Artykuł metodologiczny

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

DOI:

10.3791/58369

⸱

28 września 2018

 ,  , 
1Molecular Plant Biology, Department of Biochemistry, University of Turku

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosyntetyczny łańcuch transferu elektronów (ETC) przekształca energię słoneczną w energię chemiczną w postaci NADPH i ATP. Cztery duże kompleksy białkowe osadzone w błonie tylakoidów zbierają energię słoneczną, aby kierować elektrony z wody do NADP+ za pośrednictwem dwóch fotosystemów i wykorzystują utworzony gradient protonów do produkcji ATP. Fotosystem PSII, PSI, cytochrom b6f (Cyt b6f) i ATPaza są kompleksami wielobiałkowymi o odrębnej orientacji i dynamice w błonie tylakoidów. Cenne informacje na temat składu i interakcji kompleksów białkowych w błonie tylakoidów można uzyskać poprzez rozpuszczanie kompleksów z integralności błony za pomocą łagodnych detergentów, a następnie natywne elektroforetyczne rozdzielanie kompleksów w żelu. Elektroforeza w postaci niebieskiego natywnego żelu poliakrylamidowego (BN-PAGE) jest metodą analityczną stosowaną do rozdzielania kompleksów białkowych w ich postaci natywnej i funkcjonalnej. Metoda ta może być stosowana do oczyszczania kompleksów białkowych w celu bardziej szczegółowej analizy strukturalnej, ale zapewnia również narzędzie do analizy dynamicznych interakcji między kompleksami białkowymi. Metoda została opracowana do analizy mitochondrialnych kompleksów białek oddechowych, ale od tego czasu została zoptymalizowana i ulepszona pod kątem rozwarstwiania kompleksów białkowych tylakoidów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy, aktualny protokół analizy labilnych kompleksów białek fotosyntetycznych i ich interakcji z Arabidopsis thaliana.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże wielopodjednostkowe kompleksy białkowe fotosystem PSI i PSII, Cyt b6f i ATPaza koordynują produkcję NADPH i ATP w reakcjach światła fotosyntetycznego. W wyższych chloroplastach roślinnych kompleksy znajdują się w błonie tylakoidowej, która jest strukturalnie niejednorodną strukturą błonową, składającą się z przytłumionych tylakoidów grana i nieprzytłoczonych zrębów. Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) jest szeroko stosowaną metodą w analizie dużych wielopodjednostkowych kompleksów białkowych w ich natywnej i biologicznie aktywnej formie. Metoda została opracowana do preparacji mitochondrialnych kompleksów białkowych błony1, ale później została dostosowana do oddzielania kompleksów białkowych od sieci błony tylakoidowej3. Metoda jest odpowiednia (i) do oczyszczania poszczególnych kompleksów białkowych tylakoidów do analizy strukturalnej, (ii) do określania natywnych interakcji między kompleksami białkowymi oraz (iii) do analizy ogólnej organizacji kompleksów białkowych pod wpływem zmieniających się sygnałów środowiskowych.

Przed separacją, kompleksy białkowe są izolowane z błony za pomocą starannie dobranych detergentów niejonowych, które są na ogół łagodne i zachowują natywną strukturę kompleksów białkowych. Detergenty zawierają miejsca hydrofobowe i hydrofilowe i tworzą stabilne micele powyżej pewnego stężenia, zwanego krytycznym stężeniem micelarnym (CMC). Zwiększenie stężenia detergentu powyżej CMC powoduje zakłócenie oddziaływań lipidowo-lipidowych oraz solubilizację kompleksów białkowych. Wybór detergentu zależy od stabilności interesującego kompleksu białkowego oraz od zdolności solubilizacji detergentu. Rutynowo stosowanymi detergentami są α/β-dodecyl-maltozyd i digitonina. Po rozpuszczeniu kompleksów białkowych w ich stanie naturalnym, nierozpuszczalny materiał jest usuwany przez odwirowanie. U roślin wyższych błona tylakoidowa ma wysoce heterogeniczną strukturę, a niektóre detergenty (np. digitonina) selektywnie rozpuszczają tylko określoną frakcję błony3. Dlatego, aby scharakteryzować organizację kompleksu białkowego lub interakcje między kompleksami białkowymi, ważne jest, aby zawsze określać zdolność rozpuszczania wybranego detergentu poprzez określenie zawartości chlorofilu i stosunku a/b chlorofilu w supernatancie w celu oceny wydajności i reprezentowanej (sub)domeny tylakoidu, odpowiednio, rozpuszczonej frakcji. Stosunek chlorofilu a/b w nienaruszonych tylakoidach roślin aklimatyzowanych do wzrostu wynosi zwykle około 3, podczas gdy wartość chl a/b frakcji tylakoidów wzbogaconych w tylakoidy grana lub zrębowe spada odpowiednio poniżej (~2,5) lub przekracza (~4,5) wartość całkowitych tylakoidów.

