Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

DOI:

10.3791/58332

⸱

12 października 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) są obiecującą platformą do modulacji immunologicznej ze względu na ich silną zdolność do stymulowania limfocytów T. Substraty bezkomórkowe mają kluczowe zalety w porównaniu z aAPC opartym na komórkach, w tym precyzyjną kontrolę parametrów prezentacji sygnału i właściwości fizycznych powierzchni aAPC w celu modulowania jej interakcji z limfocytami T. Wykazano, że aAPC zbudowany z cząstek anizotropowych, w szczególności cząstek elipsoidalnych, jest bardziej skuteczny niż ich kuliste odpowiedniki w stymulowaniu limfocytów T ze względu na zwiększone wiązanie i większą powierzchnię dostępną do kontaktu z limfocytami T, a także zmniejszony wychwyt niespecyficzny i ulepszone właściwości farmakokinetyczne. Pomimo zwiększonego zainteresowania cząstkami anizotropowymi, nawet powszechnie akceptowane metody generowania cząstek anizotropowych, takie jak rozciąganie cienkowarstwowe, mogą być trudne do wdrożenia i powtarzalnego stosowania.

W tym celu opisujemy protokół szybkiego, ustandaryzowanego wytwarzania biodegradowalnych anizotropowych cząsteczek opartych na cząstkach aAPC o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji sygnału do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo, wraz z metodami charakteryzowania ich wielkości, morfologii i zawartości białek powierzchniowych oraz oceny ich funkcjonalności. Takie podejście do wytwarzania anizotropowego aAPC jest skalowalne i powtarzalne, co czyni je idealnym do generowania aAPC dla "gotowych" immunoterapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) okazały się obiecujące jako czynniki immunomodulujące, ponieważ mogą generować silną odpowiedź limfocytów T specyficzną dla antygenu. Istotne dla tych platform jest ich zdolność do skutecznego prezentowania kluczowych sygnałów do aktywacji limfocytów T. Acellular aAPC są atrakcyjną alternatywą dla aAPC opartego na komórkach, ponieważ są łatwiejsze i mniej kosztowne w produkcji, napotykają mniej wyzwań podczas zwiększania skali i translacji oraz zmniejszają ryzyko związane z terapiami komórkowymi. Acellular aAPC pozwala również na wysoki stopień kontroli nad parametrami prezentacji sygnału i właściwościami fizycznymi powierzchni, która będzie łączyć się z limfocytami T1.

aAPC musi podsumować co najmniej dwa sygnały niezbędne do aktywacji limfocytów T. Sygnał 1 zapewnia rozpoznawanie antygenu i występuje, gdy receptor limfocytów T (TCR) rozpoznaje i angażuje się z MHC klasy I lub II zawierającym pokrewny antygen, czego kulminacją jest sygnalizacja przez kompleks TCR. Aby ominąć wymóg swoistości antygenu, systemy aAPC często zawierają agonistyczne przeciwciało monoklonalne przeciwko receptorowi CD3, które niespecyficznie stymuluje kompleks TCR. Rekombinowane formy MHC, w szczególności multimery MHC, zostały również użyte na powierzchni aAPC w celu zapewnienia swoistości antygenowej2,3. Sygnał 2 to sygnał kostymulacyjny, który kieruje aktywnością limfocytów T. Aby zapewnić kostymulację niezbędną do aktywacji limfocytów T, receptor CD28 jest na ogół stymulowany za pomocą agonistycznego przeciwciała prezentowanego na powierzchni aAPC, chociaż inne receptory kostymulujące, takie jak 4-1BB, zostały skutecznie ukierunkowane4. Białka sygnału 1 i 2 są zwykle unieruchomione na powierzchni sztywnych cząstek w celu syntezy aAPC. Historycznie rzecz biorąc, aAPC były wytwarzane z różnych materiałów, w tym polistyrenu4,5 i żelaza dextran6. Nowsze systemy wykorzystują biodegradowalne polimery, takie jak poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) do generowania aAPC, który można łatwo sprzęgnąć z białkami sygnałowymi, nadaje się do bezpośredniego podawania in vivo i może ułatwiać przedłużone uwalnianie zamkniętych w kapsułkach cytokin lub rozpuszczalnych czynników w celu zwiększenia aktywacji limfocytów T7,8.

