Artykuł metodologiczny

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

DOI:

10.3791/58370

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę różnicowania śródbłonka dla komórek progenitorowych serca. W szczególności koncentruje się na tym, jak stężenie surowicy i gęstość wysiewu komórek wpływają na potencjał różnicowania śródbłonka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki progenitorowe serca (CPC) mogą mieć potencjał terapeutyczny do regeneracji serca po urazie. W sercu dorosłych ssaków wewnętrzne CPC są niezwykle rzadkie, ale rozszerzone CPC mogą być przydatne w terapii komórkowej. Warunkiem wstępnym ich stosowania jest ich zdolność do różnicowania się w kontrolowany sposób w różne linie serca przy użyciu zdefiniowanych i skutecznych protokołów. Ponadto, po ekspansji in vitro, CPC wyizolowane od pacjentów lub przedkliniczne modele choroby mogą stanowić owocne narzędzia badawcze do badania mechanizmów chorobowych.

Obecne badania używają różnych markerów do identyfikacji CPC. Jednak nie wszystkie z nich ulegają ekspresji u ludzi, co ogranicza wpływ translacyjny niektórych badań przedklinicznych. Protokoły różnicowania, które mają zastosowanie niezależnie od techniki izolacji i ekspresji markerów, pozwolą na standaryzowaną ekspansję i torowanie CPC do celów terapii komórkowej. Tutaj opisujemy, że pobudzanie CPC w warunkach niskiego stężenia płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i niskiej gęstości komórek ułatwia różnicowanie śródbłonka CPC. Korzystając z dwóch różnych subpopulacji CPC myszy i szczurów, pokazujemy, że laminina jest bardziej odpowiednim substratem niż fibronektyna do tego celu zgodnie z następującym protokołem: po hodowli przez 2 - 3 dni w pożywce, w tym w suplementach utrzymujących multipotencję i z 3,5% FBS, CPC wysiewa się na lamininie w <60% zbiegu i hoduje w pożywce bez suplementów o niskim stężeniu FBS (0,1%) przez 20 - 24 godziny przed różnicowaniem w pożywce różnicującej śródbłonek. Ponieważ CPC są populacją niejednorodną, może być konieczne dostosowanie stężeń w surowicy i czasu inkubacji w zależności od właściwości odpowiedniej subpopulacji CPC. Biorąc to pod uwagę, technika ta może być stosowana również do innych typów CPC i stanowi użyteczną metodę badania potencjału i mechanizmów różnicowania oraz tego, jak choroba wpływa na nie przy użyciu CPC wyizolowanych z odpowiednich modeli choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania potwierdzają istnienie rezydentnych komórek progenitorowych serca (CPC) u serca dorosłego ssaka1,2,3, a CPC mogą być użytecznym źródłem do terapii komórkowej po urazie serca4,5. Ponadto, rozszerzone CPC mogą stanowić owocny model do badań przesiewowych leków i badania mechanizmów chorobowych po odizolowaniu od pacjentów z rzadkimi kardiomiopatiami lub od odpowiednich modeli choroby6,7.

CPC wyizolowane z dorosłego serca posiadają cechy komórek macierzystych/progenitorowych1,2,3,8 ponieważ są multipotencjalne, klonogeniczne i mają zdolność do samoodnawiania. Istnieje jednak wiele różnych (sub)populacji CPC wykazujących różne profile markerów powierzchniowych, w tym na przykład c-kit, Sca-1 i inne, lub pozyskiwanych za pomocą różnych technik izolacji (tabela 1). Ustanowiono kilka protokołów kulturowych i różnicujących1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Protokoły te różnią się głównie w odniesieniu do czynnika wzrostu i zawartości surowicy, które są dostosowywane w zależności od celu hodowli i co może prowadzić do różnic w wynikach i wynikach, w tym skuteczności różnicowania.

