Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58359

⸱

25 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Bar-Ilan University

W tym artykule

Podsumowanie

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Streszczenie

Przerzuty raka są znane z tego, że powodują 90% śmiertelności raka. Przerzuty to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od penetracji/inwazji komórek nowotworowych do sąsiedniej tkanki. Tak więc inwazja jest kluczowym krokiem w przerzutach, co sprawia, że badania i rozwój leków przeciwprzerzutowych w procesie inwazji są bardzo istotne. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, konieczne jest opracowanie modeli 3D in vitro, które z jednej strony imitują architekturę guzów litych i ich mikrośrodowisko najbardziej zbliżone do stanu in vivo, ale jednocześnie są powtarzalne, wytrzymałe i nadają się do pomiarów z wysoką wydajnością i wysoką zawartością. Obecnie większość testów inwazji opiera się na zaawansowanych technologiach mikroprzepływowych, które są odpowiednie do badań, ale nie do badań przesiewowych na dużą skalę leków. Inne testy wykorzystujące urządzenia oparte na płytkach z izolowanymi pojedynczymi sferoidami w każdym dołku zużywają materiał i mają niską wielkość próbki w danym stanie. Celem obecnego protokołu jest dostarczenie prostego i powtarzalnego biomimetycznego systemu opartego na komórkach 3D do analizy zdolności do inwazji w dużych populacjach sferoid nowotworowych. Opracowaliśmy model 3D do testu inwazji w oparciu o płytkę obrazową HMCA do badań nad inwazją guza i odkrywaniem leków przeciwprzerzutowych. Urządzenie to umożliwia wytwarzanie wielu jednorodnych sferoid na studzienkę (duża wielkość próbki na warunek) otoczonych komponentami ECM, przy jednoczesnym obserwowaniu i pomiarze sferoid w rozdzielczości jednoelementowej w celu przeprowadzenia średnioprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych. Platforma ta jest tutaj prezentowana przez produkcję sferoid HeLa i MCF7 jako przykład inwazji pojedynczej komórki i zbiorowej. Porównujemy wpływ składnika ECM, kwasu hialuronowego (HA) na zdolność inwazyjną kolagenu otaczającego sferoidy HeLa. Na koniec wprowadzamy Fisetynę (inhibitor inwazji) do sferoid HeLa i tlenek azotu (NO) (aktywator inwazji) do sferoid MCF7. Wyniki są analizowane przez autorskie oprogramowanie, które umożliwia półautomatyczną, prostą i szybką analizę, co ułatwia badanie wieloparametrowe.

Wprowadzenie

Śmierć z powodu raka przypisuje się głównie rozprzestrzenianiu się komórek przerzutowych do odległych miejsc. Wiele wysiłków w leczeniu raka koncentruje się na ukierunkowaniu lub zapobieganiu tworzeniu się kolonii przerzutowych i progresji układowej choroby przerzutowej1. Migracja komórek nowotworowych jest kluczowym etapem w procesie przerzutów nowotworowych, dlatego badania kaskady inwazji raka są bardzo ważne i stanowią warunek wstępny do znalezienia leków przeciwprzerzutowych.

Okazało się, że wykorzystanie modeli zwierzęcych jako narzędzi do badania chorób przerzutowych jest bardzo kosztowne i nie zawsze reprezentatywne dla nowotworu u ludzi. Co więcej, topologia, mechanika i skład mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego silnie wpływają na zachowanie komórek nowotworowych2. Ponieważ modele in vivo z natury nie mają możliwości wyodrębnienia i kontrolowania takich specyficznych parametrów, które przyczyniają się do inwazji raka i przerzutów, istnieje zapotrzebowanie na kontrolowane biomimetyczne modele in vitro.

Aby dać przerzuty do odległych organów, komórki rakowe muszą wykazywać migrujące i inwazyjne cechy fenotypowe, które mogą być celem terapii. Ponieważ jednak większość modeli raka in vitro nie naśladuje rzeczywistych cech guzów litych3, wykrycie fizjologicznie istotnych fenotypów jest bardzo trudne. Ponadto heterogeniczność fenotypowa, która istnieje w guzie, dyktuje potrzebę analizy migracji guza w rozdzielczości pojedynczego elementu w celu odkrycia terapii ukierunkowanych na fenotyp, na przykład poprzez celowanie w populację komórek inicjujących przerzuty w heterogennych nowotworach4.

