Peptyd MUB40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania obecności neutrofili w stałych/permeabilizowanych odcinkach histologicznych i oceny stanu aktywacji żywych, oczyszczonych neutrofili. W szczególności peptyd MUB₄₀ wiąże laktoferynę obecną w ziarnistościach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. Ekspozycja zawartości granulek poprzez przepuszczalność lub aktywację neutrofili pozwala na znakowanie neutrofili.

Streszczenie

Tutaj oferujemy protokół obejmujący użycie MUB₄₀, syntetyzowanego peptydu o zdolności wiązania glikozylowanej laktoferyny przechowywanej w wysokich stężeniach w specyficznych i trzeciorzędowych granulkach neutrofili. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób MUB₄₀ sprzężony bezpośrednio z fluoroforem może być wykorzystany do barwienia neutrofili w utrwalonych/przepuszczalnych tkankach, a także jak można to wykorzystać w obrazowaniu żywych komórek do oznaczania aktywacji i degranulacji neutrofili. Metody wykrywania neutrofili są ograniczone do specyficznych dla gatunku przeciwciał monoklonalnych, które nie zawsze są odpowiednie do niektórych zastosowań. MUB₄₀ nie przenika przez błonę komórkową i w ten sposób jest wykluczony z laktoferyny magazynowanej w nieaktywowanych/nieprzepuszczalnych neutrofilach. MUB₄₀ ma dodatkową zaletę polegającą na rozpoznawaniu laktoferyny z szerokiego zakresu gospodarza, co czyni go szczególnie przydatnym do porównywania wyników w badaniach obejmujących wiele modeli badawczych, zmniejszania liczby zduplikowanych odczynników i upraszczania protokołów poprzez barwienie jednoetapowe.

Wprowadzenie

Neutrofile są jednym z głównych ramion wrodzonego układu odpornościowego i są rutynowo rekrutowane do miejsc zapalnych w całym ciele. Badania neutrofili były w znacznym stopniu utrudnione przez ich krótki czas życia in vitro (mniej niż 8 godzin) oraz przez ograniczone narzędzia wykrywania w warunkach podstawowych lub po aktywacji. W tym miejscu przedstawiamy dobrze przetestowany protokół szerokiego i specyficznego wykrywania neutrofili ssaków w stałych/przepuszczalnych próbkach. Udostępniamy również szczegółowy protokół barwienia żywych neutrofili za pomocą MUB₄₀. Korzystając z protokołu barwienia żywymi neutrofilami, można określić czas i miejsce aktywacji neutrofili. Protokół ten jest idealny dla badaczy, którzy chcą badać aktywację neutrofili lub uwalnianie granulek. Poza funkcjami przeciwdrobnoustrojowymi, neutrofile są obecnie doceniane jako komórki immunomodulujące zaangażowane w szeroki zakres chorób i odpowiedzi immunologicznych (wrodzonych i adaptacyjnych)^1,2. Neutrofile są obecne w większości tkanek zapalnych, w dużych ilościach w zakażonych tkankach, w guzach zapalnych³, podczas IBS i zaostrzeń choroby Leśniowskiego-Crohna⁴, oraz w obszarach niezakaźnego zapalenia, takich jak błona maziowa pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS)⁵. Neutrofile zawierają cztery klasy wstępnie uformowanych granulek o nazwach azurofile (α), specyficzne (β1), trzeciorzędowe (β2) granulki i pęcherzyki wydzielnicze (γ)⁶. Po migracji do miejsca zapalnego, zrekrutowane neutrofile ulegają aktywacji i sekwencyjnie wydzielają ziarnistość (składającą się z adhezji, związków przeciwdrobnoustrojowych i cząsteczek immunomodulujących), co sprzyja dalszej rekrutacji i przyczynia się do ustąpienia infekcji (ale także do uszkodzenia tkanki gospodarza)⁷. Chociaż neutrofile są uważane za krytyczny aspekt odporności wrodzonej, do tej pory dostępnych jest niewiele odczynników wykrywających do ich badania, a jeszcze mniej takich, które można wykorzystać do oceny stanu aktywacji żywych neutrofili.