Techniki izolacji oparte na markerach:

CPC mogą być izolowane na podstawie określonego wyrażenia znacznika powierzchni1,2,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18. Wcześniejsze badania sugerują, że c-kit i Sca-1 mogą być najlepszymi markerami do izolowania rezydentnych CPCs1,11,14,19,20. Ponieważ żaden z tych markerów nie jest tak naprawdę specyficzny dla CPC, zwykle stosuje się kombinacje różnych markerów. Na przykład, podczas gdy CPC wyrażają niskie poziomy c-kit21, c-kit jest również wyrażany przez inne typy komórek, w tym mastucyjne komórki22, komórki śródbłonka23 i hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe24. Dodatkowym problemem jest fakt, że nie wszystkie markery ulegają ekspresji u wszystkich gatunków. Tak jest w przypadku Sca-1, który wyraża się w myszy, ale nie w human25. W związku z tym stosowanie protokołów, które są niezależne od markerów izolacji, może być korzystne ze względu na badania kliniczne i badania z wykorzystaniem próbek ludzkich.

Techniki izolacji niezależne od markerów:

Istnieje kilka głównych technik izolacji CPC, które są przede wszystkim niezależne od ekspresji znaczników powierzchniowych, ale które mogą być udoskonalone przez sekwencyjny wybór określonych podfrakcji marker-dodatnich w zależności od potrzeb (zobacz również Tabelę 1). (1) Technika populacji bocznej (SP) została pierwotnie scharakteryzowana w prymitywnej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych w oparciu o zdolność do wypływu barwnika DNA Hoechst 3334226 przez transportery kasety wiążącej ATP (ABC)27. Komórki SP serca zostały wyizolowane przez różne grupy i stwierdzono, że wyrażają różne markery z niewielkimi różnicami między raportami2,8,13,14. (2) Komórki fibroblastów tworzących kolonie (CFU-F) zostały pierwotnie zdefiniowane na podstawie fenotypu podobnego do mezenchymalnych komórek zrębu (MSC). Wyizolowane MSCs są hodowane na szalkach w celu wywołania tworzenia kolonii. Takie tworzące kolonie podobne do MSC CFU-F mogą być izolowane z dorosłego serca i są zdolne do różnicowania się w linie sercowe15. (3) Komórki pochodzące z kardiosfery (CDC) to pojedyncze komórki pochodzące z klastrów komórek wyhodowanych z biopsji tkanek lub eksplantatów28,29,30,31. Niedawno wykazano, że głównie frakcja komórek CD105+/CD90-/c-kit- wykazuje potencjał kardiomiogenny i regeneracyjny32.

Tutaj, korzystając z SP-CPC wyizolowanych od myszy, dostarczamy protokół do efektywnej indukcji linii śródbłonka oparty na poprzednim badaniu na szczurzych CPC i mysich SP-CPCs33. Protokół zawiera specyficzne adaptacje do techniki hodowli i ekspandacji w odniesieniu do gęstości komórek, zawartości surowicy w pożywce i substratu. Może być stosowany nie tylko do mysich SP-CPC, ale do różnych typów CPC w celu wywołania zmiany losu z CPC wzmacniającego na CPC zaangażowanego śródbłonka, czy to w celu przeszczepienia tych komórek, czy ich wykorzystania do mechanistycznych badań in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie myszy do izolacji komórek było zgodne z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz ze szwajcarskim prawem ochrony zwierząt i zostało zatwierdzone przez szwajcarskie władze kantonalne.

UWAGA: Izolacja Sca-1+/CD31- SP-CPC od serca myszy została zasadniczo przeprowadzona tak, jak wcześniej opisano34 z pewnymi modyfikacjami. Aby zapoznać się z użytymi materiałami i odczynnikami, patrz Tabela materiałów. We wszystkich eksperymentach sercowe SP-CPC wyizolowane od myszy amplifikowano, pasażowano i stosowano w sposób podobny do linii komórkowej. W tym badaniu wykorzystano fragmenty 7 - 20.

1. Przygotowanie tkanek

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na myszach muszą być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami. Ten protokół wykorzystuje cztery myszy. Płytki hodowlane o średnicy 100 mm są opisane jako P100, a płytki hodowlane o średnicy 60 mm są opisane jako P60 w poniższych częściach protokołu.