Badanie ruchliwości komórek i migracji zbiorowej prowadzone jest głównie w jednowarstwowych hodowlach komórek nabłonkowych na jednorodnych powierzchniach płaskich. Te konwencjonalne modele komórkowe migracji komórek nowotworowych opierają się na analizie populacji pojedynczych komórek atakujących przez błony i komponenty ECM5, ale w takich systemach nie można badać wewnętrznych różnic między poszczególnymi komórkami. Generowanie sferoid 3D za pomocą rusztowań lub mikrostruktur wolnych od rusztowań jest uważane za lepszy sposób badania wzrostu komórek nowotworowych i inwazji raka6,7,8. Jednak większość systemów 3D nie nadaje się do formatów o wysokiej przepustowości, a interakcja międzysferoidalna zwykle nie może być osiągnięta, ponieważ izolowane pojedyncze sferoidy są generowane w każdej mikro-studzience9. Ostatnie badania dotyczące migracji nowotworów opierają się na urządzeniach mikroprzepływowych3,10,11,12, jednak te zaawansowane narzędzia mikroprzepływowe są trudne do wyprodukowania i nie mogą być używane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) leków przeciwinwazyjnych.

Wykazano dwa główne fenotypy, zbiorową i indywidualną migrację komórek, które odgrywają rolę w pokonywaniu przez komórki nowotworowe bariery ECM i inwazji na sąsiednie tkanki13,14, z których każdy wykazuje odrębne cechy morfologiczne, mechanizmy biochemiczne, molekularne i genetyczne. Ponadto w każdym fenotypie obserwuje się dwie formy migrujących komórek nowotworowych, fibroblasty i ameboidy. Ponieważ zarówno fenotypy inwazji, jak i tryby migracji są definiowane głównie przez właściwości morfologiczne, istnieje zapotrzebowanie na modele komórkowe, które umożliwiają wykrywanie i badanie oparte na obrazowaniu wszystkich form inwazji guza i komórek migrujących.

Ogólnym celem obecnej metody jest dostarczenie prostego i powtarzalnego biomimetycznego systemu 3D opartego na komórkach in vitro do analizy zdolności inwazji w dużych populacjach sferoid nowotworowych. Tutaj przedstawiamy 6-dołkową płytkę obrazową na bazie HMCA do badań nad inwazją guza i terapią przeciwprzerzutową. Technologia ta umożliwia tworzenie dużej liczby jednorodnych sferoid guza 3D (450 na dołek) w strukturze mikrokomór hydrożelowych (MC). Do matrycy sferoidalnej dodawane są różne komponenty ECM, aby umożliwić inwazję komórek do otaczającego środowiska. Proces inwazji jest stale monitorowany poprzez krótko- i długoterminową obserwację tych samych pojedynczych sferoid/inwazyjnych komórek i ułatwia charakterystykę morfologiczną, barwienie fluorescencyjne i odzyskiwanie określonych sferoid w dowolnym momencie. Ponieważ wiele sferoid dzieli przestrzeń i ośrodek, możliwa jest interakcja za pośrednictwem rozpuszczalnych cząsteczek między poszczególnymi sferoidami i ich wzajemne oddziaływanie. Półautomatyczna analiza obrazu odbywa się przy użyciu własnego kodu MATLAB, który umożliwia szybsze i wydajniejsze gromadzenie dużych ilości danych. Platforma umożliwia dokładny, jednoczesny pomiar wielu sferoidów/inwazyjnych komórek w sposób efektywny czasowo, umożliwiając średnioprzepustowe badania przesiewowe leków przeciwinwazyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Tłoczenie tabliczki HMCA

UWAGA: Kompletny proces projektowania i produkcji pieczęci z polidimetylosiloksanu (PDMS) i płytki obrazowej HMCA używanych w tym protokole jest szczegółowo opisany w naszych poprzednich artykułach15,16. Stempel PDMS (kształt negatywny) służy do wytłaczania HMCA (kształt pozytywowy), który składa się z około 450 MC na studzienkę (Rysunek 1A). Jak pokazano w Rysunek 1B, każdy z MC ma kształt ściętej odwróconej do góry nogami piramidy w kształcie kwadratu (wysokość: 190 μm, mały obszar podstawy: 90 μm x 90 μm, i duży obszar podstawy: 370 μm x 370 μm). Płytka HMCA służy do przygotowania i hodowli sferoid guza 3D, a następnie do testu inwazji. Alternatywnie, pieczęć handlowa może być używana do produkcji HMCA.

