.
  3. Następnego dnia rano, o godzinie 9-10, zawieś ponownie hodowlę i inkubuj ją w warunkach beztlenowych przez cały dzień (zasiew 20%).
    1. Przenieś hodowlę z inkubatora (krok 3.2.1) oraz ośrodek wzrostu (krok 1.1.9) do komora beztlenowa.
    2. Dodaj 8 mL świeżego ośrodek wzrostu i ampicylina (210 μg/mLdo sterylnego probówki Balcha
    3. Zbierz 2 mL hodowli wyhodowanej przez noc i przenieś do 2 mL eprówka do wirowania. Wirowanie przy 10 000 RCF przez 90 sekund, odrzucenie nadosadu i zawieszenie w 2 mL świeżych ośrodek wzrostu. Dodaj zawieszoną ponownie kulturę do probówki Balcha zawierającej 8 mL świeżej ośrodek wzrostu i ampicylina.
    4. Korzystając z techniki sterylnej, ostrożnie załóż korek gumowy na rurkę Balcha. Wyjmij z komora beztlenowa i umieścić w inkubatorze/strzeszalce, hodować anaerobowo do godziny 15:00–17:00 w temperaturze +37 °C przy mieszaniu 220 rpm.
  4. Między 15:00 a 17:00 przeprowadź 1% inokulację beztlenową do świeżej ośrodek wzrostu i hodować całą noc.
    1. Przenieś probówkę Balcha (krok 3.3.4) do komora beztlenowa wraz z ośrodek wzrostu. Dodaj 100 µL kultury do 10 mL świeżego ośrodek wzrostu (1% inokulum) z amp (210 µg/mL amp) w sterylnym probówku Balcha.
    2. Korzystając z techniki sterylnej, ostrożnie załóż korek gumowy na probówkę Balcha. Wyjmij z komora beztlenowa, umieścić w inkubatorze/kołysce i hodować całą noc w +37 °C przy mieszaniu 220 rpm.
  5. Między 9:00 a 10:00 zawieś kulturę w celu wzrostu beztlenowego przez cały dzień (inokulum 20%).
    1. Przenieś hodowlę z inkubatora (krok 3.4.1) oraz ośrodek wzrostu (krok 1.1.9) do komora beztlenowa.
    2. Dodaj 8 mL ośrodek wzrostu oraz ampicylinę (210 µg/mL amp) do sterylnego probówki Balcha.
    3. Zbierz 2 ml nocnej hodowli i przenieś do 2-ml probówki do wirowania. Wirowanie przy 10 000 x g przez 90 sekund, odrzucenie supernatantu i zawieszenie w 2 mL świeżych ośrodek wzrostu. Dodaj zawieszoną ponownie kulturę do probówki Balcha zawierającej 8 mL świeżej ośrodek wzrostu i ampicylina.
    4. Z zachowaniem techniki sterylnej ostrożnie załóż korek gumowy na probówkę Balcha. Wyjmij z komory i umieść w inkubatorze/kołysce, hodując anaerobowo w temperaturze +37 °C przy mieszaniu 220 rpm.
  6. Monitoruj wzrost hodowli za pomocą spektrofotometru (krok 3.5.4), aż do osiągnięcia OD600 0,6 jest osiągnięty. Przed każdym pomiarem OD dokładnie wymieszaj kulturę w wirówce vortex.
    Uwaga: Ten krok trwa 3–4 godziny, a ośrodek ekspozycyjny (krok 1.2) powinien zostać przygotowany w tym czasie, tak samo jak test ekspozycji (krok 4.1)
  7. Zatrzymaj wzrost, gdy hodowla osiągnie OD600 0,6 (±0,1) (oczekiwany wzrost w ciągu 3–4 godziny)
    1. Przenieś probówkę do komora beztlenowa (krok 3.6) i przenieść hodowlę do 2 x 2 mL Probówki do wirowania w mikrowirówce. Wirować przy 10 000 x g przez 90 sekund, odrzucić supernatant i zawiesić osad w 2 x 2 mL świeżych ośrodek ekspozycyjny.
    2. Powtórz krok płukania 3.7.1. jeden raz, aby usunąć wszelkie ślady ośrodek wzrostu.
  8. Połącz zawartość obu probówek do wirowania mikrocentryfugowego z hodowlą komórkową (krok 3.7) w standardowym wisiorku PTFE o pojemności 7 mL, aby uzyskać Zapas biosensora do użycia w Test ekspozycji (krok 4).
    Uwaga: Upewnij się, że dokładnie wymieszać Zapasowy biosensor poprzez staranne, ale delikatne pipetowanie w przód i wstecz bezpośrednio przed użyciem. Metodę można przerwać w tym miejscu na okres do jednej godziny.