Oprócz obecności niezbędnych białek sygnałowych, zaangażowanie receptorów na wystarczająco dużej powierzchni podczas interakcji komórek aAPC/T jest niezbędne do aktywacji limfocytów T. W związku z tym parametry fizyczne aAPC, takie jak rozmiar i kształt, drastycznie zmieniają ich dostępną powierzchnię kontaktową i wpływają na ich zdolność do stymulacji limfocytów T. Wykazano, że aAPC o rozmiarach mikronów jest bardziej skuteczny w stymulowaniu limfocytów T niż ich odpowiedniki w nanoskali9,10. Jednak nano-aAPC może mieć lepszą biodystrybucję i lepszy drenaż do węzłów chłonnych, co może zwiększyć ich wydajność in vivo w porównaniu z micro-aAPC11. Kształt jest kolejną zmienną będącą przedmiotem zainteresowania w systemach aAPC opartych na cząstkach. Ostatnio wykazano, że anizotropowe aAPC są bardziej skuteczne niż cząstki izotropowe w stymulowaniu limfocytów T, głównie ze względu na zwiększoną interakcję z komórkami docelowymi w połączeniu ze zmniejszonym niespecyficznym wychwytem komórek. Komórki preferencyjnie wiążą się z długą osią elipsoidalnych cząstek, a większy promień krzywizny i bardziej płaska powierzchnia pozwalają na większy kontakt między aAPC a limfocytem T12. Długa oś elipsoidalnych cząstek również zniechęca do fagocytozy, co skutkuje wydłużeniem czasu krążenia w porównaniu z cząstkami sferycznymi po podaniu in vivo12,13. Ze względu na te zalety, cząstki elipsoidalne pośredniczą w większej ekspansji limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro i in vivo w porównaniu z cząstkami sferycznymi, efekt obserwowany zarówno w mikroskali, jak i w nanoskali12,13. Istnieją różne strategie wytwarzania cząstek anizotropowych, ale rozciąganie cienkowarstwowe jest prostą, powszechnie akceptowaną metodą używaną do generowania szeregu różnych kształtów cząstek14. Po syntezie cząstki są odlewane w folie i rozciągane w jednym lub dwóch wymiarach w temperaturze wyższej od temperatury zeszklenia materiału cząstkowego. Film jest następnie rozpuszczany w celu odzyskania cząstek. Pomimo rosnącego zainteresowania cząstkami anizotropowymi, obecne podejścia do wytwarzania aAPC na bazie cząstek są w większości ograniczone do układów izotropowych, a metody zmiany kształtu cząstek mogą być trudne do wdrożenia, niekompatybilne z niektórymi strategiami syntezy aAPC oraz nieprecyzyjne i powtarzalne15. Nasza technika rozciągania cienkowarstwowego może być wykonywana ręcznie lub w sposób zautomatyzowany w celu szybkiego wygenerowania cząstek anizotropowych syntetyzowanych z różnych biodegradowalnych polimerów, rozciągniętych do pożądanego współczynnika proporcji w jednym lub dwóch wymiarach15.

Opierając się na naszej poprzedniej pracy, opracowaliśmy podejście oparte na biodegradowalnych cząstkach w połączeniu ze skalowalną technologią rozciągania cienkowarstwowego, aby szybko wygenerować aAPC o regulowanym rozmiarze i kształcie w ustandaryzowany sposób do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo. Nasza strategia koniugacji białek może być wykorzystana do sprzężenia dowolnych białek będących przedmiotem zainteresowania z grupami karboksylowymi na powierzchni cząstek o pożądanej gęstości, co zapewnia temu systemowi aAPC wysoki stopień elastyczności. Opisano również metody charakteryzowania wielkości, morfologii i zawartości białka powierzchniowego aAPC oraz oceny ich funkcjonalności in vitro. Protokół ten można łatwo dostosować do namnażania komórek odpornościowych ex vivo lub in vivo do różnych zastosowań immunoterapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Wytwarzanie sferycznych cząstek PLGA o przestrajalnych rozmiarach