  1. Przygotuj roztwór 6% niskotopliwej agarozy (LMA). Umieścić proszek LMA i sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (0,6 g LMA na 10 ml PBS) do szklanej butelki z mieszadłem magnetycznym. Umieścić butelkę na płycie grzewczej i mieszać roztwór, podgrzewając do temperatury 80 °C przez kilka godzin, aż do uzyskania jednolitego roztworu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 70 °C do momentu użycia.
  2. Podgrzej pieczęć PDMS do temperatury 70 °C w piekarniku. Utrzymuj go w cieple do momentu użycia. Możesz też użyć pieczątki handlowej i postępować zgodnie z instrukcją.
  3. Umieść dostępne w handlu 6-dołkowe płytki ze szklanym dnem w suchej kąpieli podgrzanej do temperatury 75 °C. Odczekaj kilka minut, aż płytka całkowicie się rozgrzeje.
  4. Wlej kroplę (400 μl) wstępnie podgrzanego LMA na szklane dno każdego z dołków w płytce. Delikatnie umieść podgrzany stempel PDMS na kropli agarozy. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5–10 minut w celu wstępnego żelowania i schłodzenia. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby uzyskać pełne zżelowanie agarozy. Następnie delikatnie oderwij PDMS, pozostawiając żel agarozowy z wzorem MCs.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany jednocześnie we wszystkich studzienkach.
  5. Umieść wytłoczoną płytkę w systemie utwardzania światłem wyposażonym w lampę ultrafioletową (UV) i inkubuj przez 3 minuty
    UWAGA: Teraz płytka HMCA jest sterylizowana promieniami UV.
  6. Napełnić makrostudzienki sterylnym PBS, aby upewnić się, że są one wilgotne, a następnie przykryć płytkę, owinąć ją parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  7. Przed użyciem należy opróżnić resztki PBS z płytki HMCA. Umieść go w biologicznym kapturze.

2. Ładowanie komórek i formacja sferoidów

  1. Zebrać komórki w następujący sposób: usunąć całe podłoże z 10 cm monowarstwy komórek płytki hodowlanej, przemyć dwukrotnie 10 ml PBS w celu usunięcia pozostałości surowicy, dodać 5 ml trypsyny (wstępnie podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 3 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie wstrząsnąć płytką, aby zapewnić oderwanie jednej warstwy, dodać 10 ml kompletnego podłoża (wstępnie podgrzanego do 37 °C) i pipetować w górę i w dół, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Odwirować i przepłukać zawiesinę komórkową 15 ml świeżej pożywki, a następnie zawiesić w odpowiednich stężeniach w świeżej kompletnej pożywce.
  2. Delikatnie załaduj zawiesinę komórek (50 μl, 150–360 x 103 komórki/ml w podłożu, ~16–40 komórek na MC) na HMCA i pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 15 minut.
  3. Delikatnie dodać 6–8 porcji 500 μl świeżej pożywki (łącznie 3–4 ml) do brzegu dna makrostudzienki z tworzywa sztucznego na zewnątrz pierścienia i układu hydrożelowego.
  4. Inkubować komórki HeLa przez 72 godziny, a komórki MCF7 przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze w celu wytworzenia sferoid.

3. Wykrywanie żywotności za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI)

  1. Przygotować roztwór podstawowy PI (500 μg PI na 1 ml PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 6 miesięcy. Świeżo przygotować rozcieńczenie 1:2 000 (0,25 μg/ml), dodając 6 μl bulionu do 12 ml kompletnej pożywki bez czerwieni fenolowej, dla 6-dołkowej płytki HMCA (2 ml na studzienkę).
  2. Przenieś płytkę HMCA ze sferoidami 48-72 h z inkubatora do kaptura biologicznego. Usuń całe medium z HMCA, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki obok układu hydrożelowego, pozostawiając zbiornik matrycy wypełniony medium.
  3. Delikatnie dodaj 2 ml rozcieńczenia PI z kroku 3.1 do każdego dołka, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki. Inkubować płytkę HMCA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Przejdź do kroku 7.
    UWAGA: Można tu również zastosować inne barwniki, na przykład Hoechst do barwienia jąder, ester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM) do barwienia potencjału błony mitochondrialnej, dioctan fluoresceiny (FDA) do wykrywania żywych komórek, Aneksyna V do wykrywania apoptozy i inne.