4. Test narażenia

  1. Projektowanie układu płytki.
    Uwaga: Przed rozpoczęciem testu ekspozycji należy upewnić się, że wszystkie objętości do dozowania zostały obliczone, a roztwory macierzyste przygotowane. Szczegółowe informacje na temat właściwego projektowania eksperymentu oraz kontroli, które należy uwzględnić, zawarte są w tekście. Dodatkowo, eksperymentu nie należy rozpoczynać, jeśli na monitorze beztlenowym widoczny jest tlen.
    1. Zaprojektuj układ płytki zgodnie z szablonem 96-dołkowym. Aby przeprowadzić eksperymenty w trzech replikach technicznych, można zastosować 32 różne zabiegi, co najlepiej przedstawić w postaci siatki 4 × 8 do przygotowania fiolki (patrz Rysunek 1).

Płyta mikropłytkowa i probówki ustawione do eksperymentu wysokoprzepustowego w analizie laboratoryjnej.
Rycina 1: Płyta 96-dołkowa (po lewej) oraz odpowiadająca jej siatka 4 × 8 zawierająca fiolki z PTFE (po prawej), które zostaną przeniesione do płyty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Uwaga: Podczas badania wpływu zmiennej na wchłanianie Hg za pomocą indukowalnego biosensora rtęci; dla każdej zmiennej wymagane są dwa zabiegi: zabieg (biosensor + Hg + zmienna + azotan) oraz zabieg bez dodatku (biosensor + zmienna + azotan). Podczas badania roli zmiennej na fizjologię komórki za pomocą konstytutywnego biosensora, dla każdej zmiennej wymagane są dwa zabiegi: zabieg (biosensor + Hg + zmienna + azotan) oraz zabieg bez dodatku (biosensor + zmienna + Hg). Rtęć może zostać zastąpiona kadmem. Hg lub Cd staje się zmienną podczas wykonywania krzywej kalibracyjnej. Biosensory konstytutywne i indukowalne nie muszą być wykonywane jednocześnie (w tej samej układance płytki). Przykładowy szablon układu płytki oraz odpowiadająca mu siatka 4 x 8 podczas testowania zakresu stężeń magnezu (zmienna) przedstawiono w Tabeli 1.

123456789101112
aBiosensor indukowany rtęcią + Hg + Azotan + 0 mM MgBiosensor indukowany rtęcią + Azotan + 0 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + Azotan + 0 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + 0 mM Mg
bBiosensor indukowany rtęcią + Hg + Azotan + 0,1 mM MgBiosensor indukowany rtęcią + Azotan + 0,1 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + Azotan + 0,1 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + 0,1 mM Mg
cBiosensor indukowany rtęcią + Hg + Azotan + 1 mM MgBiosensor indukowany rtęcią + Azotan + 1 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + Azotan + 1 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + 1 mM Mg
dBiosensor indukowany rtęcią + Hg + Azotan + 10 mM MgBiosensor indukowany rtęcią + Azotan + 10 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + Azotan + 10 mM MgBiosensor konstytutywny + Hg + 10 mM Mg
e

