Artykuł metodologiczny

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58333

⸱

19 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Streszczenie

Pomimo wyjątkowej zakaźności wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) in vivo, gdzie tylko trzy genomy wirusa mogą prowadzić do przewlekłości eksperymentalnie zakażonych szympansów, większość modeli in vitro wymaga od kilkuset do tysięcy genomów wirusowych na komórkę, aby zainicjować przejściową infekcję. Dodatkowo, statyczne hodowle 2D pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) pozwalają na krótkoterminowe badania ze względu na ich szybkie odróżnicowanie. W tym miejscu opisujemy 3D hodowle wątroby na chipie PHH, zarówno w monokulturach, jak i w kokulturach z innymi komórkami niemiąższowymi rezydującymi w wątrobie. Zapewniają one znaczną poprawę w badaniu długotrwałych zakażeń HBV z fizjologiczną odpowiedzią komórek gospodarza. Oprócz ułatwienia badań skuteczności leków, analiz toksykologicznych i badań nad patogenezą, te systemy hodowli mikroprzepływowych umożliwiają ocenę terapii leczniczych zakażenia HBV mających na celu eliminację kowalencyjnie zamkniętego, kolistego (ccc)DNA. Przedstawiona metoda opisuje budowę monokultur PHH i kokultur komórkowych PHH/Kupffera, ich zakażenie oczyszczonym HBV oraz analizę odpowiedzi gospodarza. Metoda ta ma szczególne zastosowanie w ocenie długoterminowych skutków zakażenia HBV, kombinacji leczenia i patogenezy.

Wprowadzenie

Badanie HBV zostało skomplikowane ze względu na słabą podatność systemów hodowlanych, wymagającą od kilkuset do tysięcy kopii genomu HBV na komórkę do zainicjowania infekcji1. Co więcej, pierwotne ludzkie hepatocyty są na ogół wyjątkowo delikatne i szybko się deróżnicują podczas konwencjonalnych hodowli2. Wynika to głównie z faktu, że płaskie i twarde powierzchnie z tworzywa sztucznego nie naśladują naturalnego środowiska zewnątrzkomórkowego znajdującego się w wątrobie oraz ogólnego braku natlenienia kultur przy braku krążenia mikroprzepływowego. Konwencjonalne statyczne hodowle hepatocytów na płytkach pokrytych kolagenem szybko się różnicują i tracą podatność na zakażenie HBV3. Tutaj opisujemy konfigurację i infekcję PHH hodowanego w 3D kulturach wątroby na chipie, które są znacznie lepsze od konwencjonalnych statycznych kultur PHH 2D na płytkach pokrytych kolagenem ze względu na ich rozszerzone kompetencje metaboliczne i funkcjonalne, ułatwiając długoterminowe hodowle trwające co najmniej 40 dni4. W tym systemie PHH są wysiewane na rusztowaniach pokrytych kolagenem, które są stale perfundowane pożywką wzrostową w celu dostarczania tlenu i składników odżywczych do komórek. Mimo że alternatywne systemy hodowli PHH oparte na złożonych kokulturach mysich fibroblastów lub wzroście 3D sferoidów zostały zatwierdzone i są podatne na zakażenie HBV przy użyciu wielokrotności infekcji 500 równoważników genomu (GE) HBV na komórkę, hodowle 3D wątroby na chipie pozostają jedynym systemem modelowym in vitro podatnym na 0,05 GE HBV na komórkę4. Jest to dodatkowo poparte koniecznością stosowania wysokich stężeń dimetylosulfotlenku (DMSO) i glikolu polietylenowego (PEG) w celu wykrycia zakażenia HBV w tych hodowlach, co jest zbędne w przypadku infekcji 3D systemów hodowli wątroby na chipie4. Jedną z głównych cech charakterystycznych zakażenia HBV jest pula cccDNA, która działa jako szablon transkrypcyjny dla wszystkich wirionów wytwarzanych de novo5,6. Mimo że cccDNA można wykryć w konwencjonalnych hodowlach hepatocytów7,8, nie jest jasne, czy regulacja cccDNA i wszelkie podejścia terapeutyczne mające na celu jego eliminację znajdują odzwierciedlenie w częściowo lub całkowicie zdedyferencjowanych hepatocytach. Wykazaliśmy, że cccDNA jest funkcjonalnie formowane w hodowlach 3D wątroby na chipie, reaguje na bodźce fizjologiczne i może być celowane poprzez zakłócanie dostępu maszynerii transkrypcyjnej do genomu cccDNA 4.

Reakcje gospodarza na zakażenie HBV w 3D wątroby na chipie naśladują te obserwowane u pacjentów zakażonych HBV, umożliwiając identyfikację biomarkerów infekcji, jak również sukces terapeutyczny. Jedną z unikalnych cech hodowli wątroby na chipie jest możliwość oceny długoterminowych odpowiedzi gospodarza między PHH a innymi komórkami niemiąższowymi w wątrobie, w tym komórkami Kupffera4, komórkami gwiaździstymi9 i sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby10,11. Daje to wyjątkową możliwość oceny interakcji komórka/komórka w złożonym mikrośrodowisku 3D.

Dodatkowo, przedłużony okres hodowli tej platformy ułatwia ocenę sekwencyjnych terapii lekowych i ich wpływu na trwałość HBV, co nie jest możliwe przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli hepatocytów.

Ten protokół opisuje, jak generowane są hodowle 3D wątroby na chipie, zarówno dla monokultur PHH, jak i dla kokultur PHH z komórkami Kupffera. Ponadto opisujemy wytwarzanie oczyszczonego wirusa HBV w badaniach nad niską liczbą zakażeń, a także późniejszą analizę odpowiedzi gospodarza i wirusa.