4. Przygotowanie mieszanki kolagenu

  1. Przygotować sterylną wodę podwójnie destylowaną (DDW) w autoklawie i zapasie 100 ml 1 M roztworu sterylizowanego filtrem NaOH. Utrzymuj materiały w temperaturze pokojowej temperatury, a końcówki używane do przygotowania mieszaniny kolagenowej zamrożone w temperaturze -20 °C, aż do użycia.
  2. 10–20 minut przed użyciem umieść wszystkie mieszanki, w tym: sterylny DDW, 1 M sterylnego roztworu NaOH, sterylny 10x PBS, kolagen typu I ze szczurzego ogona (przechowywany w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące) i sterylną probówkę do wiadra z lodem do całkowitego ostygnięcia. Umieść pojemnik na lód w okapie biologicznym.
  3. Przygotować 1,800 μl mieszaniny kolagenu o końcowym stężeniu 3 mg / ml na 6-dołkową płytkę do badania inwazji HMCA (300 μl na studzienkę) w następujący sposób. Dodaj międzyziarna do schłodzonej probówki w następującej kolejności: 515 μL DDW, 24,8 μL 1 M NaOH i 180 μL 10x PBS. Dobrze wymieszaj przez wir i umieść z powrotem w lodzie. Na koniec dodaj 1080 μl kolagenu do mieszanki, ponownie zwiruj i włóż z powrotem do lodu.

5. Przygotowanie mieszanki HA i kolagenu

  1. Rozpuścić 10 mg kwasu hialuronowego w 2 ml sterylnego DDW. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez kilka minut i delikatnie wirować, aż proszek całkowicie się rozpuści. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C przez okres nie dłuższy niż dwa lata.
  2. Tuż przed użyciem umieść roztwór podstawowy HA w pojemniku na lód wewnątrz okapu biologicznego.
  3. Przygotuj mieszaninę kolagenu o stężeniu 3 mg/ml zgodnie z opisem w kroku 4. Dodać 36 μg (7,2 μL) HA do 1 800 μL gotowej do użycia mieszanki kolagenowej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml. Następnie ponownie krótko zwiruj i włóż z powrotem do lodu.

6. Dodawanie mieszaniny ECM

  1. Przenieś płytkę HMCA ze sferoidami 48–72 h z inkubatora do kaptura biologicznego i umieść ją na lodzie. Inkubować przez 10 minut, aż płytka ostygnie. Podgrzej roztwór 1% LMA do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Usuń całe podłoże z okolic HMCA, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki obok układu hydrożelowego. Następnie, bardzo ostrożnie, usuń całe medium ze zbiornika matrycy za pomocą cienkiej końcówki/końcówki ładującej żel, opierając końcówkę o krawędź matrycy, delikatnie i powoli odsysając całe medium.
    UWAGA: Po usunięciu całego medium z okolic układu hydrożelowego, zbiornik matrycy jest nadal wypełniony medium. Podłoże to musi być usunięte bardzo delikatnie, aby uniknąć zniszczenia hydrożelu MC i przemieszczenia sferoid.
  3. Weź 150 μl mieszaniny kolagenu lub mieszaniny HA i kolagenu (mieszanina ECM) z wstępnie zamrożoną drobną końcówką i dodaj do zbiornika matrycy, przymocowując końcówkę do krawędzi matrycy. Powoli uwalniaj mieszaninę, aby uniknąć zwichnięcia sferoidy. Powtórzyć ten krok z kolejną podwielokrotnością 150 μl, co daje w sumie 300 μl na studzienkę. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla każdej studzienki, aż wszystkie studzienki zostaną wypełnione. Następnie umieścić płytkę w inkubatorze na 1 godzinę w celu pełnego zżelowania ECM.
  4. Po osiągnięciu pełnego żelowania ECM odpipetować 400 μl wstępnie podgrzanego 1% LMA na wierzch żelu ECM. Przykryć płytkę pokrywką, inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–7 minut, a następnie przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu żelowania agarozy. Na koniec delikatnie dodaj 2 ml kompletnego podłoża, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki.
    UWAGA: Warstwa agarozy zapobiega odklejaniu się matrycy kolagenowo-żelowej od HMCA.