  1. Przygotowanie materiałów do syntezy cząstek
    1. Przygotować 5% w/w roztwór alkoholu poliwinylowego (PVA).
      1. Dodać 500 ml wody dejonizowanej (DI) do kolby Erlenmeyera z mieszadłem magnetycznym i umieścić na mieszadle z płytą grzejną przy 500 obr./min i monitorować temperaturę termometrem. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
      2. Gdy temperatura wody osiągnie około 70 °C, z czasem dodawaj łącznie 25 g PVA w małych partiach, czekając, aż PVA się rozpuści, zanim dodasz więcej.
      3. Gdy całe PVA się rozpuszczą (zwykle 30-60 minut), pozwól roztworowi ostygnąć i przefiltruj sterylnie. Przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
    2. Przygotować roztwór do odlewania folii składający się z 10% w/w PVA i 2% w/w glicerolu.
      1. Dodać 500 ml wody demineralizowanej do kolby Erlenmeyera z mieszadłem magnetycznym. Dodać 8 ml glicerolu o temperaturze pokojowej i wymieszać przez rozcieranie.
      2. Umieścić kolbę na mieszadle z płytą grzejną z prędkością 500 obr./min i monitorować temperaturę za pomocą termometru. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
      3. Gdy temperatura roztworu osiągnie około 70 °C, z czasem dodawać łącznie 50 g PVA w małych partiach, czekając, aż PVA się rozpuści przed dodaniem więcej.
      4. Gdy całe PVA zostanie rozpuszczone (zwykle 60 minut), pozwól roztworowi ostygnąć i sterylnie przefiltruj za pomocą systemu filtrów próżniowych w butelce o wielkości porów 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.
    3. Przygotuj 50 ml 1% w/w roztworu PVA. Dodać 40 ml wody demineralizowanej i 10 ml 5% roztworu PVA (sporządzonego w 1.1.1) do zlewki o pojemności 100-150 ml.
    4. Przygotuj 100 ml 0,5% w/w roztworu PVA. Dodaj 90 ml wody DI i 10 ml 5% roztworu PVA do zlewki o pojemności 150-250 ml.
    5. Dodać mieszadło magnetyczne do 0,5% roztworu PVA i umieścić w okapie chemicznym na płycie mieszającej w temperaturze pokojowej 500 obr./min.
  2. Synteza mikrocząstek
    1. Odważyć 100 mg kwasu poli(mlekowo-koglikolowego) (PLGA) do fiolki scyntylacyjnej i rozpuścić w 5 ml dichlorometanu (DCM). Wir, aby rozpuścić PLGA.
    2. Umieścić homogenizator w 50 ml 1% roztworu PVA tak, aby homogenizator znajdował się jak najbliżej dna zlewki, nie dotykając jej. Włącz homogenizator i ustaw żądaną prędkość - 3 200 obr./min dla cząstek o średnicy 5 μm, 5 000 obr./min dla 3 μm, 15 000 obr./min dla 1 μm (zwiększenie prędkości homogenizacji zmniejsza rozmiar cząstek). Po osiągnięciu żądanej prędkości dodaj roztwór PLGA do zlewki i homogenizuj przez 1 minutę.
    3. Po homogenizacji wlać 1% roztwór mikrocząstek PVA, PLGA do 100 ml 0,5% roztworu PVA na płytce mieszającej i mieszać przez co najmniej 4 godziny w celu odparowania rozpuszczalnika w kapturze chemicznym.
    4. Umyj cząstki 3 razy w wodzie DI.
      1. Wlać roztwór cząstek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przy 3000 x g przez 5 minut. Wylej supernatant i dodaj około 20 ml wody DI.
      2. Ponownie zawieszaj cząstki przez wirowanie. Po ponownym zawieszeniu napełnij probówki stożkowe do 50 ml wodą DI.
      3. Umyj ponownie w ten sam sposób jeszcze dwa razy.
  3. Synteza nanocząstek
    1. Odważyć 200 mg PLGA do fiolki scyntylacyjnej i rozpuścić w 5 ml DCM. Wir, aby rozpuścić PLGA.
    2. Umieścić zlewkę z 50 ml 1% roztworu PVA w pojemniku wypełnionym lodem. Umieść sondę sonitotora w zlewce jak najbliżej dna, nie dotykając jej. Rozpocznij sonikację i natychmiast dodaj roztwór PLGA do zlewki. Sonikować z mocą 12 W przez 2 minuty, aby wytworzyć nanocząstki o przybliżonej średnicy 200 nm.
    3. Po sonikacji wlej 1% roztwór nanocząstek PVA, PLGA do 100 ml 0,5% roztworu PVA na płytce mieszającej i mieszaj przez co najmniej 4 godziny w celu odparowania rozpuszczalnika w kapturze chemicznym.
    4. Wlać roztwór cząstek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia mikrocząstek. Usunąć sklarowany osad i przelać do probówek wirówkowych o dużej prędkości.
    5. Umyj cząsteczki 3 razy wodą DI. Wirować przy 40 000 x g przez 15 minut. Wylać supernatant i ponownie zawiesić w wodzie DI przez wirowanie. Umyj ponownie w ten sam sposób jeszcze dwa razy.

