Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58366

⸱

27 września 2018

 ,  , 
1Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB-UAB), Universitat Autònoma de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Animal Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Streszczenie

Większość patogenów atakuje organizmy przez ich błony śluzowe. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku ryb, ponieważ są one stale narażone na działanie bogatego w mikroorganizmy środowiska wodnego. Opracowanie skutecznych metod doustnego podawania immunostymulantów lub szczepionek, które aktywują układ odpornościowy przeciwko chorobom zakaźnym, jest wysoce pożądane. Opracowując narzędzia profilaktyczne, potrzebne są dobre modele eksperymentalne, aby przetestować ich skuteczność. Tutaj pokazujemy metodę doustnej intubacji dorosłego danio pręgowanego oraz zestaw procedur do preparowania i przygotowania jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Dzięki temu protokołowi możemy precyzyjnie podawać objętości do 50 μl rybom o wadze około 1 g w prosty i szybki sposób, bez szkody dla zwierząt. Metoda ta pozwala nam na zbadanie bezpośredniego wychwytu in vivo związków znakowanych fluorescencyjnie przez błonę śluzową jelit oraz zdolności immunomodulacyjnej takich leków biologicznych w miejscu lokalnym po intubacji. Łącząc dalsze metody, takie jak cytometria przepływowa, histologia, qPCR i mikroskopia konfokalna tkanki jelitowej, możemy zrozumieć, w jaki sposób immunostymulanty lub szczepionki są w stanie przekroczyć bariery błony śluzowej jelit, przejść przez blaszkę właściwą i dotrzeć do mięśnia, wywierając wpływ na układ odpornościowy błony śluzowej jelit. Model ten może być wykorzystany do testowania potencjalnych doustnych środków profilaktycznych i systemów podawania lub miejscowego działania dowolnego związku bioaktywnego podawanego doustnie.

Wprowadzenie

Celem tego artykułu jest dogłębne opisanie prostej metody doustnej intubacji danio pręgowanego, wraz z użytecznymi procedurami towarzyszącymi. Intubacja doustna z użyciem danio pręgowanego stała się praktycznym modelem w badaniach nad dynamiką chorób zakaźnych, doustną szczepionką/immunostymulantem, wychwytem i skutecznością leków/nanocząstek oraz odpornością błony śluzowej jelit. Na przykład doustna intubacja danio pręgowanego została wykorzystana w badaniu infekcji Mycobacterium marinum i Mycobacterium peregrinum1. Lovmo i wsp. Z powodzeniem wykorzystano również ten model do dostarczania nanocząsteczek i M. marinum do przewodu pokarmowego dorosłego danio pręgowanego2. Ponadto Chen i wsp. wykorzystali doustną intubację danio pręgowanego, aby wykazać, że leki zamknięte w nanocząsteczkach, gdy są podawane przez przewód pokarmowy, są transportowane przez barierę krew-mózg3. Autorzy ci przeprowadzili intubację w oparciu o metodę gauvage opisaną przez Collymore'a i wsp.4 z pewnymi modyfikacjami. Nie dostarczyli jednak bardzo szczegółowego protokołu opisującego procedurę intubacji ustnej. W tym miejscu przedstawiamy metodę doustnej intubacji dorosłych ryb danio pręgowanego na podstawie Collymore i wsp.4 Dołączamy również przygotowanie jelita do odpowiedniej analizy za pomocą cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR.