  1. Wstrzyknąć każdej myszy 200 mg/kg pentobarbitalu dootrzewnowo (i.p.) i poczekać, aż zostanie w pełni znieczulona, sprawdzając jej reakcję na szczypanie palca.
  2. Przetrzyj klatkę piersiową 70% etanolem. Przetnij skórę i ścianę klatki piersiowej nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową.
  3. Podnieś serce kleszczami i przetnij je u podstawy za pomocą nożyczek. Umieść serce w P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (trzy do pięciu serc na P100 lub od jednego do dwóch serc na P60).
  4. Pompuj serce kleszczami, aby wyrzucić krew z jam (Rysunek 1A).
  5. Umieść serce w P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego PBS do mycia. Usuń przedsionki za pomocą małych nożyczek. Pokrój serce na dwie podłużne części i umyj je ponownie w lodowatym PBS (25 ml/P100, 5 mL/P60).
  6. Przenieś kawałki do nowego P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego PBS. Pokrój kawałki na mniejsze kawałki za pomocą małych nożyczek (Rysunek 1B). Dodaj kroplę 1 mg/ml kolagenazy B rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) i dokładnie zmiel małe kawałki sterylną żyletką (Rysunek 1C).

2. Trawienie

  1. Dodaj 10 ml (2,5 ml dla P60) 1 mg/ml roztworu kolagenazy B do naczynia z kroku 1.6.
  2. Umieść roztwór kolagenazy B zawierający zmielone kawałki serca w nachylonym (około 30°) P100 (lub P60) inkubatorze o temperaturze 37 °C (Rysunek 1D).
  3. Inkubować zmielone kawałki serca przez maksymalnie 30 minut; homogenizować poprzez wielokrotne przepuszczanie ich przez pipetę Pasteura co 10 minut podczas inkubacji (Rysunek 1E).
    UWAGA: Ważne jest, aby nie przekraczać łącznie 30 minut inkubacji dla kroku 1.3.

3. Filtracja

  1. Do zmielonych i homogenizowanych kawałków serca dodać 10 ml (5 ml dla P60) zimnego HBSS uzupełnionego 2% FBS.
    UWAGA: HBSS uzupełniony o 2% FBS wygasza aktywność kolagenazy B.
  2. Przefiltruj kawałki serca przez filtr 100 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę i odwiruj przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Rysunek 1F, żółte filtry).
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml (3 ml dla P60) buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować osad przez 5 minut, od czasu do czasu wstrząsając na lodzie.
  4. Dodaj 10 ml (5 ml dla P60) PBS (aby zatrzymać reakcję lizy) i przefiltruj próbkę przez filtr 40 μm, aby wykluczyć większe komórki, w tym resztkowe kardiomiocyty (Rysunek 1F, niebieskie filtry).
  5. Odwirować probówkę o sile 470 x g przez 5 minut przy temperaturze pokojowej (bez hamulca). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM, w tym 10% FBS.
  6. Policz komórki w podwielokrotności za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki za pomocą DMEM, w tym 10% FBS, dążąc do końcowego stężenia komórek 1 x 106 komórek/mL.
    UWAGA: Na mysz można oszacować około 5 x 106 komórek zubożonych w kardiomiocyty i erytrocyty.
  7. Rozmieść komórki do dwóch probówek (Rysunek 2): w probówce A dodaj 1,5 ml do barwienia Hoechst 33342 werapamilem; do probówki B dodaj 18,5 ml do barwienia Hoechst 33342 i przystąp do barwienia i sortowania (kroki 4.1 i 4.2) komórek SP serca za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Sortowanie komórek SP serca za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Werapamil hamuje wypływ Hoechst poprzez blokowanie aktywności transportera ABC oporności wielolekowej (MDR). Hoechst 33342 to barwnik wiążący DNA, który może być stosowany w żywych komórkach do wykrywania cyklu komórkowego, ponieważ koreluje on z zawartością DNA. Komórki wytłaczające Hoechst-33342 pojawiają się w dolnej części obu kanałów emisyjnych Hoechst (450 nm, niebieski Hoechst; 650 nm, czerwony Hoechst), czyli poza "główną populacją" zachowującą Hoechst, nadając im nazwę "populacja boczna". Komórki SP są wzbogacone w komórki o właściwościach progenitorowych i wykazują wysoką ekspresję wielolekoopornych transporterów ABC (takich jak MDR1 i ABCG2). Hoechst 33342 jest zapisywany jako Hoechst dla następujących części protokołu. Ważne jest, aby chronić materiały wrażliwe na światło, aby uzyskać idealne rezultaty.