Obecne metody wykrywania neutrofili opierają się na przeciwciałach monoklonalnych generowanych przeciwko antygenom eksponowanym na powierzchni komórki, takim jak Ly-6G² lub białkach specyficznie przechowywanych w granulkach neutrofili w warunkach podstawowych (np. mieloperoksydaza, laktoferyna). Zalety przeciwciał monoklonalnych obejmują ich silne wiązanie, czułość i wszechstronność w różnych warunkach testowych. Istnieje jednak kilka wad stosowania przeciwciał monoklonalnych, a w szczególności anty-Ly-6G. Te wady obejmują specyficzność, ponieważ Ly-6G jest obecny na większości komórek szpikowych w szpiku kostnym i na wszystkich granulocytach, w tym eozynofilach; Tak więc rozszyfrowanie neutrofili od eozynofili za pomocą tego markera wymaga bardziej złożonych podejść8. Innym częstym kompromisem w stosunku do przeciwciał monoklonalnych jest ich często ograniczony zakres swoistości gospodarza, co utrudnia badania porównawcze z więcej niż jednym gatunkiem zwierząt. Trzecią wadą metod wykrywania przeciwciał, zwłaszcza przy użyciu żywych komórek lub in vivo, jest ich potencjał do zakłócania funkcji komórek lub prowadzenia do aktywacji komórek. Na przykład podawanie anty-Ly-6G myszom jest powszechnie stosowane w przypadku zubożenia neutrofili i przejściowej neutropenii⁹. Dodatkowo wykazano, że wstrzyknięcie przeciwciała może stymulować funkcję przeciwnowotworową neutrofili¹⁰. Wreszcie, wykrywanie przeciwciał neutrofili nie ujawnia stanu aktywacji komórki.

Zidentyfikowaliśmy 40-aminokwasowy peptyd o nazwie MUB₄₀, który może być używany w wielu testach do oznaczania neutrofili w warunkach in vitro lub in vivo, a także do oznaczania statusu aktywacji żywych neutrofili¹¹. MUB₄₀ wywodzi się z MUB₇₀¹², domeny białka wiążącego śluz powierzchniowy Lactobacillus reuteri, pierwotnie opisanej ze względu na jego zdolność do wiązania śluzu^13,14. MUB₄₀ oddziałuje z glikozylowaną laktoferyną, która jest obecna w wysokich stężeniach w granulkach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. MUB₄₀ może być wystawiony na działanie tych granulek poprzez standardowe etapy przepuszczalności obecne w histopatologii lub protokołach sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu solidnego barwienia utrwalonych neutrofili. Gdy żywe neutrofile są utrzymywane w stanie inaktywowanym, peptyd MUB₄₀ jest wykluczany z zawartości granulek, a komórki nie barwią się dodatnio markerem. Po aktywacji MUB₄₀ może wiązać się z odsłoniętą laktoferyną i prowadzić do silnego zabarwienia peptydem. W ten sposób MUB₄₀ może być używany do określania stanu aktywacji oczyszczonych neutrofili, co czyni go atrakcyjnym markerem do śledzenia procesu zakaźnego. Zdolność do wiązania się z żywymi aktywowanymi neutrofilami pozwala również na wykorzystanie MUB₄₀ jako narzędzia do wykrywania obszarów zapalenia neutrofili w żywych modelach zwierzęcych (np. mysim modelu zapalenia stawów¹⁵). Protokoły zawarte w tym manuskrypcie szczegółowo opisują, w jaki sposób znakowany fluorescencyjnie MUB₄₀ może być użyty do ujawnienia neutrofili w tkankach histologicznych i jak oznaczyć aktywację żywych, oczyszczonych neutrofili in vitro.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały sprawdzone i zatwierdzone przez francuskie organizacje CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) i CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. Barwienie neutrofili w tkance histopatologicznej za pomocą znakowanego fluorescencyjnie MUB₄₀