Protokół

1. Montaż i równoważenie płyt

  1. Upewnij się, że zarówno sprężarka, jak i pompa próżniowa powiązane z platformą LiverChip są włączone. Wykonaj montaż i wyważanie płyt w szafie klasy II.
  2. Aseptycznie zmontuj płytki mikroprzepływowe, umieszczając sterylną membranę między podstawą płytki i dodając dobrze zawierającą płytkę górną (Rysunek 1a).
  3. Upewnij się, że sterylna membrana płynnie spoczywa na dwóch kołkach płyty podstawy, ponieważ nierównomierne ułożenie membrany utrudnia krążenie mikroprzepływowe.
  4. Dodaj sterylną pokrywkę płytki i dokręć u podstawy płytki za pomocą automatycznego precyzyjnego momentu obrotowego do 33 funtów, używając spiralnej sekwencji dokręcania. Upewnij się, że wszystkie są dokręcone momentem 35 funtów za pomocą ręcznego momentu obrotowego. Na tym etapie upewnij się, że są dokręcone symetrycznie (Rysunek 1a).
  5. Wstępnie rozgrzana pożywka do wysiewu hepatocytów zawierająca pożywkę Williams E, podstawowe suplementy do rozmrażania hepatocytów i posiewu, 5% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 1 μM deksametazon do temperatury 37 °C przed kondycjonowaniem.
  6. Całkowicie zmontowaną płytkę należy zagruntować, umieszczając ją w doku myjącym i dodając 400 μl pożywki do wysiewu hepatocytów po stronie zbiornika każdej studzienki. Upewnij się, że płyta całkowicie zatrzasnęła się w doku myjącym.
  7. Zainicjuj przepływ w kierunku do góry na 3,5 minuty przy 1 μl/s. Pomyślne działanie cyrkulacji mikroprzepływowej można stwierdzić za pomocą czerwonych wskaźników z boku płytki (Rysunek 1a).
  8. Gdy pożywka zostanie przepompowana na stronę wzrostu komórek płytki, zapewniając prawidłowe złożenie kanału przepływowego, dodaj dodatkowe 1,2 ml pożywki do wysiewu hepatocytów.
  9. Ostrożnie przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i zainicjuj przepływ w górę z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 16 godzin (Rysunek 1c).
  10. Przenieś płytkę do doku myjącego i wyeliminuj pęcherzyki w studzience, delikatnie pipetując w górę iw dół.
  11. Dodaj jedną sterylną, okrągłą bibułę filtracyjną, a następnie rusztowanie do mocowania komórek i pierścień ustalający, do każdej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Dociśnij każdą studzienkę sterylnym tłokiem, aby zablokować pierścienie ustalające i rusztowania na miejscu (Rysunek 1b).
  12. Odessać całe podłoże i delikatnie dodać 400 μl podgrzanej pożywki do wysiewu hepatocytów na rusztowanie i zainicjować przepływ w kierunku w dół przez 3,5 minuty przy 1 μl/s.
  13. Odessać całe medium wypompowane ze strony zbiornika płytki. Ten krok jest konieczny do wymiany medium zawartego w kanale przepływowym.
  14. Dodaj 1,4 ml pożywki do wysiewu hepatocytów do każdej studzienki przed powrotem płytki do doku, aby uzupełnić całkowitą objętość na studzienkę. Objętość na studzienkę wynosi teraz 1,6 ml (1,4 ml w studzience i 0,2 ml w kanale przepływowym).

2. Rozmrażanie i wysiewanie hepatocytów dla monokultur

  1. Podgrzej pożywkę do rozmrażania hepatocytów i pożywkę do wysiewu hepatocytów do temperatury 37 °C przed rozmrożeniem jednej fiolki PHH zgodnie z instrukcjami dostawców. Na tym etapie użyj wirówki o temperaturze pokojowej, aby uniknąć nagłych zmian temperatury. Wykonaj rozmrażanie i wysiewanie hepatocytów w komorze klasy II.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wysiewającej hepatocyty i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego. Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%.
  3. Trzymaj komórki na lodzie, dopóki nie zostaną dodane do studzienek.
  4. Przenieść zrównoważoną i w pełni zmontowaną płytkę do doku myjącego i odessać całe medium ze studzienek.
  5. Dodaj 600 000 hepatocytów do każdej studzienki w objętości 500 μl pożywki wysiewającej hepatocyty.
  6. Zainicjuj przepływ w dół przy natężeniu przepływu 1 μl/s i doprowadź całkowitą objętość w studzience do 1,6 ml, dodając 900 μl pożywki do wysiewu hepatocytów.
  7. Przenieść płytkę do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .
  8. Zainicjować przepływ w dół przy natężeniu przepływu 1 μl/s przez 8 godzin, a następnie odwrócenie przepływu w kierunku górnym przy natężeniu przepływu 1 μl/s przez 8 godzin.
  9. Przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek.
  10. Dodać 400 μl pożywki podtrzymującej hepatocyty (pożywka Williams E uzupełniona suplementami podtrzymującymi hepatocyty i deksametazonem 100 nM) do każdej studzienki i zainicjować przepływ w kierunku w dół z szybkością przepływu 1 μl/s przez 3,5 min.
  11. Odessać całą pożywkę ze zbiornika i dodać 1,4 ml pożywki podtrzymującej hepatocyty (Rysunek 1d).
  12. Pożywkę należy wymieniać na pożywkę podtrzymującą hepatocyty co 48 godzin. Aby upewnić się, że cała pożywka w studzience została wymieniona, należy wykonać etap płukania przed dodaniem świeżej pożywki konserwującej hepatocyty.
  13. Na etapie mycia przenieś płytkę do doku myjącego, odessaj całe medium ze studzienek i dodaj 400 μl pożywki konserwacyjnej.
  14. Zainicjuj przepływ w dół z prędkością 1 μl/s przez 3,5 minuty. Zassać całe medium pojawiające się po stronie zbiornika studzienek.
  15. Dodać 1,4 ml pożywki podtrzymującej hepatocyty i w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i z 5% CO2 przenieść płytkę do stacji dokującej i zainicjować przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 48 godzin (Rysunek 1f).
    nuta: W przypadku monokultur hepatocytów stosowanych jako kontrola dla kokultur, w celu zapewnienia kontrolowanych warunków, stosuje się drugi rodzaj pożywki podtrzymującej, która jest specyficzna do stosowania w kokulturach z pierwotnymi ludzkimi komórkami Kupffera. 48 godzin po zastąpieniu pożywki do wysiewu hepatocytów pożywką podtrzymującą hepatocyty (dzień 3 po wysiewie), zwykła pożywka podtrzymująca hepatocyty zostanie zastąpiona pożywką podtrzymującą kokulturę II, szczególnie w monokulturach PHH w porównaniu z kokulturami zarówno PHH jak i komórek Kupffera, ponieważ składniki pożywki różnią się nieznacznie.