Tabela 1: Przykładowy układ płytki do badania bio dostępności Hg (5 nM) za pomocą biosensora w gradientach magnezu (0–10 mM)

  1. Przygotuj siatkę 4 x 8 zgodnie z układem płytki do testu.
    1. Umieść fiolki standardowe z PTFE o pojemności 7 mL na tacy.
      Uwaga: Fiolki z PTFE należy uprzednio przemyć kwasem i zesterilizować cieplnie przed użyciem. Fiolek należy dotykać wyłącznie od zewnętrznej strony.
    2. Do każdej fiolki dodaj objętość środowiska ekspozycyjnego odpowiadającą danemu zabiegowi.
      Uwaga: W przypadku ekspozycji o całkowitej objętości 2000 µL (2 mL), dodane środowisko ekspozycyjne będzie wynosić: środowisko ekspozycyjne µL = 2000 µL – zabieg (puste próbki) µL. (np. środowisko ekspozycyjne µL = 2000 – 100 µL (biosensor) – 40 µL (azotan) – 100 µL (Hg) – 100 µL (zmienna (np. MgSO4)) = 1660 µL). Upewnij się, że objętość dodanej testowanej zmiennej nie przekracza 5% (100 µL) końcowej objętości.
    3. Do każdej fiolki dodaj odpowiednią objętość roztworu zmiennej chemicznej do przetestowania zgodnie z układem płytki.
    4. Z etapu 1.3 dodaj azotan do każdej fiolki, aby uzyskać końcowe stężenie 200 µM (40–80 µL). Pomij ten krok dla pustych próbek konstytutywnego biosensora.
    5. Z etapu 2.1 lub 2.2 dodaj Hg (5 nM, gdy testowana jest zmienna) lub Cd (300 nM, gdy testowana jest zmienna) do fiolki zgodnie z układem płytki. Pomij ten krok dla pustych próbek biosensora indukowalnego rtęcią.
      1. W przypadku stosowania Hg, pobierz roztwór macierzysty o stężeniu 4–8 µM i dokładnie wymieszaj. Rozcieńcz roztwór w środku ekspozycyjnym w fiolce PTFE o pojemności 7 mL do stężenia 100–250 nM, aby uzyskać roboczy roztwór Hg. Z tego roztworu roboczego dodaj Hg do odpowiednich fiol. W tym przypadku krzywa kalibracyjna Hg powinna zawierać się w zakresie od 0 do 12,5 nM.
        Uwaga: Gdy testujesz wpływ zmiennej na bio dostępność Hg lub Cd, upewnij się, że stężenie [Hg] lub [Cd] pozostaje stałe we wszystkich zabiegach. Podczas dodawania Hg lub Cd używaj jednej końcówki pipety, ale nigdy nie dotykaj środka ekspozycyjnego w fiolkach.
  2. Mieszaj ręcznie ruchem orbitalnym.
    Uwaga: Eksperyment może zostać tymczasowo wstrzymany, w zależności od czasu potrzebnego na specjacyjne przemiany Hg lub Cd w roztworze. Jeśli eksperyment będzie trwać dłużej niż godzinę, załóż korki PTFE na fiolki PTFE, aby zapobiec parowaniu lub zanieczyszczeniu.
  3. Delikatnie pipetuj zapasowy roztwór biosensora na przemian w górę i w dół, aby zapewnić jednorodność. Dodaj po 100 µL zapasowego roztworu biosensora do każdej fiolki. Mieszaj ręcznie ruchem orbitalnym.
  4. Przygotuj czytnik płytek, aby się nagrzał i mógł odczytywać zgodnie z następującymi kryteriami: temperatura 37˚C, pomiar kinetyczny przez 10 godzin z odczytami co 2,5–5 minut i mieszaniem orbitalnym między odczytami, oraz pomiary fluorescencji z wzbudzeniem fluorescencji 440 nm i emisją 500 nm.
  5. Pipetuj po 200 µL z każdej fiolki PTFE z siatki 4 x 8 do odpowiadających im dołków płytki 96-dołkowej (czarna płytki 96-dołkowa z przezroczystym dnem i powierzchnią niewiążącą). Przed przeniesieniem każdej porcji 200 µL pipetuj 5 razy na przemian w górę i w dół.
    Uwaga: Zamiast wyrzucać końcówkę pipety, pozostaw ją w fiolce PTFE, aby śledzić postęp pipetowania.
  6. Umieść płytę 96-dołkową na tacy czytnika, załóż pokrywkę na płytę 96-dołkową i rozpocznij test.