1. Aby uzyskać tkankę do histopatologii, należy utrwalić skrawki tkanki/biopsji w odpowiedniej objętości 4% paraformaldehydu (PFA) przez 30 minut do 4 godzin, w zależności od grubości próbki. Umieścić próbki w lodówce o temperaturze 4 °C podczas utrwalania.
   Uwaga: Alternatywne metody/czasy mocowania można zastąpić w zależności od unikalnych potrzeb użytkownika.
   1. Usunąć PFA, dodać 16% roztwór sacharozy o objętości wystarczającej do całkowitego pokrycia próbki i umieścić próbkę w temperaturze 4 °C na 4 godziny do nocy.
   2. Usunąć 16% roztwór sacharozy i dodać 30% roztwór sacharozy w wystarczająco dużej objętości, aby całkowicie pokryć próbkę, i umieścić ją w temperaturze 4 °C na 4 godziny do nocy.
   3. Usuń 30% roztwór sacharozy i zetrzyj nadmiar roztworu z tkanki ręcznikiem papierowym. Umieścić wycinek tkanki w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić błyskawicznie w 2-metylobutanie schłodzonym w suchej kąpieli lodowo-etanolowej (-72 °C). Po zamrożeniu ciała stałego (po ~2 min) usuń bloki z 2-metylobutanu i umieść je na suchym lodzie, aż wszystkie bloki będą gotowe i gotowe do długotrwałego przechowywania. Zamrożone bloki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
2. W noc poprzedzającą cięcie bloków tkanek należy je wyjąć z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić w temperaturze -20 °C na noc w celu zrównoważenia.
   1. Za pomocą kriostatu pokrój tkankę zatopioną w OCT na plastry o grubości od 10 do 30 μm i zaadsorbuj do wysokiej jakości szkiełek szkiełkowych.
      Uwaga: W zależności od wymagań eksperymentalnych można użyć grubszych lub cieńszych plastrów.
   2. Za pomocą pisaka woskowego lub innej metody hydrofobowej narysuj pudełko wokół plasterka chusteczki na szklanym szkiełku i pozostaw do wyschnięcia.
   3. Przygotować roztwór barwiący, wykonując rozcieńczenie MUB_40-Cy5 (lub innej fluorescencyjnej wersji MUB₄₀, 1 mg/ml roztworu podstawowego) w 0,1% roztworze saponiny-PBS w stosunku 1:1000. Optymalne stężenie końcowe MUB₄₀ powinno wynosić 1 μg/ml.
      Uwaga: Można stosować niższe stężenia końcowe (0,1-0,01 μg/ml), ale może to prowadzić do niższej intensywności sygnału.
      UWAGA: Saponina w proszku może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Upewnij się, że ważysz saponinę w szafce lub chronionym obszarze. Można zastosować alternatywne metody przepuszczalności, takie jak Triton. Dodaj dodatkowe markery w stężeniach zalecanych przez producenta (np. 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), falloidyna, przeciwciała fluorescencyjne).
   4. Delikatnie zanurzyć szkiełko w roztworze 0,1% saponiny-PBS trzy razy.
   5. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu wokół sekcji tkanki i dodaj tyle roztworu barwiącego, aby całkowicie pokryć odcinek tkanki. Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej, aby uniknąć parowania i inkubuj je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chroń go przed światłem.
   6. Delikatnie zanurzyć szkiełko w 0,1% roztworze saponiny-PBS 3x. Następnie delikatnie zanurz szkiełko w roztworze PBS 3x. Na koniec delikatnie zanurz szkiełko w destylowanym_H2O3x. Ostrożnie osusz nadmiar płynu ze szkiełka.
   7. Dodaj niewielką ilość (~20 μL) podłoża mocującego (20 mM Tris pH 8,0, 0,5% galusanu N-propylu, 90% glicerolu) obok wycinka chusteczki i delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku. Delikatnie i równomiernie dociśnij szkiełko nakrywkowe do części chusteczki i za pomocą ręcznika papierowego ostrożnie usuń wszelkie media montażowe, które wystają wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.
   8. Umieść zamontowany suwak w ciemnej szafce na 24 godziny, aby umożliwić zastygnięcie nośnika montażowego. Alternatywnie można umieścić zamontowaną prowadnicę w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
3. Zobrazuj wycinki tkanki pod mikroskopem fluorescencyjnym zgodnie z żądaną metodą akwizycji.