3. Rozmrażanie i wysiewanie komórek Kupffera i hepatocytów do kokultur

  1. Aby zapewnić dokładne porównanie wyników, należy zawsze porównywać kokultury komórkowe PHH/Kupffer z monokulturami PHH
  2. W przypadku kokultur komórek PHH i Kupffera należy rozmrozić jedną fiolkę komórek Kupffera w zaawansowanej zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (AdDMEM) firmy Dulbecco bez deksametazonu, ale uzupełnionej podstawowymi suplementami do rozmrażania i posiewu hepatocytów (pożywka do wysiewu kokultury) zgodnie z instrukcjami dostawców. Przeprowadzić rozmrażanie i wysiewanie komórek Kupffera i hepatocytów w komorze klasy II.
  3. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki do wysiewu kokultury i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego. Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%.
  4. Utrzymuj komórki na lodzie przed dodaniem ich do studzienek, aby uniknąć przylegania komórek.
  5. Postępuj zgodnie z instrukcjami w krokach 2.1–2.3 w celu rozmrożenia pierwotnych ludzkich hepatocytów.
  6. Przenieść zrównoważoną i w pełni zmontowaną płytkę do doku myjącego i odessać całe medium ze studzienek.
  7. Dodać 60 000 komórek Kupffera i/lub 600 000 hepatocytów do każdej studzienki w łącznej objętości 250 μl każdej pożywki do wysiewu kokultury.
  8. Zainicjuj przepływ w dół przy natężeniu przepływu 1 μl/s i dodaj 900 μl pożywki do siewu kokultury do każdej studzienki.
  9. Przenieść płytkę do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .
  10. Zainicjować przepływ w kierunku spadkowym przy natężeniu przepływu 1 μL/s przez 8 godzin, a następnie odwrócenie przepływu w kierunku górnym przy natężeniu przepływu 1 μL/s przez 8 godzin.
  11. Przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek.
  12. Dodać 400 μl pożywki podtrzymującej kokulturę I (AdDMEM bez deksametazonu, ale uzupełnionego suplementami podtrzymującymi hepatocyty) do każdej studzienki i zainicjować przepływ w kierunku w dół z szybkością przepływu 1 μl/s przez 3,5 min.
  13. Odessać całą pożywkę od strony zbiornika i dodać 1,4 ml pożywki podtrzymującej kokulturę I do każdej studzienki.
  14. Przenieść płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i zainicjować przepływ w górę z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 48 godzin.
  15. Przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek. Dodać 400 μl pożywki podtrzymującej II (pożywka Williams E bez deksametazonu, ale uzupełniona hydrokortyzonem 100 nM i suplementami podtrzymującymi hepatocyty) i zainicjować przepływ w kierunku w dół przy 1 μl/s przez 3,5 min.
  16. Zassać całe podłoże pojawiające się po stronie zbiornika studzienek.
  17. Dodać 1,4 ml pożywki do konserwacji kokultury II i przenieść płytkę do stacji dokującej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .
  18. Zainicjuj przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 48 godzin (Rysunek 1e).
  19. Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin na pożywkę do konserwacji kokultury II. Aby upewnić się, że całe podłoże w studzience zostało wymienione, wykonaj etap mycia przed dodaniem świeżego podłoża.
  20. Aby umyć, przenieś płytkę do doku myjącego, odessaj całe podłoże z dołków i dodaj 400 μl pożywki do konserwacji kokultury II.
  21. Zainicjuj przepływ w dół z prędkością 1 μl/s przez 3,5 minuty. Zassać całe medium pojawiające się po stronie zbiornika studzienek.
  22. Dodać 1,4 ml pożywki do konserwacji kokultury II i przenieść płytkę do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i zainicjować przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 48 godzin (Rysunek 1f).