5. Ilościowe określanie danych

  1. Fluorescencja każdego leczenie w każdym punkcie czasowym należy skorygować pod kątem szumu własnego każdego pojedynczego dołka i wyzerować do wartości puste miejsce na leczenie
    1. Fluorescencja dla każdego punktu czasowego (t) każdego leczenie (T) należy przetłumaczyć, uwzględniając początkową fluorescencję (t₀) pierwszego punktu czasowego każdej dołka, a następnie uśrednić dla 3 zabiegi lecznicze repliki (r1–r3). Średnią tej próbki należy następnie odjąć średnią blanku puste miejsce na leczenie (gruźlica) przetłumaczono w ten sam sposób (równanie 1).

Fluorescencja (t) = średnia(Tr1(t) – Tr1(t0), Tr2(t) – Tr2(t0), Tr3(t) – Tr3(t0)) – średnia(TBr1(t) – TBr1(t0), TBr2(t) – TBr2(t0), TBr3(t) – TBr3(t0))           (1)

Uwaga: Należy to wykonać jako funkcję arkusza kalkulacyjnego. Dla każdego punktu czasowego należy również obliczyć poprawne przenoszenie błędu.

  1. Wykreśl skorygowaną fluorescencję każdej zabiegu jako funkcję czasu

Wykres zależności fluorescencji od czasu w funkcji stężenia dla wykrywania Hg(II); różne wartości [Hg(II)] w nM wpływają na RFU.
Rysunek 2: Skorygowane dane fluorescencyjne jako funkcja czasu. Fluorescencja mierzona jako względne jednostki fluorescencji (RFU) emitowane przez E. coli NEB5α zawierającego wektor pUC57merR-Pp (szczep indukowalny) w czasie po dodaniu HgII (0–12,5 nM) w warunkach beztlenowych. Wartości fluorescencji przedstawiają średnią z 3 powtórzeń technicznych w 37 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Uwaga: Na wykresie nie ma wartości 0 nM Hg, a wszystkie inne stężenia Hg zostały odjęte względem 0 nM Hg jako pobocznego kontroli. Dlatego 0 nM Hg odpowiada osi x, a każdy dodatni sygnał fluorescencyjny reprezentuje fluorescencję wywołaną przez Hg przy dowolnej zmiennej. Można opcjonalnie nie stosować takiego odjęcia fluorescencji, jednak krzywe fluorescencyjne będą mylące, jeśli testowana zmienna ma fluorescencję tła (tj. materia organiczna rozpuszczona sama w sobie będzie fluorescowała, a jeśli nie ma kontroli zawierającej jedynie komórki i materię organiczną rozpuszczoną, to wzrost stężenia materii organicznej rozpuszczonej będzie zwiększał sygnał fluorescencyjny).