2. Wizualizacja aktywacji neutrofili za pomocą peptydu Retro-Inverso-MUB_40-Cy5

1. Uzyskać ludzkie neutrofile przy użyciu następującego protokołu. Przygotuj następujące roztwory i umieść je na noc w szafce beztlenowej. Wystawienie na działanie tlenu zacznie aktywować neutrofile i dalej indukować śmierć komórki^16,17.
   Uwaga: Neutrofile mogą być alternatywnie oczyszczane "na stole" do eksperymentów znakowania MUB₄₀; Należy jednak pamiętać, że ekspozycja na tlen zacznie wpływać na aktywację neutrofili.
   1. Przygotuj następujące rozwiązanie:
      Roztwór 1 [chlorek sodu (NaCl) 0,9%]: dodać 4,5 g NaCl do 500 ml_H2O. Przefiltrować roztwór.
      Roztwór 2 (dekstran 6%): dodać 6 g dekstranu w 0,9% roztworze NaCl do 100 ml.
      Roztwór 3 (bufor do przemywania ): rozpuścić kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w PBS o pH 7,2 do końcowego stężenia EDTA 2 mM. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze PBS/EDTA tak, aby końcowe stężenie BSA wynosiło 10% w/v.
   2. Odwirować probówki do pobierania krwi o masie 650 x g przez 20 minut bez przerw.
   3. Nie przerywając oddzielania krwi, przenieś probówki do pobierania krwi do szafki beztlenowej i zbierz frakcje osocza (na górze) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   4. Wyjąć probówkę zawierającą osocze z szafki beztlenowej i odwirować przy 2 900 x g przez 20 minut z przerwami na osadzanie płytek krwi.
   5. Nie przerywając pracy granulowanych płytek krwi, delikatnie przenieść probówkę osocza z powrotem do szafki beztlenowej i odpipetować osocze ubogie w płytki krwi do świeżej probówki o pojemności 50 ml (zwanej dalej "osoczem").
2. Oddzielenie czerwonych krwinek od leukocytów
   1. Używając probówek zawierających krwinki czerwone (RBC) z kroku 2.1.3., połączyć erytrocyty w stożkową probówkę o pojemności 50 ml (5 probówek do pobierania krwi na probówkę o pojemności 50 ml).
   2. Dodaj NaCl 0,9%, aż całkowita objętość osiągnie 44 ml. Dodaj 6 ml dekstranu 6% (ostatniego).
   3. Delikatnie wymieszaj mieszaninę krwi i dekstranu, odwracając probówkę 10-20 razy. Pozostaw probówkę na osadzanie się przez co najmniej 30 minut.
   4. Podczas sedymentacji należy przygotować gradient Percoll, dodając 4,2 ml roztworu Percollu do 5,8 ml osocza w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dobrze wymieszać, odwracając probówkę.
   5. Zebrać górną frakcję dekstranu, starając się unikać pipetowania czerwonych krwinek.
   6. Dokręcić nakrętkę, wyjąć probówkę z dekstranem z komory beztlenowej i odwirować probówkę o sile 300 x g przez 10 minut z przerwami.
   7. Ostrożnie umieścić probówkę z powrotem w komorze beztlenowej bez naruszania granulowanych komórek i usunąć płyn za pomocą pipetowania.
   8. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml osocza i bardzo powoli dodawać do górnej części roztworu Percoll. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wymieszania warstw podczas pipetowania komórek znajdujących się na wierzchu.
   9. Ostrożnie wyjmij probówkę z roztworem Percoll z komory beztlenowej (unikając mieszania) i odwiruj przy 800 x g przez 20 minut bez przerw. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pozostaną na powierzchni roztworu Percollu, a neutrofile będą osadzać się z krwinkami czerwonymi.
3. Usuwanie zanieczyszczających erytrocytów