4. Produkcja wirusa zakaźnego zapalenia wątroby typu B do badań nad infekcjami

  1. Wykonaj tę sekcję protokołu w laboratorium poziomu przechowawczego III. Wykonaj wysiew, zmiany pożywki, zbieranie pożywki i stężenie wirusa w komorze klasy II.
  2. Hodowla komórek wytwarzających HBV (np. HepDE19, HepAD38) w pokrytych kolagenem 5-warstwowych kolbach T1000 w 120 ml kompletnego DMEM/F12 (10% FBS, penicylina/steptomycyna, aminokwasy endogenne, 500 μg/ml G418 i 1 μg/ml tetracykliny), aż osiągną 90% zgrywki.
  3. Zmienić pożywkę na pożywkę indukcyjną (kompletny DMEM bez tetracykliny) w celu indukcji produkcji HBV.
  4. Zbierać pełną objętość pożywki co 48 godzin przez 12 dni po odstawieniu tetracykliny i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  5. Przefiltruj zebrane podłoże przez filtr butelkowy 0,45 μm.
  6. Dodać sterylny PEG 8000 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zebranej pożywki do końcowego stężenia 4% w/w, wymieszać przez odwrócenie 8x–10x i inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Wirować przy 10 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zebrania wirusa wytrąconego przez PEG i ponownie zawiesić osad w PBS zawierającym 10% FBS.
  7. Połącz wirusa wytrąconego PEG ze wszystkich punktów czasowych zbioru i ułóż go na 20% poduszce sacharozy. Wirować przy 140 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika SW28.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS uzupełnionym 10% FBS, a następnie poddzielić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  9. Określić liczbę kopii DNA HBV obecną w supernatancie za pomocą qPCR DNA HBV (krok 6).

5. Zakażenie kultur 3D wirusem HBV

  1. Przeprowadzaj infekcje w komorze klasy II w laboratorium poziomu zabezpieczenia.
  2. 3 dni po wysianiu monokultur lub kokultur rozmrozić wymaganą liczbę podwielokrotności zawierających HBV w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć wymaganą dawkę wirusa odpowiednio w 1,8 ml pożywki podtrzymującej hepatocyty lub pożywki podtrzymującej kokulturę II na studzienkę.
  3. Ten rozcieńczony o pojemności 1,8 ml wirus jest wystarczający do przemycia (400 μl) i wymiany pożywki w studzience (1,4 ml). Jednak wymagana wielokrotność infekcji musi zostać dostosowana, aby uwzględnić końcową objętość kultury wynoszącą 1,6 ml.
  4. Przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek. Dodać 400 μl pożywki zawierającej HBV i zainicjować przepływ w dół z prędkością 1 μl/s przez 3,5 minuty. Zassać całe podłoże pojawiające się po stronie zbiornika studzienek.
  5. Dodać 1,4 ml pożywki konserwacyjnej zawierającej HBV/pożywki do konserwacji kokultury II do studzienki i przenieść płytkę do stacji dokującej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 . Zainicjować przepływ w kierunku spadkowym przy natężeniu przepływu 1 μL/s przez 8 godzin, a następnie odwrócenie w kierunku do góry przy natężeniu przepływu 1 μL/s.
  6. Po upływie 24 godzin od dodania HBV przenieść płytkę do doku myjącego i odessać całe medium ze studzienek.
  7. Umyj każdą studzienkę na płytce 3x odpowiednią pożywką, zgodnie z rodzajem hodowli, jak opisano w krokach 2.12–2.14, aby wyeliminować resztki wirusa ze studzienki. W przeciwieństwie do kroków 2.12–2.14, dodaj 1,6 ml pożywki do każdej studzienki, aby uwzględnić dodatkową objętość, która ma zostać pobrana, aby wykluczyć przeniesienie inokulum (Rysunek 1g).
  8. Postępując zgodnie z tymi etapami przemywania, należy pobrać 200 μl pożywki z każdej studzienki, aby potwierdzić całkowite usunięcie inokulum HBV poprzez ilościowe oznaczanie zewnątrzkomórkowego DNA HBV.
  9. Przenieść płytkę do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i zainicjować przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu 1 μL/s przez 48 godzin.
  10. 48 godzin później zbierz pełną objętość studzienki do dalszej analizy, a następnie trzykrotnie przepłucz pożywką podtrzymującą hepatocyty, jak opisano w krokach 2.12–2.14. Wymień pożywkę i myj każdą studzienkę 3 razy co 48 godzin, aż do zakończenia eksperymentu.

6. Kwantyfikacja zewnątrzkomórkowego DNA HBV

  1. Wyizolować całkowite DNA z supernatantów hodowlanych zgodnie z instrukcjami producenta z dodatkiem 1 μg nośnego RNA w laboratorium o poziomie hermetyczności, aby zapewnić inaktywację wirusa w próbkach przed przeniesieniem ich do innego obszaru.
  2. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą ilościową mieszaninę wzorcową PCR, starter do przodu 600 nM, starter odwrotny 600 nM i 300 nM sondy.
  3. Dodać 7 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
  4. Dodaj 5 μl próbek DNA w duplikacie, kontrolę bez matrycy i duplikaty seryjnie rozcieńczonego wzorca plazmidowego opartego na plazmidzie zawierającym genom HBV (np. pCMV-HBV) w zakresie od 109 kopii na reakcję do 102 kopie na reakcję do każdej studzienki płytki qPCR.
  5. Umieść samoprzylepną osłonę na płycie i upewnij się, że każda studzienka jest prawidłowo uszczelniona.
  6. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 300 x g.
  7. Rozpocznij przebieg qPCR zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki cyklu dla PCR w czasie rzeczywistym to 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min.
  8. Określić ilościowo liczbę kopii DNA HBV w nieznanych próbkach zgodnie z krzywą standardową.

7. Kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pregenomicznego (pg)RNA HBV

  1. Wyizolować całkowite RNA z rusztowań zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zapewnić całkowitą lizę komórek, należy wirować każde rusztowanie 3 razy przez 30 sekund, a następnie odwirować przy 300 x g przez 1 minutę między każdym wirowaniem. Przeprowadź lizę komórek w laboratorium poziomu hermetyczności III, aby zapewnić inaktywację wirusa w próbkach przed przeniesieniem ich do innego obszaru.
  2. Transkrybuj cDNA z wyizolowanego RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Warunki cyklu dla retrotranskrypcji to 25 °C przez 10 min, 37 °C przez 120 min i 85 °C przez 5 min.
  4. Próbki cDNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
  5. Przygotować mieszaniny główne dla pgRNA i RPS11 zawierające ilościową mieszaninę wzorcową PCR oraz startery do przodu i do tyłu dla pgRNA i RPS11 (stosowanych jako gen porządkowy) w końcowym stężeniu 0,2 μM.
  6. Dodać 7,5 μl mieszanki głównej i 2,5 μl cDNA na basenik na płytkę 384-dołkową. Zmierz RPS11 i pgRNA każdej próbki w dwóch egzemplarzach i uwzględnij studzienkę kontrolną bez matrycy dla obu genów.
  7. Umieść samoprzylepną osłonę na płycie i upewnij się, że każda studzienka jest całkowicie uszczelniona.
  8. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 300 x g.
  9. Włożyć płytkę do cyklera qPCR i rozpocząć przebieg qPCR przy użyciu standardowego ilościowego protokołu PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki cyklu dla PCR w czasie rzeczywistym to 50 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min.
  10. Oblicz wyrażenie pgRNA w stosunku do RPS11.

8. Barwienie immunofluorescencyjne antygenu wirusowego

  1. Zdejmij pierścień ustalający ze studni i usuń rusztowanie za pomocą kleszczy w szafie klasy II w laboratorium poziomu bezpieczeństwa III.
  2. Przymocuj rusztowania zawierające komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w 1 ml PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej w laboratorium III poziomu hermetyzacji. Poniższe kroki można wykonać w innym obszarze.
  3. Umyj rusztowania 3x 1 ml PBS.
  4. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton-X 100 w 1 ml PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj rusztowania 3x 1 ml PBS.
  6. Blokować niespecyficzne wiązanie przez inkubację rusztowań z 1% BSA w 1 ml PBS przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  7. Umyj rusztowania 3x 1 ml PBS.
  8. Przeprowadzić barwienie przeciwciał pierwotnych przy użyciu antygenu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu B królika w rozcieńczeniu 1:200 w 1% BSA w 1 ml PBS przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  9. Umyj rusztowania 1x 0,1% Tween w 1 ml PBS (PBS-Tween) i 3x 1 ml PBS.
  10. Przeprowadzić barwienie przeciwciał wtórnych za pomocą koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L) zaadsorbowanego krzyżowo Alexa Fluor 594 sprzężonego z Alexa Fluor 594 w rozcieńczeniu 1:2,000 w 1% BSA w 1 ml PBS przez 16 godzin w 4 °C.
  11. Umyj rusztowania 1x 1 ml 0,1% PBS-Tween i 3x 1 ml PBS.
  12. Przeciwbarwić rusztowania za pomocą DAPI w 1 ml PBS o stężeniu 2 μg/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Umyj rusztowania 1x 1 ml 0,1% PBS-Tween i 3x 1 ml PBS.
  14. Przenieś rusztowania na szkiełko mikroskopowe i zamontuj je w celu obrazowania.
  15. Zobrazuj rusztowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

9. ELISA albuminy ludzkiej

  1. Wykonaj tę sekcję protokołu w szafie klasy II przydzielonej w laboratorium III poziomu hermetyzacji, jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym.
  2. Aby ocenić żywotność i funkcjonalność metaboliczną PHH, należy ocenić produkcję albuminy ludzkiej za pomocą testu ELISA.
  3. Pokryj 96-dołkowe płytki 50 μl na studzienkę koziego przeciwciała anty-ludzkiego rozcieńczonego w stosunku 1:800 w buforze powlekającym (100 mM wodorowęglan/węglan, pH 9,6). Przykryć płytki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Odessać przeciwciało powlekające z płytki i przemyć je 4x 200 μl 0,05% PBS-Tween.
  5. Dodać 200 μl buforu blokującego (1% masy ciała w PBS), przykryć płytki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać 0,05% azydku sodu do buforu blokującego.
  6. Odessać bufor blokujący i przemyć 1x 200 μL 0,05% PBS-Tween.
  7. Dodać 50 μl wcześniej rozcieńczonych próbek do studzienki (1:100). Rozcieńczalnik do próbek zawiera 1% BSA w 0,05% PBS-Tween. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwory wzorcowe należy inkubować w tym samym czasie, co próbki. Zalecany jest zakres stężeń 500–0,488 ng/ml (seryjne rozcieńczenia 1:2). Wykonać wszystkie seryjne rozcieńczenia albuminy ludzkiej w rozcieńczalniku do próbki.
  8. Odessać próbki z płytki i przemyć ją 4x 200 μL 0,05% PBS-Tween.
  9. Dodać 50 μl sprzężonego z HRP koziego przeciwciała przeciwko albuminie ludzkiej, uprzednio rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w rozcieńczalniku do próbek. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Odessać przeciwciało z płytki i przemyć je 6x 200 μL 0,05% PBS-Tween.
  11. Dodać 100 μL odczynnika TMB, a gdy tylko najwyższe standardy zostaną w pełni opracowane, dodać 100 μL 1 M H2SO4, aby zatrzymać reakcję kolorymetryczną.
  12. Odczytać absorbancję przy 450 nm na 96-dołkowym czytniku płytek w celu analizy.