2. Wytwarzanie cząstek polimerowych o przestrajalnym kształcie

  1. Po trzykrotnym umyciu cząstek PLGA należy je ponownie zawiesić w około 1 ml wody DI. Dodać roztwór do odlewania filmu do cząstek, aby uzyskać końcowe stężenie cząstek 2,5 mg/ml.
  2. Odpipetować zawiesinę cząstek w podwielokrotnościach o pojemności 10 ml na prostokątne szalki Petriego o wymiarach 75 x 50 mm w celu jednowymiarowego rozciągania lub w podwielokrotnościach o wymiarach 15 ml na kwadratowe szalki Petriego o wymiarach 100 x 100 mm w celu rozciągnięcia dwuwymiarowego. Usuń bąbelki za pomocą pipety lub odsuwając bąbelki na bok i pozostaw folie do wyschnięcia przez noc w kapturze chemicznym.
  3. Po wyschnięciu folii usuń folie z plastikowych naczyń pęsetą i odetnij krawędzie folii nożyczkami. Zachowaj krawędzie w stożkowej tubie o pojemności 50 ml, aby można je było wykorzystać jako kuliste cząstki.
    1. Załaduj folię na automatyczne urządzenie do rozciągania cienkiej folii, montując folię na aluminiowych blokach. W celu rozciągnięcia 1D, zamontuj folię na aluminiowych blokach jednej osi noszy (Rysunek 2), umieszczając dwie krótkie krawędzie folii pomiędzy dwoma kawałkami gumy neoprenowej. Za pomocą klucza imbusowego przykręć metalowe uchwyty do gumy, aby utrzymać folię na miejscu. W przypadku rozciągania 2D zamontuj wszystkie cztery krawędzie na czterech aluminiowych blokach, aby rozciągnąć się na obu osiach (Rysunek 2).
    2. Zmierz i zapisz długość folii pomiędzy blokami aluminiowymi na jednej osi w przypadku rozciągania 1D lub w obu osiach w przypadku rozciągania 2D. Oblicz odległość wymaganą do rozciągnięcia folii w jednym lub dwóch kierunkach w oparciu o żądane zagięcie-rozciągnięcie.
    3. Umieść urządzenie do rozciągania z folią w piekarniku w temperaturze 90 °C i doprowadź folię do temperatury przez 10 minut. Umieść dużą zlewkę w piekarniku z niewielką ilością wody.
    4. Folia stretch.
    5. Po zakończeniu rozciągania wyjmij urządzenie do rozciągania z piekarnika i pozwól folii ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.
    6. W przypadku rozciągania 1D wytnij folię z urządzenia do rozciągania na krawędziach. W przypadku rozciągania 2D wytnij i zapisz środkowy kwadrat folii, który jest równomiernie rozciągnięty w obu osiach. Umieść folie w stożkowych tubach po 2 folie w tubie i wyrzuć resztę folii.
    7. Dodaj około 25 ml wody DI do każdej stożkowej probówki i wiruj, aż filmy się rozpuszczą.
    8. Po rozpuszczeniu folii przemyj cząsteczki 3 razy wodą DI.
      1. W przypadku mikrocząstek napełnij stożkowe probówki do 50 ml i odwiruj przy 3000 x g przez 5 minut, wylej supernatant, dodaj około 20 ml wody DI i wiruj, aby ponownie zawiesić cząstki.
      2. W przypadku nanocząstek przenieś cząstki do probówek wirówek o dużej prędkości i wiruj przy 40 000 x g przez 15 minut, wylej supernatant, dodaj około 20 ml wody DI i wiruj w celu ponownego zawieszenia cząstek.
    9. Po trzecim praniu ponownie zanurz cząsteczki w około 1 ml wody demineralizowanej. Zapisz masę probówki do mikrowirówki i dodaj cząstki do probówki. Zamrozić cząstki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę lub błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Po zamrożeniu liofilizuj cząsteczki przez noc.
    10. Po liofilizacji zważyć cząstki w probówce mikrowirówki i odjąć zarejestrowaną masę pustej probówki, aby określić masę liofilizowanych cząstek.