   1. Przygotować 14 ml roztworu buforowego do mycia, dodając 700 μl PBS + 10% BSA do 14 ml buforu do przemywania .
   2. Umieść probówkę z roztworem Percoll z powrotem w komorze beztlenowej. Usunąć Percoll i PBMC za pomocą pipetowania i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml roztworu buforowego do mycia. Granulka, która ma być ponownie zawieszona, będzie miała czerwony kolor z powodu zanieczyszczenia erytrocytów.
   3. Dodać 200 μl kulek magnetycznych anty-CD235a (glikoforyny) do ponownie zawieszonych komórek, delikatnie wymieszać i inkubować przez co najmniej 15 minut. Ten etap ładuje zanieczyszczające erytrocyty kulkami magnetycznymi, aby można je było usunąć.
   4. Przemyć kolumnę separacyjną 2 ml buforu płuczącego 3x.
   5. Trzymając stożkową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną separacyjną, powoli pipetuj mieszaninę neutrofili/RBC do górnej części kolumny. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml podczas ich przepływu. Przepływ powinien być mętny i tracić swój czerwony kolor, ponieważ erytrocyty pozostają związane z kolumną.
   6. Dodać 2 ml buforu płuczącego na górę kolumny i zebrać w tej samej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pod koniec płukania o objętości 2 ml przepływ powinien być czysty, co oznacza, że wszystkie neutrofile zostały zebrane.
   7. Delikatnie wymieszaj probówkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie neutrofili i zbierz 10 μl do zliczenia komórek. Zanotuj ostateczną objętość do celów zliczania komórek. Wylicz łączną liczbę komórek za pomocą dowolnej standardowej metody zliczania komórek.
   8. Wyjąć probówkę z neutrofilami z komory beztlenowej i odwirować neutrofile w stężeniu 300 x g przez 20 minut z przerwami.
   9. Umieścić osadzone neutrofile z powrotem w komorze beztlenowej i usunąć bufor płuczący za pomocą pipetowania. Ponownie zawiesić osad neutrofili w osoczu o maksymalnej gęstości komórek 10⁷ PMN/ml.
4. Oznaczanie liczby oczyszczonych neutrofili i wizualizacja za pomocą MUB₄₀
   1. Dodaj 1 μl RI-MUB_40-Cy5 (1 mg/ml) do 1 ml pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej. Dobrze wymieszać pipetując.
   2. Do celów niniejszego protokołu wynik został przedstawiony tak, jakby dodano silny odczynnik aktywujący neutrofile, N-formylometylo-leucylo-fenyloalaninę (FMLP). Dodać 1 μm FMLP do probówki RPMI/RI-MUB_40-Cy5 i mieszać przez pipetowanie w górę i w dół.
      UWAGA: Od tego momentu każda procedura eksperymentalna będzie inna, w zależności od poruszanych pytań.
   3. Przenieś mieszaninę 1 mL RPMI/RI-MUB_40-Cy5/FMLP do naczynia mikroskopowego ze szklanym dnem. Do tego naczynia dodaj objętość oczyszczonych komórek odpowiadającą 10⁶ całkowitym neutrofilom. Wymieszać delikatnie pipetując.
   4. Umieść naczynie w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym i rozpocznij akwizycję obrazu. Na przykład zaleca się uzyskanie obrazów wyjściowych przed dodaniem odczynnika aktywującego neutrofile, takiego jak FMLP lub bakterii. W tym przykładzie rozpocznij akwizycję RPMI/RI-MUB_40-Cy5/neutrofili, a następnie odpipetuj odczynnik aktywujący neutrofile do szklanego naczynia i kontynuuj akwizycję obrazu.
      UWAGA: Modyfikacje tych kroków mogą być wprowadzane w oparciu o potrzeby naukowe.
   5. Przetwarzaj pozyskane obrazy/filmy poklatkowe w odniesieniu do konkretnego używanego mikroskopu.