Jelito, a szczególnie jego błona śluzowa, jest pierwszą linią obrony przed infekcją i głównym miejscem pobierania składników odżywczych5. Kiedy komórki nabłonkowe i komórki prezentujące antygen w barierach błony śluzowej dostrzegają sygnały niebezpieczeństwa, wyzwalana jest natychmiastowa wrodzona odpowiedź immunologiczna. Następnie wysoce specyficzna adaptacyjna odpowiedź immunologiczna jest ustalana przez limfocyty T i B6,7. Opracowywanie szczepionek doustnych jest obecnie jednym z obszarów zainteresowania wakcynologii. Takie szczepionki byłyby skutecznym narzędziem do ochrony organizmu w miejscach narażonych ze względu na specyficzną odpowiedź komórek odpornościowych w tkankach limfatycznych związanych z błoną śluzową (MALT)8,9. W akwakulturze szczepionki błony śluzowej mają oczywiste zalety w porównaniu ze szczepionkami do wstrzykiwań. Są praktyczne do masowych szczepień, mniej pracochłonne, są mniej stresujące dla ryb i mogą być podawane młodym rybom. Niemniej jednak kandydaci na szczepionkę błonową muszą dotrzeć do drugiego segmentu jelita bez denaturacji w środowisku jamy ustnej. Muszą również przekroczyć bariery błony śluzowej, aby uzyskać dostęp do komórek prezentujących antygen (APC) w celu wywołania odpowiedzi miejscowej i/lub ogólnoustrojowej10. W związku z tym badanie wychwytu błony śluzowej przez kandydujące antygeny doustne i ich systemy dostarczania, a także wywołanej odpowiedzi immunologicznej, ma zasadnicze znaczenie dla opracowania szczepionek doustnych.

W kontekście biomedycznym, rozwijanie modelu do testowania biologicznych efektów związków po intubacji doustnej jest coraz bardziej interesujące. Wiele anatomicznych i fizjologicznych cech jelita zachowało się między liniami obustronnymi, z ssakami i rybami kostnoszkieletowymi11. Ten model intubacji jamy ustnej połączony z dalszą analizą może być narzędziem zapewniającym wgląd w biologię człowieka, a także poligonem doświadczalnym dla leków biologicznych lub innych związków in vivo.

Protokół intubacji ustnej może być wykonany przez jednego operatora, np. skutecznie podając do 50 μL zawiesiny nanocząstek białkowych rybom o wadze 1 g, z wysokim wskaźnikiem przeżywalności. Procedura jest prosta w konfiguracji i szybka; W ciągu 1 godziny można zaintubować 30 ryb. Protokół przygotowania jelit ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej jakości próbek komórek i tkanek do późniejszej analizy. Podano przykłady dalszych wyników, które pokazują przydatność protokołu w uzyskiwaniu danych związanych z wychwytem jelitowym i izolowaniem wysokiej jakości RNA do qPCR. Protokół byłby bardzo przydatny dla tych, którzy potrzebują odpowiedniego modelu do testowania dynamiki doustnych środków profilaktycznych lub innych związków w jelicie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem danio pręgowanego (Danio rerio) zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Universitat Autònoma de Barcelona (numer CEEH 1582) zgodnie z Międzynarodowymi Zasadami Kierunkowymi dotyczącymi badań z udziałem zwierząt (EU 2010/63). Wszystkie eksperymenty z żywymi rybkami danio przeprowadzono w temperaturze 26–28 °C.

1. Przygotowanie sprzętu do intubacji przezريق usta

  1. Nałóż około 1 cm cienkiej rurki silikonowej na igłę 31 G typu Luer lock, aby zakryć jej czubek.
  2. Odetnij końcówkę sterylnej pipety filtrującej 10 µL (około 2 cm), weź węższy koniec i nałóż go na rurkę silikonową w formie osłony. Upewnij się, że pipeta wystaje poza czubek igły, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
  3. Przymocuj igłę do strzykawki 100 µL typu Luer lock.
    UWAGA: Zawsze dokładnie płucz strzykawkę etanolem, a następnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, patrz Materiały) pomiędzy zabiegami.

2. Wymagane roztwory

  1. Przygotować roztwór metanosulfonianu etylu 3-aminobenzojanu (MS-222) o stężeniu 150 mg/L (do znieczulenia) lub 300 mg/L (do eutanazji), wykorzystując wodę z akwarium, w którym utrzymywane są danio pręgowane. Napełnić mały zbiornik 1 L roztworu znieczulającego i zapewnić w nim napowietrzanie.
  2. Napełnić drugi mały zbiornik 1 L wody akwariowej bez MS-222 w celu rekonwalescencji ryb i zapewnić w nim napowietrzanie.
  3. Przygotować 50 mL 1x PBS z jałowego roztworu stokowego 10x.
  4. Do analizy cytometrycznej/izolacji komórek jelitowych przygotować świeży roztwór 0,15% kolagenazy typu IV w ilości 1 mL na rybę, sporządzając go z roztworu stokowego lub z proszku w podłożu DMEM z dodatkiem 1% v/v penicyliny i streptomycyny (patrz materiały). Rozdzielić roztwór na aliquoty po 1 mL (jedna na rybę) w probówkach wirówkowych o pojemności 2 mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia etapu sekcji (wyjąć na 30 min przed).
  5. Do mikroskopii konfokalnej/utrwalania próbek przygotować 50 mL świeżego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w PBS lub rozmrozić roztwór stokowy z zamrażarki -20 °C w dygestorium.
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji. Należy używać rękawic oraz okularów ochronnych, a roztwory zawsze pozostawiać wewnątrz dygestorium.