10. Interleukina (IL)6 i czynniki martwicy nowotworów (TNF)α Produkcja w kokulturach 3D

  1. Wykonaj tę sekcję protokołu w szafie klasy II przydzielonej w laboratorium III poziomu hermetyzacji, jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym.
  2. Określ ilościowo produkcję IL6 i TNFα, aby ocenić funkcjonalność i żywotność pierwotnych komórek Kupffera. Aby indukować wytwarzanie tych cytokin przez komórki Kupffera, należy potraktować kokultury lipopolisacharydem (LPS) 1 μg/ml 9 dni po wysiewie w pożywce podtrzymującej kokulturę II przez 48 godzin.
  3. W 11 dniu po wysiewie zebrać podłoże z każdej studzienki i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  4. Zmierzyć stężenie IL6 i TNFα w pożywce za pomocą odpowiedniego testu i zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

Opisujemy prostą i wszechstronną platformę do długoterminowej hodowli pierwotnych ludzkich komórek Kupffera i/lub hepatocytów oraz ich zakażania HBV. Pierwotne ludzkie komórki są wysiewane na powlekone kolagenem rusztowania polistyrenowe w obrębie mikrofluidycznego zespołu płytek, który zapewnia ciągłą perfuzję komórek pożywką wzrostową (Rysunek 1a).

PHH, które w konwencjonalnych systemach hodowli są zazwyczaj stabilne jedynie przez ograniczony czas, mogą zachować funkcjonalność przez dłuższe okresy. Albuminy ludzkie, wydzielane przez funkcjonalne hepatocyty i uznawane za najlepszy marker oceny metabolizmu wątroby, są stabilnie i wysoko ekspresjonowane w hodowlach 3D aż do 40. dnia po wysianiu (Rycina 2). W przypadku kokultur funkcjonalność i żywotność komórek Kupffera można ocenić na podstawie wydzielania specyficznych cytokin (np. IL6 i TNFα). Do pomiaru produkcji cytokin po stymulacji kokultur LPS zaleca się stosowanie metod detekcji opartych na wychwytywaniu (Rycina 3).

Komórki tworzą mikrotkanki wątrobowe, zazwyczaj w ciągu 3 dni od wysiania PHH, wykazując obecność funkcjonalnych kanalików żółciowych oraz pełną polaryzację komórkową (Rycina 2). Oprócz zachowania fizjologicznego metabolizmu komórkowego, hodowle te stają się wyjątkowo podatne na zakażenie HBV. W przeciwieństwie do innych systemów hodowlanych, DNA HBV oraz inne markery wirusowe stają się łatwo wykrywalne od 2. dnia po zakażeniu (Rycina 4). Oprócz wydzielanych markerów zakażenia wirusowego, z hodowli można odzyskać rusztowania zawierające hepatocyty i wykorzystać je do detekcji immunofluorescencyjnej antygenów wirusowych (np. HBsAg, HBcAg) (Rycina 4). Podczas gdy konwencjonalne hodowle hepatocytów wymagają inokulacji co najmniej 500 HBV GE na komórkę oraz dodania 2% DMSO i 4% PEG, w hodowlach 3-D zakażenie może zostać zainicjowane przez zaledwie 0,05 HBV GE bez konieczności stosowania DMSO lub PEG (Rycina 4).

figure-results-1
Rycina 1: Układ kultur 3D wątroby na chipie (liver-on-a-chip). (a) Schemat montażu płytki hodowlanej w celu zapewnienia ustanowienia krążenia mikrofluidycznego. (b) Panel przedstawiający zbliżenie dołków hodowlanych, w tym papieru filtracyjnego, rusztowania i pierścienia mocującego. (c) Panel przedstawiający proces równoważenia płytki przed wysiewem kultur. Kolejne dwa panele pokazują proces wysiewu dla (d) monokultur hepatocytów oraz (e) kokultur hepatocytów i komórek Kupffera. (f) Panel przedstawiający etapy płukania podczas wymiany pożywki. (g) Panel przedstawiający układ infekcji HBV, w tym usuwanie inokulum. S.M. = pożywka do wysiewu (seeding medium), M.M. = pożywka podtrzymująca (maintenance medium). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Tworzenie mikro-tkanki wątrobowej i żywotność hepatocytów. (a) Ten panel przedstawia podłużne obrazy w jasnym polu 3D monokultur hepatocytów, wykazujące tworzenie mikro-tkanki po wysiewaniu. (b) Ten panel przedstawia obrazy immunofluorescencyjne kultur dla jąder komórkowych (niebieski) oraz ludzkiej albuminy (zielony). (c) Ten panel przedstawia podłużną całkowitą ilość albuminy, a także produkcję albuminy skorygowaną na jedną komórkę w ciągu 40 dni monokultur hepatocytów, oznaczoną metodą ELISA. Przedstawione dane to średnia ± SD. Rysunek został zaadaptowany z pracy Ortega-Prieto et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Funkcjonalność komórek Kupffera w kokulturach 3D. Panele te przedstawiają sekrecję (a) IL6 oraz (b) TNFα w monokulturach hepatocytów i kokulturach hepatocytów/komórek Kupffera 11 dni po wysiewie w odpowiedzi na egzogennie dodany LPS w 9. dniu po wysiewie, oznaczoną przy użyciu testu Human Magnetic Luminex. Rysunek został zaadaptowany z pracy Ortega-Prieto i wsp.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Infekcja HBV w kulturach typu liver-on-a-chip. (a) Panel ten przedstawia detekcję immunofluorescencyjną HBcAg (czerwony), HBsAg (zielony) oraz jąder komórkowych (niebieski) 10 dni po zakażeniu kultur HBV. (b) Panel ten przedstawia podatność kultur na infekcję HBV przy różnych wielokrotnościach zakażenia (MOI), określoną poprzez ilościowe oznaczenie HBV DNA w nadsączach hodowli. (c) Panel ten przedstawia ilościowe oznaczenie podłużnej akumulacji HBV pgRNA w stosunku do genu referencyjnego RPS11. Przedstawione dane to średnia ± SD. Rycina została zaadaptowana z pracy Ortega-Prieto i wsp.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wyzwania związane z utrzymaniem długoterminowych kultur PHH doprowadziły do opracowania kilku modeli hodowli o zwiększonej funkcjonalności i trwałości, z których każdy ma różne zalety i wady. Obecnie powszechnie uznaje się, że statyczne hodowle 2D PHH naśladują pewne aspekty biologii hepatocytów przez bardzo ograniczony czas. Tak więc mikrowzorcowe kokultury12,13, kultury sferoidalne14,15 i trójwymiarowe hodowle wątroby na chipie 16,17 szybko zastępują te bardziej podstawowe systemy. Zwłaszcza podczas badania chorób zakaźnych, które współewoluowały ze swoim gospodarzem w celu wykorzystania określonych mikrośrodowisk, wymóg zapewnienia środowiska fizjologicznego jest podszyty często trudnym charakterem hodowli chorób zakaźnych tropikalnych u ludzi, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C, HBV i malarii.