  1. Określ wartość szczytu fluorescencji. Mierzalny szczyt fluorescencji występuje zazwyczaj po 2,5–4 godzinach i reprezentuje energię wydzieloną w wyniku zużycia całego 200 µM azotanu jako ostatecznego akceptora elektronów. Ten szczyt należy zmierzyć i stanowi on końcową wartość fluorescencji danego konkretnego zabiegu.
    Uwaga: Jeśli nie zaobserwuje się szczytu fluorescencji (tj. brak bio dostępności Hg), należy zmierzyć fluorescencję zabiegu w czasie odpowiadającym szczytowi fluorescencji w próbie kontrolnej (tj. bez dodatkowej zmiennej lub z 5 nM Hg). Alternatywnie, jeśli w zabiegu występuje indukcja fluorescencji, ale nie powstaje wyraźnie zdefiniowany szczyt, istnieje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia przez akceptor elektronów o wyższym powinowactwie, taki jak O2, należy wówczas podjąć środki zapobiegające obecności śladów tlenu we wszystkich roztworach, a eksperyment należy powtórzyć.

Wyniki

Po ilościowym oznaczeniu szczytów fluorescencji zgodnie z krokiem 5.3, wyniki można przedstawić na wykresie w zależności od zmiennej stężenia, aby zilustrować, w jaki sposób dana zmienna wpływa na względną biodostępność Hg lub Cd. Na przykład krzywa kalibracyjna fluorescencji w funkcji [HgII] z Rysunku 2 dostarczy danych indukowalnych przedstawionych na Rysunku 3A. W przypadku kalibracji HgII krzywa dla szczepu indukowalnego zawsze składa się z 3 komponentów: odpowiedzi progowej wynoszącej około 1-2 nM HgII, zanim produkcja sygnału fluorescencji stanie się liniowo proporcjonalna do [HgII], zakresu liniowego, w którego centrum zawsze będzie znajdować się 5 nM HgII, oraz plateau, gdzie zwiększanie [HgII] nie będzie już powodować wzrostu sygnału fluorescencji. Brak zmian w produkcji sygnału w szczepie konstytutywnym wskazuje, że toksyczność [HgII] nie wpływa na produkcję sygnału. Dla CdII na Rysunku 3B w przypadku szczepu indukowalnego zawsze występują 2 komponenty: zakres liniowy, w którego centrum zawsze będzie znajdować się 200-300 nM CdII, oraz plateau. Spadek sygnału fluorescencji wraz ze wzrostem [CdII] pokazuje, że wyższe stężenia Cd są toksyczne dla komórek, co może wyjaśniać spadek indukowanej produkcji fluorescencji po osiągnięciu plateau przy 1000 nM CdII. Dlatego przy badaniu biodostępności Hg lub Cd w odniesieniu do zmiennej środowiskowej sugerujemy stosowanie 5 nM dla HgII oraz 300 nM dla CdII.

W niektórych przypadkach generowanie sygnału można właściwie przypisać biodostępności Hg lub Cd, jednak w innych sytuacjach na generowanie sygnału może wpływać zmienność stanu fizjologicznego komórki gospodarza biosensora (np. badany metal lub warunki środowiskowe są toksyczne). Na Rysunku 4A biodostępność 5 nM Hg została przetestowana w gradiencie Zn (0-10 µM). Zarówno w szczepach indukowalnych przez Hg, jak i konstytutywnych, obserwuje się podobny spadek sygnału wraz ze wzrostem stężeń Zn. W związku z tym nie można rozstrzygnąć, czy sygnał wynika z obniżonej biodostępności, czy jest efektem toksyczności Zn. Na Rysunku 4B oraz 4C biodostępność 5nM Hg została przetestowana w gradiencie MgII (0-10 mM) oraz MnII (0-10 µM). Zwiększenie stężeń MgII i MnII spowodowało spadek sygnału fluorescencji szczepu indukowalnego. Z drugiej strony szczep konstytutywny nie wykazał spadku fluorescencji przy wzroście stężeń MgII i MnII (MgII i MnII są korzystne dla komórek w produkcji FbFp, o czym świadczy wzrost sygnału fluorescencji). Dowodzi to, że komórki są żywotne, a spadek fluorescencji szczepu indukowalnego przez Hg wynika ze zmniejszenia biodostępności Hg. Dane te podkreślają, jak ważne jest, aby wszystkie testy biosensorowe obejmowały również pomiary konstytutywne ogólnej kondycji komórek.