Aby dostarczyć ujemny ładunek do kompleksów białkowych, do rozpuszczonej próbki dodaje się barwnik Coomassie brilliant blue (CBB). Ze względu na przesunięcie ładunku kompleksy białkowe migrują w kierunku anody i są rozdzielane na gradiencie akryloamidu (AA) zgodnie z ich masą cząsteczkową i kształtem. Efektywną separację o wysokiej rozdzielczości uzyskuje się dzięki zastosowaniu liniowego gradientu stężenia akrylamidu. Podczas elektroforezy kompleksy białkowe migrują w kierunku anody, aż osiągną zależny od wielkości limit wielkości porów. Wielkość porów żelu poliakryloamidowego zależy od (i) całkowitego stężenia akrylamidu/bis-akrylamidu (T) oraz (ii) stężenia monomeru bis-akrylamidu sieciującego (C) w stosunku do całkowitych monomerów4. Po rozdzieleniu za pomocą BN-PAGE, kompleksy białkowe mogą być dalej dzielone na ich indywidualne podjednostki białkowe za pomocą drugiego wymiaru (2D)-SDS-PAGE. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół analizy kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie BN Gel1,2,3

  1. Zestaw kółek żelowych z płytkami o wymiarach 8 cm x 10 cm (prostokątne szkło i płytka z tlenku glinu) należy ustawić zgodnie z instrukcją producenta za pomocą dystansów 0,75 mm.
  2. Umieść mieszalnik gradientowy na płytce mieszającej i połącz go z pompą perystaltyczną za pomocą rurki. Przymocuj igłę strzykawki do drugiego końca rurki i umieść igłę między szklaną a aluminiową płytką. Umieścić mieszadło magnetyczne w "ciężkiej" komorze (H).
  3. Przygotować 3,5% (v/v) i 12,5% (v/v) roztwory akrylamidu (AA) w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml do gradientu żelu rozdzielającego (patrz przepisy w tabeli 1). Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, podczas przygotowywania roztworów należy trzymać probówki wirówkowe na lodzie.
    UWAGA: Akrylamid jest neurotoksyczny i rakotwórczy, należy nosić odzież ochronną i rękawice.
  4. Dodaj 5% APS i TEMED bezpośrednio przed pipetowaniem roztworów do mieszalnika gradientowego. Odpipetować 12,5% roztwór do komory H.
    1. Usunąć pęcherzyki powietrza z kanału łączącego komorę "lekką" (L) i H, otwierając zawór łączący dwie komory, umożliwiając przedostanie się roztworu do komory L. Zamknij zawór i odpipetuj ślady roztworu z powrotem do komory H.
    2. Na koniec odpipetuj 3,5% roztwór do komory L.
  5. Włączyć mieszadło magnetyczne (prędkość mieszania nie jest krytyczna, ale powinna zapewnić prawidłowe wymieszanie ciężkich i lekkich roztworów), otworzyć zawory i włączyć pompę perystaltyczną. Pozwól, aby roztwory żelu przepływały między szklaną a aluminiową płytą, natężenie przepływu powinno wynosić około 0,5 ml / min. Igła musi cały czas znajdować się nad płynem, można ją przymocować do górnej części szklanej płytki za pomocą taśmy.
  6. Gdy komory H i L zostaną opróżnione, napełnij je ultraczystą wodą i pozwól, aby woda delikatnie pokryła powierzchnię żelu. Polimeryzacja żelu trwa około 1-2 godzin w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 3% roztwór akrylamidu (patrz przepis w Tabeli 1) dla żelu do układania w stosie w temperaturze pokojowej. Odpipetować żel do układania na wierzchu spolimeryzowanego żelu separacyjnego (przed odlaniem żelu do układania należy usunąć wodę pokrywającą powierzchnię żelu) i umieścić grzebień żelowy do próbki między szklaną a aluminiową płytką, unikając pęcherzyków powietrza.
    1. Pozostawić do polimeryzacji na 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyjmij grzebień pod ultraczystą wodą. Przechowywać żel w temperaturze +4 °C.
      Punkt pauzy. Żel można przechowywać w temperaturze +4 °C przez kilka dni. Żel należy przechowywać w wilgotnych warunkach, aby uniknąć wysuszenia studzienek i powierzchni żelu.