3. Koniugacja białek powierzchniowych w celu stworzenia sztucznych komórek prezentujących antygen

  1. Przygotować bufor kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES). Sporządzić 0,1 M roztwór MES w wodzie i dostosować pH do 6,0 przez miareczkowanie 1M wodorotlenkiem sodu (NaOH).
  2. Zawiesić liofilizowane mikro/nanocząstki PLGA/PBAE w stężeniu 20 μg/ml w buforze MES przez wirowanie. Napełnij probówkę z mikrowirówki z polipropylenu 900 μl buforu MES i dodaj do niej 100 μl roztworu cząstek.
  3. Przygotuj roztwór EDC/NHS. Rozpuścić 40 mg 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 48 mg N-hydroksysulfokscynimidu (NHS) w 1 ml buforu MES.
  4. Dodaj 100 μl roztworu EDC/NHS do cząstek i zwiruj, aby wymieszać.
  5. Inkubować probówkę na falowniku w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Wiruj mikrocząstki o wielkości 5 000 x g przez 5 minut lub nanocząstki o wielkości 17 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml PBS poprzez wirowanie (mikrocząstki) lub sonikację przy 2-3 W przez 5 sekund (nanocząstki).
  7. W przypadku mikrocząstek dodaj 8 μg pożądanego białka sygnałowego 1 i 10 μg anty-mysiego CD28 (klon 37.51) do cząstek. W przypadku nanocząstek dodaj 16 μg sygnału 1 i 20 μg anty-mysiego CD28. Dodaj PBS, aby zwiększyć objętość w probówce do 1,1 ml.
  8. Inkubować probówkę na falowniku w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Następnego dnia umyj cząstki. Wiruj mikrocząstki o wielkości 5 000 x g przez 5 minut lub nanocząstki o wielkości 17 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić cząstki w 1 ml sterylnego PBS poprzez wirowanie (mikrocząstki) lub sonikację przy 2-3 W przez 5 sekund (nanocząstki). Powtórz dwa razy.
  10. Zawiesić cząstki o pożądanym stężeniu w pożywce hodowlanej do natychmiastowego użycia. W przypadku długotrwałego przechowywania należy ponownie zawiesić cząstki w stężeniu 10 mg/ml w 100 mM roztworze sacharozy. Zamrażać, liofilizować i przechowywać cząstki w temperaturze -80 °C.