Wykres odpowiedzi fluorescencyjnej dla jonów Hg(II), Cd(II). Dane ekspresji genów indukowalnej i konstytutywnej.
Rycina 3: Zakresy liniowe biosensora dla rtęci i kadmu. Maksymalna fluorescencja mierzona jako względne jednostki fluorescencji (RFU) ± 1 odchylenie standardowe emitowana przez E. coli NEB5α zawierającą pUC57merR-Pp (indukowalny Hg) oraz pUC19Balch-Pp (konstytutywny) po dodaniu A) HgII (0-15 nM) i B) CdII (0-1,000 nM) w warunkach beztlenowych. Fluorescencja stanowi średnią z 3 powtórzeń technicznych w temperaturze 37 ˚C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy odpowiedzi fluorescencyjnej dla stężeń Zn(II), Mg(II), Mn(II); indukowalny vs konstytutywny.
Rysunek 4: Przykład wyniku niejednoznacznego dla cynku oraz wyników jednoznacznych dla magnezu i manganu. Maksymalna fluorescencja mierzona jako względne jednostki fluorescencji (RFU) ± 1 odchylenie standardowe emitowana przez E. coli NEB5α zawierające pUC57merR-Pp (indukowalny Hg) oraz pUC19Balch-Pp (konstytutywny) po dodaniu A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM) oraz C) MnII (0-10 µM) w warunkach beztlenowych. Stężenie [HgII] ustalono na poziomie 5 nM dla wszystkich prób, a fluorescencja stanowi średnią z 3 powtórzeń technicznych w temperaturze 37 ˚C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Biosensory mikrobiologiczne są użytecznymi narzędziami do identyfikacji mechanizmów, za pomocą których metale wchodzą w interakcje z drobnoustrojami. W tym miejscu opisujemy metodę, która może beztlenowo określić ilościowo biodostępność HgII i CdII dla Gram-ujemnej komórki gospodarza (E. coli) i dać wymierny wynik w ciągu kilku godzin. Jedną z głównych zalet tego protokołu jest to, że umożliwia on szeroką kontrolę specjacji metali w podłożu ekspozycyjnym poprzez unikanie silnych ligandów wiążących lub składników, które mogą prowadzić do wytrącania się metali. Specjacja metali została zamodelowana i przetestowana w tym ośrodku ekspozycyjnym przy użyciu PHREEQC17, jednak można zastosować inne oprogramowanie do specjacji metali. W przypadku braku dodanych ligandów oczekuje się, że specjacja Hg będzie obecna jako 97% Hg(OH)2 i 3% Hg(NH3)22+, podczas gdy specjacja Cd będzie obecna jako 59% Cd-β-glicerofosforanu, 25% Cd2+ i 16% CdSO4. Korzystając z prostego oprogramowania do modelowania termodynamicznego, użytkownik może zaprojektować media ekspozycyjne i przetestować biodostępność interesującego go metalu. Ponadto komórka gospodarza biosensora (E. coli NEB5α) jest zdolna do pracy w szerokim zakresie pH (5-8,5) i stężenia NaCl (0-0,55 M)17.