3. Przygotowanie zawiesiny fluorescencyjnych nanocząsteczek

  1. Oznakuj nanocząstki białkowe estrem NHS Atto-488 (patrz Tabela materiałów) lub odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Resuspenduj nanocząstki w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu do stężenia 2 mg/mL.
  3. Rozpuść ester NHS Atto 488 w bezaminowym dimetylosulfoksydzie (DMSO) w stężeniu 2 mg/mL. Odstaw alikwot 10 µL w celu sprawdzenia wydajności znakowania (krok 3.7–3.8).
  4. Wymieszaj nanocząstki i ester NHS Atto 488 w stosunku molowym 1:2 (białko:barwnik), mieszając w ciemności.
  5. Odwiruj znakowane nanocząstki w wirówce przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, usuń nadsącz i zachowaj go do sprawdzenia wydajności znakowania (krok 3.7–3.8).
  6. Przemyj znakowane nanocząstki, resuspendując je w 1 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu za pomocą wortexowania oraz pipetowania w górę i w dół. Następnie usuń nadsącz poprzez wirowanie przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Powtórz krok 3.6 pięciokrotnie.
  7. Resuspenduj osad w 5 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu w probówce wirówkowej 15 mL i rozdziel fluorescencyjne nanocząstki na alikwoty w probówkach wirówkowych 1,5 mL (30 alikwotów). Odwiruj przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, usuń nadsącz i przechowuj w -80 °C, chroniąc przed światłem.
  8. Zmierz wydajność znakowania za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru.
    1. Pobierz 1 µL pierwotnego roztworu Atto 488 zachowanego z kroku 3.3 i rozcieńcz go w DMSO (np. w stosunku objętościowym 1:20). Jest to objętość wykorzystana do uzyskania stosunku molowego mieszaniny nanocząstek białkowych i Atto 488 w kroku 3.4.
    2. Pobierz 1 µL zachowanego nadsączu z reakcji znakowania z kroku 3.5. Zmierz absorbancję (abs) przy = 501 nm. Procent znakowania wynosi:
      (Wzór na obliczanie procentowej absorbancji w eksperymencie spektroskopowym.
  9. Przed eksperymentem przygotuj zawiesinę nanocząstek o pożądanym stężeniu, używając roztworu 1x PBS.

4. Znieczulanie i intubacja doustna rybek danio pręgowanych

  1. Ryby (>0,5 g) należy zagłodzić przez co najmniej 48 h przed eksperymentem, aby opróżnić jelita.
  2. Przenieść ryby (12 osobników) do zbiorników eksperymentalnych (6 L) jedną noc przed eksperymentem w celu aklimatyzacji12.
  3. Dokładnie wymieszać roztwór nanocząsteczek w wortexie (np. 2 500 obr./min przez 30 s) i pobrać pożądaną objętość zawiesiny nanocząsteczek (np. 20–50 µL) do strzykawki z założoną osłoniętą igłą.
  4. Umieścić ryby w napowietrzonym roztworze MS-222 o stężeniu 150 mg/L (patrz sekcja 2), aż opadną na dno zbiornika i przestaną reagować na uciśnięcie płetwy ogonowej; proces ten trwa mniej niż 5 min.
  5. Szybko przenieść znieczulone ryby za pomocą siatki na mokrą plastikową tackę, ułożyć zwierzę poziomo przodem do igły i natychmiast rozpocząć intubację doustną.
  6. Ostrożnie podtrzymać rybę jedną ręką i otworzyć pysk drugą ręką, używając osłoniętej igły. Delikatnie wprowadzić igłę do przełyku na głębokość około 1 cm od otworu pyska.
    UWAGA: Operator może odczuć lekki opór, gdy koniec końcówki pipety minie skrzela. Należy uważać, aby nie wprowadzać igły pod zbyt dużym kątem, co mogłoby doprowadzić do perforacji skrzeli.
  7. Powoli wstrzyknąć zawiesinę nanocząsteczek do ryby. Upewnić się, że zawiesina nie wypływa na zewnątrz przez skrzela lub pysk.
  8. Delikatnie wyjąć igłę i umieścić rybę w zbiorniku do rekonwalescencji (patrz sekcja 2). Wybudzenie zazwyczaj trwa do 1 min.
  9. Dokładnie sprawdzić rybę pod kątem wszelkich nieprawidłowości (np. krwawienie ze skrzeli jest oznaką perforacji).
  10. Po wybudzeniu ryb należy przenieść je z powrotem do zbiorników eksperymentalnych.