2. Solubilizacja tylakoidów1,2,3

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane przy bardzo słabym oświetleniu. Próbki i należy przechowywać na lodzie.

  1. Rozcieńczyć wyizolowane tylakoidy lodowatym buforem 25BTH20G do końcowego stężenia chlorofilu 1 mg / ml. Do analizy 2D-BN-SDS-PAGE odpowiednie jest około 4-8 μg chlorofilu/próbkę.
    UWAGA: Tyrakoidy użyte w eksperymentach muszą być wyizolowane ze świeżych liści (protokół izolacji tylakoidów, patrz3)
  2. Dodać równą objętość buforu detergentu, tj. 2% β-DM (w/v) lub 2% digitoniny (w/v). Delikatnie wymieszać detergent z próbką tylakoidów za pomocą końcówki pipety i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Końcowe stężenie detergentu wynosi 1%, a tylakoidów 0,5 mg Chl/ml.
    1. Rozpuszczaj tylakoidy przez 2 minuty na lodzie (β-DM) lub 10 minut w temperaturze suchej masy, z ciągłym delikatnym mieszaniem na kołysce/wytrząsarce (digitonina).
      UWAGA: Digitonina i β-DM są powszechnie stosowane do solubilizacji kompleksów białkowych tylakoidów. Jeśli stosowane są inne detergenty niejonowe, należy najpierw zoptymalizować stężenie detergentu i czas solubilizacji. Zwykle stężenie detergentu waha się od 0,5% -5% (v/v).
      UWAGA: Digitonina jest toksyczna, należy nosić odzież ochronną i rękawice
  3. Usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g przez 20 minut, w temperaturze +4 °C.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1/10 (v/v) buforu CBB do próbki.
    UWAGA: Podczas badania ogólnego składu kompleksów białkowych błony tylakoidowej zaleca się określenie wydajności i reprezentowanej domeny tylakoidów frakcji rozpuszczonej. Aby określić wydajność rozpuszczonego materiału, należy pobrać 5 μl supernatantu do nowej probówki (przed dodaniem CBB) i zmierzyć zawartość Chl oraz stosunek Chl a/b5.

3. BN-PAGE1,2,3

  1. Ustawić żel w pionowym systemie elektroforezy (np. Hoefer SE 250). Napełnić górną komorę buforową niebieskim buforem katodowym (patrz tabela 1) i wlać bufor anodowy do dolnej komory buforowej.
  2. Załaduj próbkę tylakoidów (np. 5 μg chlorofilu) do studzienek.
  3. Rozpocznij elektroforezę i stopniowo zwiększaj napięcie: 75 V przez 30 min, 100 V przez 30 min, 125 V przez 30 min, 150 V przez 1 h i 175 V, aż do całkowitego rozdzielenia kompleksów. Uruchom żel w temperaturze +4°C, korzystając z chłodni lub regulując temperaturę żelu za pomocą systemu chłodzenia.
    UWAGA: Zmień niebieski bufor katodowy na przezroczysty bufor katody, gdy przód próbki przesunął się o około jedną trzecią żelu.
  4. Po przebiegu elektroforetycznym zeskanuj żel za pomocą fotoskanera w celu archiwizacji obrazu.