4. Charakterystyka i ocena aAPC

  1. Charakterystyka wielkości i kształtu aAPC (Rysunek 3)
    1. Scharakteryzuj rozmiar i kształt mikrocząstek, obrazując cząstki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). W przypadku obrazowania SEM rozprowadź liofilizowane cząstki na taśmie węglowej przyklejonej do aluminiowej pinezki i napyl powłokę złoto-palladową.
    2. Analizuj rozmiar i proporcje cząstek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    3. Aby określić wielkość cząstek, ustaw skalę za pomocą podziałki i zmierz średnicę cząstek. Powtórz tę czynność dla około 100 cząstek, aby określić średnią średnicę cząstek i wygenerować histogram rozmiarów cząstek.
    4. Aby określić współczynnik proporcji, zmierz odległość w poprzek długiej i krótkiej osi cząstek i podziel długą oś przez krótką oś. Powtórz te czynności dla około 50 cząstek każdego kształtu, aby określić średni współczynnik proporcji cząstek dla każdego kształtu i wygenerować histogramy.
    5. Scharakteryzuj rozmiar i kształt nanocząstek, obrazując cząstki za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Analizuj rozmiar i proporcje nanocząstek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jak opisano w 5.1.2. Alternatywnie można zmierzyć rozmiar sferycznych nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) lub analizy śledzenia nanocząstek (NTA).
  2. Wydajność koniugacji białek
    1. Przygotować aAPC zgodnie z metodami 1-3, ale w kroku 3.7 użyć znakowanego fluorescencyjnie białka sygnału 1 i anty-mysiego CD28. Po koniugacji i umyciu ponownie zawiesić aAPC w 1 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml aAPC.
    2. Przygotuj wzorce białkowe w czarnej polistyrenowej 96-dołkowej mikropłytce. Dodać 5 μg znakowanego fluorescencyjnie białka sygnałowego 1 do PBS w pierwszym dołku płytki i wykonać 10 rozcieńczeń 1:2 w PBS w poprzek rzędu płytki. Pozostaw ostatnią studzienkę pustą. Powtórz ten krok, aby wygenerować kolejny zestaw wzorców z fluorescencyjnie znakowanym anty-CD28.
    3. Odpipetować 100 μl roztworu aAPC do powtórzonych studzienek z mikropłytką z czarnego polistyrenu w trzech egzemplarzach.
    4. Odczytaj fluorescencję na czytniku płytek fluorescencyjnych na odpowiednich długościach fal. Użyj odczytów fluorescencji z wzorców białek, aby wygenerować krzywe wzorcowe dla każdego przeciwciała fluorescencyjnego. Korzystając z krzywej wzorcowej, oblicz stężenia sygnału 1 i anty-CD28 w każdym dołku próbki, a następnie oblicz ilość białka powierzchniowego i wydajność koniugacji (Rysunek 4A, Rysunek 5A).
  3. Ocena aAPC do stymulacji in vitro limfocytów T CD8+
    1. Przygotuj pożywkę B' (pożywka RPMI uzupełniona L-glutaminą, 10% FBS, 1% nieistotny roztwór aminokwasów, 1% pirogronian sodu, 1% roztwór witaminy MEM, 92 μM β-merkaptoetanol, 10 ng/ml cyprofloksacyny i 30 U/ml IL-2.
    2. Poświęć mysz Black 6 poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla.
    3. Zbierz śledzionę od myszy zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem16. Zbierz śledzionę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10-15 ml PBS. Za pomocą tłuczka przetrzyj śledzionę przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Podczas zacierania umyj sitko 40 ml PBS.
    4. Wiruj splenocyty o masie 300 x g przez 5 minut. Odlej supernatant i ponownie zawieś splenocyty w 4 ml buforu Ack Lysing Buffer w celu lizy czerwonych krwinek. Pozostaw probówkę w spokoju przez 1 minutę, a następnie dodaj PBS, aby zwiększyć objętość w probówce do 20 ml.