7. Akwizycja i analiza testów inwazji

  1. Załaduj płytkę HMCA na zmotoryzowany stolik mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator, wstępnie ustawiony na 37 °C, 5% CO2 i wilgotną atmosferę.
  2. Wstępnie określ pozycje do akwizycji obrazu w każdym dołku, tak aby pokryć cały obszar matrycy, i użyj obiektywów 10X lub 4X (ten krok jest wymagany w przypadku używanego tutaj oprogramowania do akwizycji obrazu, szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów poniżej). Alternatywnie, użyj dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazu, aby ułatwić automatyczne skanowanie całego wymaganego obszaru, wybierając opcję "Stich".
  3. Obrazy w jasnym polu (BF) należy wykonywać co 2–4 godziny przez łączny okres 24–72 godzin, aby śledzić inwazję komórek z ciała sferoidalnego do otaczającego ECM.
  4. Pozyskiwanie obrazów fluorescencyjnych do detekcji PI za pomocą dedykowanej kostki fluorescencyjnej (filtr wzbudzający 530–550 nm, zwierciadło dichroiczne 565 nm długoprzepustowe i filtr emisyjny 600–660 nm).
  5. Eksportuj poklatkowe obrazy BF/fluorescencyjne z oprogramowania do akwizycji obrazów i zapisz je w formacie tagged image file (TIFF) do dedykowanego folderu, korzystając z zakładki "Baza danych" na pasku narzędzi, a następnie przycisku "Eksportuj pliki nagrań".
    UWAGA: Opracowaliśmy specjalny wewnętrzny kod analizy w oprogramowaniu MATLAB, który zawiera zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika (GUI), w którym analiza inwazji może być wykonywana szybciej i łatwiej. W tym kodzie analizy segmentacja sferoid i obszaru inwazji odbywa się półautomatycznie przy użyciu filtra Sobela, po którym następują operatory morfologiczne Erozja i Dylatacja. Po automatycznej segmentacji obszarów, w razie potrzeby dokonano ręcznych korekt w celu uzyskania lepszej dokładności. Po zakończeniu segmentacji zestaw parametrów został automatycznie obliczony przez oprogramowanie i wyeksportowany do pliku Excel w celu dalszej manipulacji. Lista parametrów to: podstawowy obszar przekroju sferoidy w czasie = 0, obszar inwazji komórek połączonych z ciałem sferoidalnym = główny obszar inwazji, obszar komórek oddzielonych od głównego obszaru inwazji, liczba komórek oddzielonych od głównego obszaru inwazji, średnia odległość inwazji od podstawowego sferoidalnego środka masy do obwodu głównego obszaru inwazji i oddzielonych komórek oraz parametr odległości inwazji zbiorowej = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) poza sferoidalnym środkiem współrzędnych masy X i Y, przed (X1, Y1) i po (X2, Y2) procesie inwazji zbiorowej). Alternatywnie, analizę obrazu można wykonać za pomocą dowolnego innego specjalistycznego oprogramowania.
  6. Otwórz GUI i naciśnij przycisk "Załaduj BF". Po otwarciu obrazu dostosuj parametry segmentacji (minimalny rozmiar: >1 i promień zamknięcia: >1), aby uzyskać precyzyjną segmentację sferoidy i jej obszaru inwazji, a następnie naciśnij przycisk "Segmentacja regionu zainteresowania (ROI)" w celu wykonania, a wokół każdej sferoidy pojawi się granica. Jeśli automatyczna segmentacja jest nieprawidłowa, naciśnij przycisk "Usuń" lub "Dodaj" i ręcznie wprowadź żądane poprawki. Powtórz te same kroki dla kolejnych obrazów.
  7. Naciśnij przycisk "Śledzenie", aby ponumerować sferoidy, a oprogramowanie przypisze ten sam numer dla każdej sferoidy na każdym z obrazów poklatkowych. Następnie naciśnij przycisk "Pomiar", który wygeneruje arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi parametrami. Zapisz ten arkusz kalkulacyjny jako plik Excela do dalszego wykorzystania w przetwarzaniu wyników i statystykach w oprogramowaniu Excel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyjątkowa płytka obrazująca HMCA jest wykorzystywana do testu inwazji trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych. Cały proces, rozpoczynając od formowania sferoidów, a kończąc na procesie inwazji i dodatkowych manipulacjach, jest