4. STRONA 2D-SDS

  1. Zmontuj pionowy system elektroforezy (rozmiar żelu 16 cm x 20 cm). Użyj podkładek dystansowych 1 mm.
  2. Przygotować standardowy żel SDS (12% akrylamid, 6 M mocznik, patrz przepis w Tabeli 2) za pomocą grzebienia 2D (jedna duża studzienka na pasek i jedna standardowa studzienka na marker masy cząsteczkowej).
  3. Wytnij pas z żelu BN i umieść go w probówce (5 ml). Dodać 2 ml buforu Laemmli (zawierającego 5% β-merkaptoetanolu) i inkubować pas przez 45 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść pas ruchu, za pomocą np. przekładki, na wierzchu żelu, unikając pęcherzyków powietrza.
  5. Odmierzyć pipetę 5 μl markera masy cząsteczkowej na wąski kawałek bibuły filtracyjnej i umieścić bibułę w studzience wzorcowej.
  6. Aby uszczelnić pasek żelu BN i papier znacznikowy, wlej 0,5% agarozy (w buforze bieżącym) na wierzch paska żelu i pozostaw do zestalenia.
  7. Wykonaj elektroforezę zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przebiegu elektroforetycznym zwizualizuj białka za pomocą np. barwienia Sypro Ruby lub barwienia srebrem zgodnie z6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny system 2D-BN/SDS-PAGE w Rysunek 1 pokazuje rozdzielenie kompleksów białkowych tylakoidów rozpuszczonych w digitoninie i β-DM oraz ich szczegółowy skład podjednostek białkowych. Wzór kompleksu białkowego tylakoidów rozpuszczonych w digitoninie (poziomy żel na górze na górze Rysunek 1A) zawiera megakompleks PSII-LHCII-PSI, dwa duże superkompleksy PSII-LHCII (sc), superkompleks PSI-LHCII, monomer PSI (m), PSII m/Cyt b6f, lu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maszyneria konwersji energii fotosyntetycznej składa się z dużych wielopodjednostkowych kompleksów białkowych, które są osadzone w błonie tylakoidów. Protokół ten opisuje podstawową metodę analizy kompleksów białkowych roślinnych tylakoidów z Arabidopsis thaliana z BN-PAGE w połączeniu z 2D-SDS-PAGE. Protokół nadaje się również do analizy kompleksów białkowych tylakoidów z tylakoidów tytoniu i szpinaku, ale może wymagać niewielkich korekt.

Do solubilizacji kompleksów białek błonowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane finansowo przez Akademię Fińską (projekty nr 307335 i 303757) oraz umowę grantową Marie Skłodowska-Curie (675006) na wykorzystanie energii słonecznej na biomasę (SE2B). Protokół jest oparty na reference3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 6-aminokapronowy (ACA)Sigma-AldrichA2504
BisTrisSigma-AldrichB4429
SacharozaSigma-AldrichS0389
Akrylamid (AA)Sigma-AldrichA9099Uwaga: Neurotoksyczny!
n-dodecyl-β-D-maltozydSigma-AldrichD4641
TricineSigma-AldrichT0377
TrisSigma-AldrichT1503
SDSVWR442444H
MocznikVWR28877.292
GlicerolJ.T. Baker7044
Fluorek sodu (NaF)J.T. Baker3688
Sól disodowa EDTAJ.T. Baker1073
DigitoninaCalbiochem300410Uwaga: Toksyczny!
Pefabloc SCRoche11585916001
Serva Coomassie Blue GServa35050
β-merkaptoetanolBio-Rad1610710
APS (Nadsiarczan amonu)Bio-Rad161-0700
TEMED (Tetrametyloetylenodiamina)Bio-Rad1610801
(N,N'-metyleno)-bis-akryloamidOmnipur2610
GlycineFisherG0800
Wstępnie barwiony marker białkowy, szeroki zakres (7-175 kDa)New England BiolabsP7708
Falcon, stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCorning352093
Podwójne kółko żelowe z płytkami 10 x 8 cmHoeferSE215
Maszyna do gradientów SG5Hoefer
Podkładki dystansowe T 0,75 mmHoeferSE2119T-2-.75
Grzebień żelowy do próbek, 0,75 mmHoeferSE211A-10-.75
Potężny mały pionowy system elektroforetyczny SE250HoeferSE250
Ismatec
Zasilacz, wirówka PowerPac HVBio-Rad164-5097
Eppendorf5424R
Rocker-ShakerBiosanBS-010130-AAI
br/> PROTEAN II xi CellBio-Rad1651813
Pompa IPC <

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

a cuch transportu elektron w w procesie fotosyntezyoczyszczanie kompleks w bia kowychsolubilizacja digitoninsolubilizacja Beta DManaliza 2 SDS PAGEbufor Coomassie Brilliant Bluebarwnik SUPRO Rubyanaliza spektrometri mas

Powiązane artykuły