    5. Wiruj komórki w masie 300 x g przez 5 minut. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    6. Obracać komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w żądanej objętości bufora do separacji komórek. Wyizolować limfocyty T CD8 + z zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T CD8 + o ujemnej selekcji, zgodnie z protokołem producenta.
    7. Po separacji magnetycznej wirować limfocyty T CD8 + przy 300 x g przez pięć minut i usunąć bufor separacji komórek. Ponownie zawieś komórki w 1 ml PBS i policz komórki. Oznacz ogniwa estrem karboksyfluoresceiny sukcynylu (CFSE) zgodnie z protokołem producenta.
    8. Inkubować 8,333 limfocytów T CD8 + i 0,0833 mg (lub pożądaną dawkę) aAPC w 150 μl B' pożywki w każdym dołku 96-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej w kształcie litery U.
    9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Po 3-4 dniach odświeżyć pożywkę, dodając 75 μl świeżej pożywki do każdej studzienki.
    10. Po 3 dniach inkubacji przeanalizuj komórki znakowane CFSE na cytometrze przepływowym, aby ocenić proliferację. Każdy pik na histogramie CFSE cytometrii przepływowej reprezentuje pokolenie komórek spowodowane rozcieńczeniem CFSE przy każdym kolejnym podziale komórki.
    11. Po 7 dniach użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek w każdym dołku. Przed zliczeniem wybarwić martwe komórki roztworem błękitu trypanowego. Wyklucz martwe komórki z końcowej liczby komórek. Znormalizuj końcowe stężenie komórek do początkowego stężenia, aby obliczyć krotność (Rysunek 4 i Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat automatycznego urządzenia do rozciągania cienkich folii 2D znajduje się w Rysunek 1. Schemat i opis urządzenia do rozciągania cienkich warstw 1D znajduje się w Ho et al.17 Napinacze są zbudowane z części aluminiowych przy użyciu standardowych technik frezowania i obróbki skrawaniem. Podobnie jak nosze 1D, nosze 2D składają się z metalowych uchwytów i szyn prowadzących. Dwukierunkowe pociągowe służą do przekształcania ruchu lini...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje wszechstronną metodę precyzyjnego generowania anizotropowych cząstek polimerowych. Opisana tutaj technika rozciągania cienkich warstw jest skalowalna, wysoce powtarzalna i niedroga. Alternatywne techniki generowania cząstek anizotropowych mają wiele ograniczeń, w tym wysokie koszty, niską przepustowość i ograniczoną wielkość cząstek. Podejście polegające na rozciąganiu cienkich warstw jest również korzystne, ponieważ cząstki są modyfikowane tak, aby po syntezie były anizotropowe, a w rezu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EBA (DGE-1746891) i KRR (DGE-1232825) dziękują programowi NSF Graduate Research Fellowship za wsparcie. RAM dziękuje National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) oraz Achievement Rewards for College Scientists Fellowship za wsparcie. Autorzy dziękują NIH (R01EB016721 i R01CA195503), Research to Prevent Blindness James and Carole Free Catalyst Award oraz JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli(alkohol winylowy), MW 25000, 88% hydrolizowanyPolysciences, Inc.02975-500
GlicerolSigma-AldrichG9012
Termometr cyfrowyFlukeN/ANazwa modelu: Zanurzeniowa sonda temperatury Fluke 52 II
FlukeN/ANazwa modelu: Cyfrowa płyta grzejna Fluke 80PK 22
i MieszadłoBenchmark ScientificH3760-HS
Mieszadło wielopunktoweThermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid)Sigma-Aldrich719900
DichlorometanHomogenizator Sigma-AldrichD65100
IKA 
SonicatorSonics & Materiały, Inc.Nie dotyczyNumer modelu: VC 505
Obudowa dźwiękochłonna SonicatorSonics & Materiały, Inc.Nie dotyczy Numerczęści: 630-0427
Sonda SonicatorSonics & Materiały, Inc.Nie dotyczy Numerczęści: 630-0220
Mikrokońcówka SonicatorSonics & Materiały, Inc.Nie dotyczyNumer części: 630-0423