Najważniejszym krokiem w przeprowadzaniu hodowli 3D wątroby na chipie jest jakość początkowo pozyskanych pierwotnych typów komórek. Komórki te powinny być badane pod kątem ich zdolności do przylegania i należy używać wyłącznie partii PHH na płytkach, aby zapewnić pomyślne tworzenie tkanek i generowanie hodowli. Mimo że można stosować świeżo wyizolowane PHH, ich kriokonserwacja jest zwykle skomplikowana i wymaga specjalnych zamrażarek o kontrolowanej szybkości.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych statycznych hodowli 2D, podłoże genetyczne gospodarza jest znikome pod względem podatności na zakażenie HBV, a wszyscy dotychczas przebadani dawcy hepatocytów są w stanie stwierdzić zakażenie HBV4.

Mimo, że wirus HBV pochodzący od pacjenta powoduje infekcje kultur 3D, konieczne jest stosowanie HBV wytrąconego przez PEG i oczyszczonego sacharozą za pomocą poduszki za każdym razem, gdy używa się indukowalnych linii komórkowych wytwarzających HBV do wytwarzania inokulacji wirusa. Supernatanty do hodowli komórkowych stosowane bezpośrednio do hodowli 3D wątroby na chipie, czy to z powodu obecności czynników hamujących, czy też z powodu niezgodności obecnych czynników wzrostu z hepatocytami, nie powodują łatwo infekcji. Dodatkowo, przy wyborze inokulacji wirusowej pochodzącej od pacjenta, należy stosować tylko surowicę, ponieważ osocze nieuchronnie koaguluje i zatyka krążenie mikroprzepływowe platformy hodowlanej.

Niezależnie od zastosowanego inokulum wirusowego, zapewnienie żywotności i różnicowania komórek, a także całkowite usunięcie początkowego inokulum HBV, jest kluczem do udanych długoterminowych badań nad infekcjami. Najwygodniejszym sposobem na to jest pobieranie próbek kultur po usunięciu inokulum wirusa, a także pomiar poziomu albuminy w surowicy ludzkiej przez cały okres hodowli. Warto zauważyć, że podobnie jak w przypadku wszystkich innych opisanych platform, zakażenie HBV, raz ustalone, nie rozprzestrzenia się łatwo na niezakażone komórki. Mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska pozostaje nieuchwytny, ponieważ zakażenie HBV in vivo łatwo infekuje większość hepatocytów w wątrobie.

W odniesieniu do kokultur komórek PHH i Kupffera zaleca się wykonanie testów partii komórek Kupffera w celu oceny wydzielania IL6 i TNFα w odpowiedzi na stymulację LPS, ponieważ nie wszyscy dostępni na rynku dawcy komórek Kupffera mają jednakową reaktywność.

Co ważne, w przypadku wszystkich terapii farmakologicznych lub początkowego zakażenia kultur wirusem HBV, przy obliczaniu stężeń leku lub inokulum należy wziąć pod uwagę całkowitą objętość studzienki (1,4 ml), a także kanału mikroprzepływowego (0,2 ml). W celu zapewnienia dokładnego dozowania wykonuje się jeden etap przemywania pożywką zawierającą HBV lub leki w celu zalania kanału mikroprzepływowego.

Zastosowana platforma wykorzystuje 600 000 PHH na studzienkę, co zapewnia wielowarstwowe hepatocyty w rusztowaniach. Mimo że liczba komórek może być różna, wybrane stężenie komórek zapewnia optymalne rezultaty. Format płytowy mieści łącznie 12 rusztowań, które można rozbudować do 36 rusztowań. Jednak ze względu na wymagania mikroprzepływowe, skalowanie do większej liczby odwiertów nie jest do tej pory możliwe.