Wyniki

Wyniki barwienia tkanek przeciwciałem MUB₄₀ na preparatach histopatologicznych zazwyczaj ukazują pojedyncze komórki rozproszone w całej tkance. MUB₄₀ barwi laktoferrynę, która występuje w granulach neutrofili i jest w nich przedzielona. W związku z tym typowo widoczne jest barwienie punktowe lub kilka dużych, rozdzielonych obszarów sygnału pochodzących od pojedynczych neutrofili (Rysunek 1). Pomocne jest dodanie drugiego markera komórkow...

Dyskusja

Tutaj opisano dwa testy, w których peptyd MUB₄₀ jest używany do badania zapalenia i aktywacji neutrofili. Pokazujemy, w jaki sposób MUB₄₀ może ujawnić neutrofile obecne w skrawkach histopatologicznych lub pokazać ich stan aktywacji za pomocą żywych oczyszczonych neutrofili. Krytyczne etapy stosowania MUB₄₀ jako odczynnika barwiącego są takie same, jak w przypadku każdej innej metody wykrywania fluorescencyjnego. Należy dołożyć starań, aby zapewnić kompatybilność sygnałów fluorescencyjnych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescencyjny peptyd MUB40 (dostępny z innymi sprzężonymi fluoroforami)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescencyjny peptyd MUB40. Syntetyzowany z D-aminokwasami i odporny na proteazy (dostępny z innymi sprzężonymi fluoroforami)
Parformaldehyd	Sigma-Aldrich	16005	Utrwalacz do histologii
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S7903	Roztwór stosowany do usuwania nadmiaru PFA
Związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Służy do zamrażania tkanek przed sekcją kriostatu
2-metylobutan	Sigma-Aldrich	M32631	Służy do zamrażania tkanek przed sekcją kriostatu
Etanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Używany do kąpieli w suchym lodzie do zamrażania tkanek
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Służy do cięcia tkanek
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-518-101
Szkiełka nakrywkowe	Thor Labs	CG15CH	Szkiełko nakrywkowe Hi precision
Dako długopis	Sigma-Aldrich	Z377821	Służy do zapobiegania utracie płynów podczas barwienia tkanek
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Służy do przepuszczalności komórek do barwienia IF
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Barwie DNA
Alexa fluor 488 Falloidyna	Fisher Scientific	A12379	Wiąże aktynę
Prolong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Przedłuża sygnał IF i odporność na fotowybielanie
Mikroskop fluorescencyjny	Różne		Różne Używane do obrazowania szkiełek IF
Szafka anoksykowa	Różne	Różne	Używane do oczyszczania żywych inaktywowanych neutrofili
Chlorek sodu NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Składnik buforowy do płukania
MACS Bas bufor	Miltenyi Biotec	130-091-376	Składnik buforowy do płukania
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient do oczyszczania neutrofili
CD235a glikoforyna mikrokulki magnetyczne	Miltenyi Biotec	130-050-501	Służy do usuwania zanieczyszczających erytrocytów
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Stosowany do usuwania erytrocytów czerwonych z neutrofili
RPMI-1640 bez Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Używany do oznaczania neutrofili