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterN/ANumer modelu: J-20XP (wycofany z produkcji), alternatywny model: J-26XP
Wirnik wirówki szybkoobrotowejBeckman Coulter369691Numer modelu: JA-17
Wysokoobrotowe probówki wirówkowe z poliwęglanuThermo Fisher Scientific3118-005050 mL, nakrętka
Prostokątny jednorazowy Petri talerzVWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
Kwadratowa jednorazowa szalka PetriegoVWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF  Oczyszczony anty-mysz CD3 i epsilon; PrzeciwciałoBiolegend100314
InVivoMab anty-mysie CD28, klon 37.51Bio X CellBE0015-1
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimiduSigma-AldrichE6383
Sól sodowa N-hydroksysulfosukcynimiduSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-mysie CD3Biolegend100212
APC przeciwciało anty-mysie CD28Biolegend102109
Corning  96 Well Solid Mikropłytka polistyrenowaSigma-AldrichCLS3915płaskim dnem, czarnym polistyrenem
Probówki białkowe LoBind, 1,5 mlEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-glutamina)ThermoFisher Scientific11875093
Surowica bydlęcaSigma-AldrichF4135Inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana
cyprofloksacynaSigma-Aldrich17850
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Rekombinowana ludzka IL-2 (bez nośnika)Biolegend589102
pirogronian sodu (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM Witamina Roztwór (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  Zestaw do izolacji komórek T, myszMiltenyi Biotech130-104-075
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSEKolumny ThermoFisher ScientificC34554
LSMiltenyi Biotech130-042-401
Separator MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Cytometr przepływowyAccuri C6
Synergy 2 Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjamiBioTek
autoMACS Bufor do bieganiaMiltenyi BIotech130-091-221
Sitko do komórekThermoFisher Scientific22363548Sterylne, 70 &mikro; m Siatka nylonowa
ACK Bufor LysingThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Black 6) MyszThe Jackson Laboratory000664Mężczyzna, co najmniej 7 tygodni
Płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery UVWR353227Sterylne, 96-dołkowe płytki polistyrenowe poddane hodowli tkankowej
Zasilacz 40 V DCProbotixLPSK-4010
PTFE Mouser z drutu powlekanego602-5858-100-01Dotyczy to szpuli o długości 100 stóp, ale równoważny drut będzie działał
Sterownik silnika krokowegoProbotixMondoStep5.6
Zestaw złączy IDCProbotixIDCM-10-12
MikrokontrolerProbotixPBX-RF
4A BezpiecznikiRadio Shack2701026Równoważne bezpieczniki również będą działać
DB25 męski na męskiProbotixDB25-6
Zszywkikablowe USB-A do USB-B2094915Równoważny również będzie działał
8-pinowe złącza Amphenol Męska i żeńskamysz654-97-3100A-20-7P i 654-97-3106A20-7S
Silnik krokowyProbotixHT23-420-8
Śruba pociągowa prawostronnaRoton60722
Śruba pociągowa lewoskrętnaRoton60723
McMaster Carr92196A151
Guma neoprenowaMcMaster Carr8698K51
Prawostronna nakrętka ołowiana z kołnierzemRoton91962
Lewostronna kołnierzowa nakrętka ołowianaRoton91963
Komputer sterujący LinuxProbotixLCNC-PCKażdy komputer o pasującej specyfikacji i systemie operacyjnym Linux będzie działał
System filtrów próżniowych butelkowych CorningSigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Solution, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
0003725001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Anizotropowe cz stki polimerowesynteza cz stek PLGArozci ganie cienkich film wwytwarzanie cz stek elipsoidalnychtest aktywacji limfocyt w Ttransmisyjna mikroskopia elektronowaskaningowa mikroskopia elektronowawydajno koniugacji bia ekgotowa do u ycia immunoterapia

Powiązane artykuły