Metylacja Hg jest procesem beztlenowym, a protokół opisany w tym badaniu nie wymaga tlenu, co pozwala na dokładniejszy opis metabolizmu beztlenowego na biodostępność metali. Jest to ważne, ponieważ obecność tlenu zmienia profile ekspresji genów 48,49, a tym samym potencjalne szlaki transportu; W związku z tym metoda ta ma przewagę nad obecnie istniejącymi alternatywami aerobowymi. Przedstawiony tutaj konstrukt biosensoryczny może być potencjalnie stosowany z innymi beztlenowymi gospodarzami, którzy mogą być bardziej istotni dla metylacji rtęci (np. Geobacter, Desulfovibrio), ale mogą być mniej podatni na manipulacje niż E. coli. Jednym z obecnych ograniczeń przedstawionego tutaj podejścia jest to, że nasza granica wykrywalności nie osiągnęła jeszcze poziomów pM, w przeciwieństwie do istniejących systemów tlenowych 4,19,37. Należy jednak zauważyć, że aby osiągnąć te niskie granice wykrywalności, należy podjąć kilka kroków44: i) wymagane jest dodanie liganda, aby zapewnić, że Hg pozostaje w roztworze i nie adsorbuje się na ścianie komórkowej drobnoustrojów (Hg nieodwracalnie wiąże się z tiolami na powierzchni komórki, zapobiegając jego biodostępności25,27; patrz odpowiedź progowa dla Hg na rysunku 3A), ii) modyfikacje gęstości komórek, lub iii) modyfikacje konstruktu genetycznego w celu uwzględnienia białek transportowych mer-operonu (tj. merT i merP), zwiększając przepływ Hg wewnątrz komórki50,51. Modyfikacje te byłyby korzystne w wykrywaniu niskich stężeń Hg, ale niekoniecznie idealne w przypadku oceny sytuacji istotnych dla środowiska. Podczas gdy poprzednie bioczujniki kadmu istnieją przede wszystkim jako "dowód zasady", zostały zaprojektowane w złożonych podłożach, które nie pozwalają badaczowi ocenić roli specjacji w biodostępności 41,42,43,44.

Bioczujnik jest niezwykle przydatnym narzędziem w określaniu mechanizmów, w których gatunki metali są biodostępne. Ponieważ organizm gospodarza nie jest metylatorem Hg, można go użyć jedynie do opracowania modelu tego, w jaki sposób Hg może dostać się do bakterii Gram-ujemnych, a nie ostatecznego uzasadnienia, w jaki sposób metylatory Hg pozyskują Hg. Istnieją inne metody określania biodostępności Hg, takie jak metylacja, w wyniku absorpcji lub zastosowania metody bilansu masy 10,15,20,45,46. Biorąc to pod uwagę, przedstawiona tutaj metoda oferuje przewagę w postaci danych o biodostępności w czasie quasi rzeczywistym w żywotnych komórkach. Nie zaleca się, aby ta metoda była stosowana do ilościowego określania całkowitych poziomów Hg lub Cd w matrycy środowiskowej. Pomimo proponowanego zastosowania bioczujników do określania stężeń metali w środowisku36, dostępnych jest wiele innych łatwo dostępnych metod standardowych, takich jak ICP-MS, FAAS (do analizy Cd) lub spektroskopia absorpcji atomowej z zimną parą (do analizy Hg). Bioczujnik może być jednak wykorzystany do określenia, czy dana matryca środowiskowa może potencjalnie zwiększać lub hamować biodostępność; Osiąga się to poprzez wykonywanie standardowych dodatków.

pH pożywki ekspozycyjnej może być zmienione do dowolnego miejsca w zakresie od 5 do 8,5, pod warunkiem że wolny kwas MOPS (bufor) zostanie wymieniony na alternatywny wolny kwas buforu o odpowiednim pKa (patrz wykaz odpowiednich (Ferreira i wsp. (2015)47) i dostosowano KOH do odpowiedniego pH podczas wytwarzania mediów ekspozycyjnych. Ponadto metoda nie ogranicza się do Hg i Cd, ale może zostać rozszerzona na inne metale przy użyciu innych regulatorów transkrypcji.

Test narażenia może być zmodyfikowany w celu zbadania wpływu innych akceptorów elektronów, takich jakO2 i fumaran, na biodostępność Hg lub Cd. Drobne modyfikacje metody wykorzystania zarównoO2 , jak i fumaranu jako akceptorów elektronów są dostępne na żądanie.