przeprowadzany w tej samej płytce. W celu formowania sferoidów komórki HeLa są wprowadzane do basenu macierzy i osiadają w mikrownękach (MCs) hydrożelowych pod wpływem grawitacji. Mikrownęki hydrożelowe, które charakteryzują się brakiem adhezji lub niskim przycze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jest dobrze udokumentowane, że żywe organizmy, charakteryzujące się złożoną organizacją wielokomórkową 3D, różnią się znacznie od powszechnie stosowanych jednowarstwowych komórek hodowlanych 2D, co podkreśla kluczową potrzebę wykorzystania modeli komórkowych, które lepiej naśladują funkcje i procesy żywego organizmu do badań przesiewowych leków. Ostatnio wprowadzono sferoidy wielokomórkowe, kultury organotypowe, organoidy i narządy na chipie8 do stosowania w standaryzowanym odkrywaniu leków. Jedna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez testament Moshe Shimona i Judith Weisbrodt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6 szklanych płytek dolnych Micro-well ze szkłem osłonowym Micro-Well #1,5mm CellvisP06-14-1.5-NKomercyjne szklane płyty dolne, które są używane do wytłaczania
HMCA UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520100Roztwór 6% agarozy podgrzewa się do 80 stopni Celsjusza; C przed użyciem roztwór 1% agarozy ogrzewa się do 37 & stopni; C
Roztwór trypsyny EDTA BPrzemysł biologiczny03-052-1APodgrzany do 37 stopni C przed użyciem
DMEM pożywka, wysoka glukozaPrzemysł biologiczny01-055-1APodgrzany do 37 & stopni; C przed użyciem
Specjalna surowica dla noworodków cielęcych (NBCS)Biological Industries04-122-1AInaktywowany termicznie
DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezuBiological Industries02-023-5APrzechowywany na lodzie przed użyciem
NaOH, bezwodnySigma-AldrichS5881-500GSłuży do przygotowania 1 M roztworu NaOH
Cultrex Kolagen typu I z ogona szczura, 5 mg/mlTrevigen3440-100-01Przechowywany na lodzie przed użyciem
Sól sodowa kwasu hialuronowegoSigma-AldrichH5542-10MGPrzechowywany na lodzie przed użyciem
FisetinSigma-AldrichF505-100MGDodany do pożywki, inhibitor inwazji
DETA/NOEnzo Life Sciencesalx-430-014-m005Dodany do pożywki, donor tlenku azotu
PISigma-AldrichP4170Stosowany przy bardzo niskim stężeniu bez konieczności mycia
Kompletny system lampy powodziowej UV Dymax 5000-EC z osłoną świetlną i Zasilacz Dymax 400 Watt ECDymax CorporationPN 39823Używany do sterylizacji płytek HMCA za pomocą
mikroskopu UV Odwrócony IX81OlympusUżywany do automatycznej akwizycji obrazu
Inkubator do mikroskopuUsługiNiezbędny do eksperymentów poklatkowych z akwizycją obrazu, wstępnie dostosowany do 37 & stopni; C, 5% CO2 i utrzymywanie nawilżonej atmosfery
Submikronowy zmotoryzowany stolik typu SCAN-IMMarzhauser Wetzlar GmbHSłuży do wstępnego określania obszarów akwizycji obrazu, do automatycznej akwizycji obrazu
14-bitowa, ORCA II C4742-98 chłodzona kameraHamamatsu PhotonicsBardzo czuły, używany do obrazowania
Kostka filtra fluorescencyjnego do wykrywania PIKorporacja Chroma TechnologySpecyfikacja kostki filtra: filtr wzbudzenia 530-550 nm, zwierciadło dichroiczne 565 nm długoprzepustowe i filtr emisyjny 600-660 nm
Oprogramowanie operacyjne Olympus Cell^POprogramowanie Olympussłużące do sterowania mikroskopem, zmotoryzowanym stolikiem, kamerą i akwizycją obrazu
Oprogramowanie analityczne Matlab R2014BMathworksSłuży do tworzenia własnego graficznego interfejsu użytkownika do analizy obrazu
OprogramowanieExcelMicrosoftSłuży do zarządzania danymi, obliczeń, tworzenia wykresów i statystyk
obrazowania życia

Bibliografia

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33(2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29(2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie sferoidów nowotworowychanaliza macierzy zewnątrzkomórkowejwpływ kwasu hialuronowegoleczenie fizetynąaktywacja tlenku azotuobrazowanie time-lapserozdzielczość pojedynczego elementu
Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.