5. Disekcja jelit danio pręgowanego

  1. Po określonym czasie od intubacji (np. 5 h i/lub 24 h), za pomocą siatki przenieś ryby do roztworu MS-222 o stężeniu 300 mg/L w celu eutanazji (patrz sekcja 2). Upewnij się, że ruchy pokrywy skrzelowej ustały i nie występuje odruch zaciskania ogona. Zazwyczaj pięć minut jest wystarczające.
  2. Wyłów uśpione zwierzę siatką i połóż je na papierze filtracyjnym.
    UWAGA: Papier filtracyjny jest bardzo przydatny do usuwania tkanki łącznej wzdłuż jelita.
  3. Używając ostrych nożyczek sekcyjnych, wykonaj półkoliste nacięcie od odbytu do pokrywy skrzelowej, a następnie rozszerz nacięcie za pomocą precyzyjnej pęsety. Przetnij oba końce jelita, wyjmij wszystkie organy wewnętrzne i połóż je na papierze filtracyjnym.
    OSTRZEŻENIE: Pracuj szybko, aby ograniczyć metabolizm komórkowy i obumieranie komórek.
    UWAGA: Alternatywnie tkankę łączną można usuwać w PBS na lodzie.
  4. Oddziel jelito od organów wewnętrznych, dbając o zachowanie jego orientacji (od przedniego do tylnego odcinka jelita) i rozprostuj je. Zazwyczaj przedni odcinek jelita jest szerszy niż odcinek tylny. Podczas sekcji dopilnuj, aby pozyskać cały odcinek jelita.
    UWAGA: Tylny koniec u małych ryb jest dość cienki i kruchy i może ulec przerwaniu, szczególnie u zwierząt o masie <0,7 g.
  5. Przetaczaj jelito pęsetą po papierze filtracyjnym, aby oddzielić od niego tkankę łączną.
  6. Przejdź do przygotowania jelita do dalszych analiz (sekcje 6, 7 i 8).

6. Przygotowanie komórek jelitowych do cytometrii

  1. Przygotuj wcześniej alikwoty 0,15% roztworu kolagenazy (patrz sekcja 2.4).
    UWAGA: Alikwoty powinny osiągnąć temperaturę pokojową przed kontynuacją.
  2. Opcjonalnie: Kontynuując krok 5.5, rozetnij jelito wzdłuż i przemyj 1x PBS.
  3. Za pomocą pęsety umieść jelito w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL wypełnionej 0,15% roztworem kolagenazy.
  4. Umieść probówki na pionowym rotatorze laboratoryjnym na 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności.
  5. Umieść jelito na sitku komórkowym 100 µm opartym nad probówką wirówkową 50 mL. Rozdrobnij jelito tłokiem strzykawki 5 mL, przemywając 3 razy 1x PBS i zbierając przesącz do probówki wirówkowej 50 mL.
  6. Wirowarkuj probówkę 50 mL przy 400 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  7. Ostrożnie odpipetuj większość supernatantu, uważając, aby nie zgubić komórek, z których część może być związana z śluzem.
  8. Resuspenduj komórki jelitowe z dna probówki wirówkowej w 500 µL 1x PBS i przechowuj w lodzie do czasu analizy cytometrycznej.
  9. Przefiltruj próbki przez filtr komórkowy 30 µm do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 mL do analizy cytometrycznej.
  10. Ustaw parametry (np. liczbę komórek do analizy, obszar zainteresowania, napięcie i kompensację, wybór detektorów) w urządzeniu do cytometrii (patrz materiały).
  11. Niezwłocznie przeanalizuj komórki w cytometrze, zgodnie z instrukcją używania13.