Podsumowując, chcielibyśmy podkreślić następujące punkty: I) Konieczne jest, aby stężenia zapasów Cd lub Hg były znane w kroku 2, ponieważ zostaną one wykorzystane do kalibracji biosensora. II) W dniu narażenia wzrost komórek musi zostać zatrzymany przy OD600 wynoszącym 0,6 (± 0,1) i należy zachować ostrożność podczas ponownego zawieszania kultur komórkowych, ponieważ bioczujnik jest skalibrowany do tej gęstości komórek. III) Wreszcie, ważne jest, aby podłoże ekspozycyjne było starannie wykonane w dniu ekspozycji. Aby zapewnić powodzenie protokołu, wiele kultur powinno być hodowanych jednocześnie (aby obejść możliwość niepowodzenia wzrostu), a podłoże wzrostowe powinno być ponownie przygotowywane co tydzień (aby obejść metastabilność pożywki i możliwe zanieczyszczenie). Należy również zauważyć, że kontrugrupowania biologiczne (hodowle wielokomórkowe) wykazują zmienność, jeśli chodzi o produkcję sygnału. Chociaż reakcje fluorescencyjne mogą się różnić w zależności od kultury, trendy fluorescencyjne w odpowiedzi na daną zmienną powinny pozostać takie same w wielu kontrpróbach biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować komentarzom od dwóch anonimowych recenzentów, a także członków Laboratorium Poulain za wnikliwą dyskusję na temat rozwoju biosensora beztlenowego. Badanie zostało sfinansowane z nagrody Early Researcher Award przyznanej przez prowincję Ontario oraz grantu Discovery Grant i suplementu akceleracyjnego przyznanego przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada) dla A.J.P.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolka standardowa 7 ml, zaokrąglone wnętrzeDelta Scientific200-007-20zalecana 34
Tacka na fiolki, otwory 21 mmDelta Scientific730-20014 do (siatka 4 x 8)
Zamknięcie 24 mmDelta Scientific600-024-0132 zalecane
NAROŻNIK POKRYWY WCIĘCIE BLK STR CS/50CorningCorning 3931
Corning 96-dołkowa mikropłytka z przezroczystym, niewiążącym dnemCorningCorning 3651
Komora anaerobowa (komora rękawicowa)Powietrze w komorze beztlenowej powinno mieć (97 % N2 ± 2 % i 3 % H2 ± 2 %)
KatalizatorpalladowyPrzekształca O2 na H2O w komorze beztlenowej. Nie jest to wymagane, ale zalecane.
mikropłytek
450 (± 10) Filtr nM do czytnika
500 (± 10) Filtr nM do czytnika
Fiolka do hodowli anaerobowych (probówki balchowe) + korki
SpektrofotometrZmodyfikowany do probówek do hodowli beztlenowych
MA-3000 (analizator rtęci)
SondaKażda sonda pH będzie działać
50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu.
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy z polieterosulfonu + strzykawka
Sterylne/czyste butelkiDo pożywek wzrostowych i wzorców
Sterylne/czyste butelkiDo roztworów alkalicznych (NaOH/KOH)
Odczynniki w proszku: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, sól sodowa ampicyliny, Difco M9 Sole minimalne, glukoza, MgSO4, Tiamina HCl, NaNO3, l-leucyna, l-izoleucyna walina, sól sodowa EDTA, FeSO4, beta-gylcerofosforan sodu, kwas wolny od mopów, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterylna wodaautoklawizowana lub sterylizowana filtrem jest w porządku.
lizogeniczny
Klasa analityczna H2SO4
Czytnik mikropłytekmikropłytekgumowe pH szklane plastikowe lub PTFE Milli-Q Rosół

Bibliografia

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001(2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078(2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Detekcja rtęcidetekcja kadmuwarunki anoksycznebiosensor całokomórkowybiodostępność metalispektrofotometr OD600pomiar fluorescencjifiolka PTFEkomora beztlenowa
Test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.