  1. Barwienie preparatem Hoechst w obecności i bez werapamilu
    1. Dodać werapamil (o końcowym stężeniu 83,3 μM) i Hoechst (o końcowym stężeniu 5 μg/106 komórek) do roztworu komórkowego. W przypadku rurki A należy użyć Verapamil i Hoechst; w przypadku rurki B należy używać tylko Hoechst. Inkubować w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C) przez 90 minut i odwracać probówki co 20 minut (Rysunek 1G).
    2. Odwirować probówki o stężeniu 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w HBSS (1 x 106 komórek/ml).
    3. Weź 1,5 ml podwielokrotności do pojedynczych barwień i kontroli ujemnej z probówki B (Rysunek 2): (i) anty-Sca-1 sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC); (ii) anty-CD31 sprzężoną z allofikocyjaniną (APC); (iii) komórki niebarwione (kontrola ujemna).
      UWAGA: Kontrolki Isotype są tutaj używane do ustawiania protokołu izolacji.
    4. Probówki wirówkowe A i B oraz podwielokrotności do pojedynczego barwienia i kontroli ujemnej w dawce 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wypłukania Hoechsta i werapamilu.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki probówki A oraz (iii) kontrolę ujemną w 250 μl HBSS i przechowywać je na lodzie w ciemności do czasu sortowania.
    6. Zawiesić osad z probówki B w 200 μl HBSS, a osad z (i, ii) podwielokrotności jednobarwnych w 100 μl HBSS. Dodaj anty-Sca-1 sprzężony z FITC (0,6 μg / 107 komórek) i anty-CD31 sprzężony z APC (0,25 μg / 107 komórek). Inkubuj granulki przez 30 minut na lodzie i potrząsaj nimi od czasu do czasu w ciemności.
    7. Dodaj 2 ml HBSS do probówek. Odwirować probówki o sile 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie granulki za pomocą 1 ml HBSS i odwirować jak powyżej. Odrzucić supernatanty. Zawiesić osad podwielokrotności barwienia pojedynczego w 200 μl HBSS. Zawiesić osad probówki B w HBSS (20 x 106 komórek/ml).
    9. Próbki należy przechowywać na lodzie i chronić przed światłem do czasu sortowania.
  2. Sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Przygotuj sterylne probówki do sortowania o pojemności 1,5 ml z 500 μl HBSS, w tym 2% FBS.
    2. Wybarwić komórki 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD) (0,15 μg/106 komórek) na lodzie przez 10 minut, aby wykluczyć martwe komórki.
    3. Posortuj SP serca przy użyciu następujących ustawień: wzbudzić Hoechsta za pomocą wzbudzenia 350 nm (UV), zebrać emisję fluorescencji za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 450/50 nm (Hoechst Blue) i filtra pasmowo-przepustowego 670/30 nm (czerwony Hoechst) i użyć dyszy o rozmiarze 100 μm i ciśnieniu 15 psi.
    4. Do analizy należy zarejestrować zdarzenia 5 x 105 dla próbek sortujących i 1 x 105 zdarzeń dla kontroli ujemnej, kontroli werapamilu i próbek jednobarwnych.
      UWAGA: SP serca wynosi około 0,5% - 2% (Rysunek 1H), ale może się różnić w zależności od laboratorium i izolatu. Frakcja Sca-1+/CD31- wynosi około 1% - 11% całkowitego SP serca (Rysunek 1I), ale może się różnić w zależności od laboratorium i izolatu. Sca-1+/CD31- SP-CPC są zapisywane jako SP-CPC dla następujących części protokołu.