7. Przygotowanie mrożonych przekrojów jelita do mikroskopii konfokalnej

  1. Wypełnij plastikową formę (patrz Tabela materiałów) do połowy objętości związkiem O.C.T. (optimum cutting temperature compound).
  2. Kontynuując krok 5.5 i bezpośrednio po sekcji, ostrożnie umieść jelito w plastikowej formie. Upewnij się, że jelito jest całkowicie zanurzone w związku O.C.T. W razie potrzeby dodaj do plastikowej formy więcej związku O.C.T.
    UWAGA: Zaleca się ułożenie jelita w kształcie litery „Z” w związku O.C.T., aby łatwiej było śledzić jego naturalną orientację.
  3. Umieść plastikową formę na suchym lodzie, aż stanie się nieprzezroczysta (mniej niż minuta).
  4. Przechowuj plastikową formę w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytku lub przetwórz ją natychmiast zgodnie z poniższą procedurą.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
  5. Pokrój zamrożone jelito na sekcje o grubości 10 µm lub odpowiedniej grubości, używając kriotomu w temperaturze -20 °C.
  6. Zbierz sekcję jelita za pomocą cienkiego pędzelka na szkiełko.
  7. Zanurz szkiełko w 4% PFA na 15 min w temperaturze pokojowej, aby utrwalić próbkę.
    OSTROŻNIE: PFA jest toksyczny. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału. Należy nosić rękawiczki i okulary ochronne, a roztwory zawsze pozostawiać w dygestorium.
  8. Przemyj szkiełko 3 razy w 1x PBS, po 10 min za każdym razem.
  9. Dodaj kroplę medium montażowego i przykryj preparat szkiełkiem podstawowym.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
  10. Obserwuj próbkę pod mikroskopem konfokalnym przy odpowiednim powiększeniu.