Dzięki tym metodom hodowle mogą być utrzymywane z optymalną wydajnością komórek przez co najmniej 40 dni, co jak dotąd daje bezprecedensowe możliwości oceny nowych kandydatów na leki, a także badania złożonych interakcji między różnymi populacjami komórek wątroby podczas zakażenia HBV.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu Starter od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (637304), Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) oraz przez CN Bio Innovations.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
William's E Medium, bez czerwieni fenolowejGIBCOA12176-01
Pożywka do rozmrażania hepatocytówGIBCOCM7500
Podstawowe suplementy do rozmrażania i powlekania hepatocytówGIBCOCM3000
Podstawowe suplementy podtrzymujące hepatocytyGIBCOCM4000
DMEM/F-12GIBCO11320-033
Zaawansowany DMEMGIBCO12491023
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGIBCO14190-144
MEM Aminokwasy endogenne (NEAA) 100xGIBCO11140050
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)GIBCO15140-122
Płodowa surowica bydlęca, pochodząca z USA, inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowychSIGMA12106C
HydrokortyzonSIGMAH0888
Błękit trypanowyMerckT8154
Kolagen ze skóry cielęciaMerckC9791
G418SIGMAG418-RO
TetracyklinaSIGMAT3258
Glikol polietylenowy 8000SIGMAP2139
SacharozaSIGMASO389
Węglan sodu bezwodnySIGMA451614-25G
Wodorowęglan soduSIGMAS5761
Azydek soduSIGMAS2002-5G
Kwas siarkowy, 99,999%SIGMA339741
4% ParaformaldehydSIGMA252549
Triton-X 100SIGMAX100
Tween 20SIGMAP1379
DAPISIGMAD9564
Albumina (ludzka)SIGMAA9731
Odczynnik Fisher  Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi cieplnemuFisher ScientificBP9701-100
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
TaqMan Universal Master Mix II, bez UNGApplied Biosystems4440040
SYBR Select Master MixApplied Biosystems4472903
Lipopolisacharyd z Escherichia coli K12InvivoGentlrl-eklps
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestawy/Materiały eksploatacyjne
Sterylna membranaCN Bio innowacjeLC-SC
LiverChip Płytka do hodowli komórek perfuzyjnychCN Bio innowacjeLC12
Pokrywa płytki hodowlanej LiverChipCN Bio innowacjeLC-SC
Sterylna okrągła bibuła filtracyjnaInnowacje CN BioLC-SC
Rusztowanie do mocowania komórekCN BioinnowacjeLC-SC
Pierścień ustalającyCN Bio innowacjeLC-SC
Sterylny tłokInnowacje CN BioLC-ST
Zestaw krwi i tkanek DneasyQiagen69506
Rneasy mini zestawQiagen74106
Test Human Magnetic LuminexR& D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Roztwór substratuThermoFisher Scientific34028
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermoFisher Scientific4368814
QIAamp Mini zestaw akcesoriów do wirusowego RNAQiagen1048147zawierający nośnik RNA
5-warstwowa kolba do hodowli komórkowych Millicell HY, T-1000, sterylnaMillipore (Merck)
384-dołkowa optyczna płytka reakcyjna MicroAmp z technologiami BarcodeLife4309849
Technologie MicroAmp Optical Adhesive FilmLife4311971
Przezroczyste, niesterylne 96-dołkowe płytki immunologiczne z płaskim dnemThermoFisher Scientific442404
do płytek 96-dołkowychThermoFisher Scientific15036
Nalgene Sterylne jednorazowe filtry do butelek o szybkim przepływie z membraną PESThermoFisher Scientific295-3345
Fisherbrand  Szkiełka mikroskopowe ze szlifowanymi krawędziami, Twin FrostFisher ScientificFB58628
Tube, cienkościenne, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter344058
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Primary cells / Linie komórkowe
ludzkie hepatocyty płytkowe, kwalifikowane przez transporterThermo Fisher ScientificHMCPTS
Kriokonserwowane ludzkie komórki KupfferaThermo Fisher ScientificHUKCCS
HepDE19 linia komórkowaHaitao Guo (Indiana University, IN, USA)
NazwaFirma Numer katalogowy<strong>Komentarze
Startery/Sondy/Wzorce
HBV DNA forward primerInvitrogen5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV
reverse primerInvitrogen5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'Sonda
DNA HBVInvitrogen5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA podkład do przoduInvitrogen5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA
odwrotnyInvitrogen5'-GAGGCGAGAGTTCTTCT-3'RPS11
podkład do przoduInvitrogen5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11
podkład odwrotnyInvitrogen5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV
Profesor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
>Przeciwciała
Antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B frakcja IgG (poliklonalny)DAKOwycofanyPartia 10102505
Przeciwciało albuminy ludzkiej, A80-129ABethyl Laboratories. incA80-129A Przeciwciało
z adsorbowaną krzyżowo ludzką albuminą, A80-229PBethyl Laboratories. incA80-229P
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową wtórną, Alexa Fluor 594ThermoFisher Naukowy#  A-11072Lot 1431810
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
LiverChip Pompa próżniowaCN Bio innowacjeLC-PN
LiverChip Pneumatyczne połączenieCN Bio innowacjeLC-PN
Platforma LiverChip InnowacjeCN BioLC-PN
Stacja dokująca do mycia płyt LiverChipInnowacje
Autoklawowalne kleszcze metaloweVWR232-0106
Vortex Genie 2Przemysł naukowySKU: SI-0236
Optima XPN-80 UltrawirówkaBeckman CoulterA95765
Wirówka Heraeus Multifuge X3RThermo Scientific75004500
SAM-12 Medyczne ssanie Wysoka próżnia i wysokimprzepływie MGE na całym świecie  Inkubator SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIESNUAIRENU-5841
Zautomatyzowany precyzyjny moment obrotowyInnowacje CN Bio
Ręczny momentobrotowy Innowacje CN Bio Sprężarka
LiverChip Innowacje
Luminex LX-200 Instrument z xPONENT 3.1Luminex
Ręczny blok separatora magnetycznego MilliporeThermoFisher ScientificMillipore™ 40-285
Czytnik płytek FluoStar OptimaBMG Labtech
KOLVER Precyzyjne wkrętarki elektryczneVTECH ltdFAB10RE/FR
KOLVER ZasilaczVTECH ltdEDU1FR
BAMBI VTS75DSprzęt pneumatycznywycofany z produkcji
Integra VacuboyINTEGRA
ViiA 7 System PCR w czasie rzeczywistym z 384-dołkowym blokiemThermoFisher Scientific4453536
PFHYS1008 Taśma uszczelniająca DNA starter CN BioCN Bio

Bibliografia

  1. Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
  2. Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
  3. Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
  4. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  5. Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
  6. Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
  7. Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).
  8. Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
  9. Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).
  10. Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
  11. Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
  12. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  13. March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
  14. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  15. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  16. Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
  17. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hodowla mikroprzepływowazakażenie HBVanaliza odpowiedzi gospodarzaocena cccDNAbadania skuteczności lekówfizjologiczny system modelowy
Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.