5. Pierwotna kultura izolowanych SP-CPC

UWAGA: W tym protokole użyto trzech różnych typów mediów. Są one określane jako Medium 1 (według Noseda i wsp.)8, Medium 2 i Medium 3 i są opisane w Tabeli Materiałów dotyczące ich składu.

  1. Przed użyciem rozgrzać pożywkę w temperaturze od 1 do 37 °C i schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Odwirować probówki sortujące w temperaturze 4 °C i 470 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić komórki w pożywce 1.
  2. Umieść komórki na przepuszczalnym dla gazu naczyniu P60 z 4 ml pożywki 1. Zmieniaj podłoże co 3 dni, aż komórki osiągną 70% - 80% konfluencji.
    UWAGA: Krok 5.2 może zająć około 2-3 tygodni.

6. Ekspansja i zróżnicowanie SP-CPC

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodowla 3 x 105 SP-CPC w 8 ml pożywki 1 w kolbie T75.
    2. Inkubować SP-CPC w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do konfluencji 70% - 80%, zmieniając pożywkę co 2 - 3 d.
      UWAGA: Numer komórki należy zmodyfikować w zależności od typu użytych CPC, czasu podwojenia i rozmiaru komórki.
  2. Wzrost i żywotność SP-CPC przy różnych stężeniach w surowicy
    1. Hodowla SP-CPC przez 2 - 3 dni w kolbach T75 z 8 ml pożywki 1. Ostrożnie zassać pożywkę i delikatnie spłukać 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS.
    2. Potraktuj komórki 5 ml trypsyny-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym, dodaj 5 ml pożywki 1, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ponownie zawiesić komórki w pożywce 1 lub pożywce 2 (pożywka indukcyjna linii) i poszczepić 2,5 x 105 SP-CPC na szalkach P60 z 3 ml pożywki zawierającej różne stężenia w surowicy.
    5. Pobrać pożywkę z naczynia opisanego w kroku 6.2.4 w celu zebrania martwych komórek do probówki o pojemności 15 ml po 2 dniach hodowli w pożywce 1 lub pożywce 2.
    6. Trypsynizować przylegające komórki, jak w kroku 6.2.2, i zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml z kroku 6.2.5. Odwirować komórki przy 840 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać supernatant i dodać 1 ml pożywki 1 lub pożywki 2 w celu zliczenia komórek. Zabarwić SP-CPC błękitem trypanowym (0,4%) i policzyć komórki trypanowo-niebiesko-dodatnie (martwe) i trypanowo-ujemne (żywotne).
      UWAGA: Żywotność komórek (krok 6.2.7) jest podawana jako ujemna liczba komórek trypanowo-niebieskich w stosunku do całkowitej liczby komórek.
  3. Indukcja różnicowania śródbłonka
    1. Wstępnie pokryj (6-dołkową) płytkę hodowlaną 10 μg/ml lamininy (LN) lub fibronektyny (FN).
      1. Przygotować roztwór substratu zawierający 10 μg/ml LN lub FN z pożywką F12 (lub PBS). Dodaj 2 ml roztworu substratu do każdej studzienki. Utrzymywać płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Odessać roztwór z płytki i dodać 2 ml PBS do każdej studzienki, aż do jej użycia.
    2. Odessać pożywkę z komórek z kroku 6.1.2, delikatnie przepłukać je 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS, potraktować je 5 ml trypsyny-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym, dodać 5 ml pożywki 1 w celu zatrzymania aktywności trypsyny i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać pożywkę 2 do liczenia komórek.