8. Przygotowanie jelita do ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

  1. Kontynuując krok 5.5, umieść jelito w probówce kriogenicznej, szybko zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.
  2. W celu homogenizacji dodaj do próbki jelita 200 µL schłodzonego 2% (v/v) roztworu 1-tiogliceryny/roztworu do homogenizacji (patrz Tabela materiałów) lub alternatywnego roztworu do homogenizacji.
  3. Pracuj szybko, homogenizuj próbkę jelita na lodzie za pomocą homogenizatora laboratoryjnego z wysoką prędkością (ustawioną na 25–30 000 rpm), aż do całkowitego zniknięcia widocznych fragmentów tkanki. Zazwyczaj wystarczające jest 3 cykle po 5 s.
  4. Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta14 lub inną odpowiednią metodą. W razie potrzeby przechowuj RNA w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytku.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.
  5. Oznacz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru15 i oceń jego jakość za pomocą analizatora RNA16.
  6. Przygotuj 1 µg lub odpowiednią ilość cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę. W przypadku analizy qPCR należy stosować się do wytycznych MIQE17.
  7. Zaprojektuj odpowiednie pary starterów dla interesujących genów.
  8. Wybierz odpowiedni gen referencyjny i przeanalizuj ekspresję każdego genu za pomocą systemu detekcji RT-qPCR z użyciem komercyjnego zestawu (patrz materiały).
    UWAGA: Na przykład, do każdego dołka płytki qPCR dodaj 5 µL supermixu SYBR green, 0,5 µM starterów, 2,5 µL rozcieńczonego cDNA i 1,5 µL wody, tak aby końcowa objętość wyniosła 10 µL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Danio pręgowane (średnia masa: 1,03 ± 0,16 g) obu płci zostały pomyślnie poddane intubacji z użyciem różnych nanocząsteczek białek rekombinowanych (bakteryjnych ciałek inkluzyjnych) przy wykorzystaniu naszego autorskiego urządzenia do intubacji doustnej (Rysunek 1). Pomyślnie przeprowadziliśmy intubację doustną, uzyskując niską średnią śmiertelność (6,8%) (Tabela 1). Ryby poddano intubacji z użyciem 30 µL lub 50 µL zawiesiny nanocząsteczek, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten jest ulepszeniem wcześniej opisanej techniki intubacji doustnej przez Collymore'a i wsp.4 Nasz protokół szczegółowo opisuje metodę intubacji doustnej i obejmuje przygotowanie jelita do dalszych analiz. Nasza metoda poprawia szybkość manipulacji rybami, umożliwiając jednej osobie szybkie wykonanie całego protokołu, bez większych różnic między operatorami. Główną różnicą między naszym protokołem a poprzednim jest to, że oceniamy powodzenie eksperymentu z intubacją doustną nie t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki, Komisji Europejskiej i funduszy AGAUR dla NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER i 2014SGR-345 AGAUR). RT jest stypendystą AGAUR (Hiszpania), JJ był wspierany przez stypendium doktoranckie od Chińskiej Rady Stypendialnej (Chiny), a NR jest wspierany przez program Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Dziękujemy dr Torrealba za fachowe doradztwo w zakresie produkcji białka, N. Barba z "Servei de Microscopia" i dr M. Costa z "Servei de Citometria" Universitat Autònoma de Barcelona za pomocną pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka silikonowaDow Corning508-0010,30 mm średnica wewnętrzna i 0,64 mm średnica zewnętrzna
igła Luer lockHamilton7750-2231 G, Kel-F Hub
Luer lock strzykawkaHamilton81020/01100 μ L, Kel-F Hub
Filtrowana końcówka do pipetNerbe Plus07-613-830010 μ L
MS-222Sigma AldrichE10521proszek
10x PBSSigma AldrichP5493
Bibuła filtracyjna Filter-LabRM14034252
KolagenazaGibco17104019
DMEM Gibco31966Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco
Penicylina i streptomycynaGibco15240
Sitko do komórekFalcon352360
Filtry CellTrics Sysmex Partec04-004-2326 (Wolflabs)30 µ m Filtry o wielkości oczek z zbiornikiem 2 ml
Związek Tissue-Tek O.C.T.SAKURA4583
Plastikowe formy do kriosekcjiSAKURA4557Jednorazowe formy winylowe. 25 mm x 20 mm x 5 mm
SlideThermo Scientific10149870SuperFrost Plus
slide Okulary nakrywkoweLabbox COVN-024-20024´ 24 mm
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127
Atto-488 Ester NHSSigma-Aldrich41698
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
DMSOSigma-AldrichD8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue KitPromegaAS1340
1-tioglicerol/Homogenizacja roztwórPromegaInside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kitdodając 20 μ l 1-tioglicerol do 1 ml roztworu homogenizacyjnego (2%)
pionowy rotator laboratoryjny Suministros Grupo Esper10000-01062
CryostatLeica 
HomogenizatorKINEMATICAPolytron PT1600E
Cytometr przepływowy Becton DickinsonFACS Canto
5 ml okrągłodenna rurkaFalcon352058
Mikroskop konfokalnyLeicaSP5
WyciągKottermann2-447 BST
Nanodrop 1000Thermo Fisher ScientificND-1000Spektrofotometr
Agilent 2100 System bioanalizatoraAgilentG2939ABioanalizator RNA
Instrument MaxwellPromegaAS4500 
Zestaw do syntezy cDNA iScript Bio-rad1708891
CFX384 PCR w czasie rzeczywistym  System detekcjiBio-Rad1855485
iTaq uniwersalny zestaw SYBR Green SupermixBio-rad172-5120
Woda Sigma-AldrichW4502
Fiolka kriogeniczna Thermo Fisher Scientific375418Fiolka CryoTube
Medium montażoweSigma-AldrichF6057Fluoroshield z DAPI
CM3050S

Bibliografia

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85(2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. ø An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542(2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054(2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190(2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model danio pr gowanegocytometria przep ywowamikroskopia konfokalnaanaliza qPCRsekcja jelitwakcynologia luz wkowadostarczanie nanocz steczek
Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.