    4. Wysiewaj 8 x 104 komórek na basenik na powlekanej płytce z 3 ml pożywki 2 i utrzymuj ją w temperaturze 37 °C przez 20 - 24 godziny. Zmień pożywkę na 3 ml pożywki 3,
      UWAGA: Zalecamy stosowanie pożywki o niskim stężeniu w surowicy - i bez suplementów - przez pierwsze 20 - 24 godziny. Zalecamy stosowanie <60% konfluencji komórek (tj. liczba komórek w kroku 6.3.4 musi być dostosowana w zależności od wielkości komórki i szybkości wzrostu).
    5. Hodować komórki przez 21 dni i zmieniać pożywkę co 3 dni.
    6. Sprawdź śródbłonkową naturę zróżnicowanych komórek, barwiąc je markerem śródbłonka, takim jak czynnik von Willebranda (vWF) i wykonując mikroskopię fluorescencyjną.
      1. Umyj komórki 1 ml PBS i utrwal komórki w 3,7% formaldehydzie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
      2. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X w ddH2O (lub PBS) przez 30 minut i zablokowanie go 10% kozimi surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      3. Inkubować komórki z przeciwciałem przeciwko czynnikowi von Willebranda (1:100) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C
      4. Umyj komórki 3x 1 ml PBS, za każdym razem przez 10 minut. Inkubuj je z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko królikowi Alexa Fluor 546 (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
      5. Umyj ponownie 3x, po 10 minut, 1 ml PBS. Wybarwić jądra komórkowe dichlorowodorkiem 4'6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI; 1:500) przez 5 minut w temperaturze RT w ciemności.
      6. Umyj komórki 3x, po 5 minut każda, 1 ml PBS. Zamontuj ogniwa i przechowuj je w temperaturze 4 °C
        UWAGA: Warunki hodowli (substrat, pożywka, odczynniki uzupełniające i stężenie FBS) w krokach 6.1 i 6.3 są opisane w Rysunek 3.
  4. Test tworzenia probówek
    1. Przygotować płytkę z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel, zwaną dalej matrycą).
      1. Rozmrozić matrycę w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. Pokryj 96-dołkową płytkę 100 μl matrycy na lodzie.
        UWAGA: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków w matrycy. Płytki muszą być pokryte lodem, aby uniknąć galaretki matrycy.
      3. Utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Odessać pożywkę z komórek (po zakończeniu kroku 6.3.5), delikatnie przepłukać komórki 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS i traktować je trypsyną-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym. Dodaj pożywkę 3, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, dodać 1 ml pożywki 3 i delikatnie pipetować.
    4. Przefiltrować komórki za pomocą sitka o wielkości 35 μm, jeśli komórki są zagregowane.
    5. Policz komórki i zasiew 2 x 103 do 4 x 103 komórek w 100 μl pożywki 3 w każdym basenie pokrytym matrycą. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 16 godzin.
    6. Zrób zdjęcie mikroskopem w jasnym polu przy 2-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: W przypadku niepełnej trypsynizacji należy wydłużyć czas ekspozycji na Trypsin-EDTA maksymalnie do 7 - 8 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja SP-CPC myszy:

W tym badaniu użyliśmy mysich CPC wyizolowanych zgodnie z fenotypem SP, podczas gdy wyniki z CPC u szczurów są modyfikowane i dodawane z poprzedniego raportu za zgodą (Rysunek 8)33.

Proliferacja komórek przy wysokich i niskich gęstościach komórek oraz przy różnych stężeniach w surowicy:

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalety tego Protokołu:

Protokół ten zapewnia technikę różnicowania śródbłonka CPC. Stwierdziliśmy, że niskie stężenie w surowicy i niska gęstość komórek mogą poprawić efektywność różnicowania śródbłonka, przy czym LN okazał się bardziej odpowiednim substratem niż FN w tych warunkach. Użyliśmy dwóch różnych typów CPC: CPC szczurów, które były używane w sposób podobny do linii komórkowej, oraz mysich SP-CPC, które zostały wyizolowane i namandowane. Warto zauważyć, że protokół miał zastosowanie do o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Verze Lorenz za jej pomocne wsparcie podczas eksperymentów oraz personelowi z Zakładu Cytometrii Przepływowej z Wydziału Biomedycyny (DBM), Uniwersytetu i Szpitala Uniwersyteckiego w Bazylei. Prace te były wspierane przez program Stay-on track Uniwersytetu w Bazylei (dla Michiki Mochizuki). Gabriela M. Kuster jest wspierana przez grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (numer grantu 310030_156953).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Culture Medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 SzynkaMerck#D8437
Penicylina-Streptomycyna (P/S)ThermoFisher#15140122
Bydło płodowe Surowica (FBS)Hyklon#SH300713,5% (0,1% do indukcji linii)
L-glutamina ThermoFisher#25030Stężenie końcowe 2 mM
GlutationMerck#G6013
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SuplementThermoFisher#17504044
Kardiotrofin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Szwajcaria#100-125
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0,05 % Trypsyna-EDTAThermoFisher#25300
T75 KolbaSarstedt#83.3911
Różnicowanie śródbłonka   
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronektyna Merck#F4759Rozcieńczyć w ddH2O
6 dołkówFalcon#353046
Roztwór formaldehyduMerck#F1635Diluite 1:10 w PBS (stężenie końcowe 3,7%)
Triton X-100Merck#934200,1% w ddH2O
Normalna surowica kozia (10%)ThermoFisher#50062Z
przeciwciało anty-von Willebranda FactorAbcam#ab69941:100 w 10% koziej surowicy
anty-króliczej IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 w 10% koziej surowicy
4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)ThermoFisher#622471:500 w ddH2O 
Zestaw przeciwblakowy SlowFadeMikroskop
BX63Olympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Probówka z okrągłym dnem i nasadką sitkaFalcon#352235
Matrigel Zmniejszonywspółczynnik wzrostuMikroskop#354230
IX50Olympus
Sca-1+/CD31- izolacja populacji po stronie serca34 
Reodczynniki
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.w aptece szpitalnej#9077862Roztwór roboczy: 200 mg/kg
buforowana fosforanami (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), czerwień fenolowa (-)ThermoFisher#14175Przygotuj HBSS 500 ml + 2% FBS  do gaszenia Aktywność kolagenazy B 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L D-glukozy, L-glutaminy, pirogronianuThermoFisher#331885Przygotuj DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S dla Hoechst Stanining
Penicylina-Streptomycyna  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Stężenie końcowe 25 mM
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Hyklon#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLRozcieńczyć do 1X w ddH2O i przefiltrować przez 0,2 &mikro; m filtr
Kolagenaza BMerck#11088807001Końcowe stężenie 1 mg/ml w HBSS, przefiltrowane przez 0,2 &mikro; m filter
bisBenzimide H33342 Trichlorowodorek (Hoechst)Merck#B2261Przygotować 1 mg/ml w ddH2O
Chlorowodorek werapamilu Merck#V4629Stężenie końcowe 83,3 &mikro; M 
APC Szczurzy anty-mysz CD31BD Biosciences#5512620,25 i mikro; g/107komórki
FITC Szczur Anty-Mysz Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050,6 &mikro; g/107komórki
7-aminoaktynomycyna D (7-ADD)ThermoFisher#A13100,15 &mikro; g/106komórki
APC szczur IgG2a k Kontrola izotypuBD Biosciences#5539320,25 i mikro; g/107komórki
FITC Rat IgG2a k Kontrola izotypuBD Biosciences#5546880,6 i mikro; g/107cells
Materiał
Needles 27GTerumo#NN-2719R
Igły 18GTerumo#NN-1838S
1 mL sterylneCODAN#62.1640
Pipeta transferowa 3,5 mlSarstedt#86.1171.001
Komórka Sitko 40 i mikro; m niebieskiBD Biosciences #352340
Sitko do komórek 100 &mikro; m żółtyBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dish P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
LineWiekHodowla
C57BL/6NRj / samiec12 tygodniw domu
Nazwa produktuFirma>Nr katalogowy
Reodczynniki
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)/mieszanka składników odżywczych F12 SzynkaMerck#D8437
Penicylina-Streptomycyna  (P/S)ThermoFisher#15140122
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Hyklon#SH30071
L-glutamina ThermoFisher#25030
GlutationMerck#G6013
Suplement B27ThermoFisher#17504044
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Kardiotrofina 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Szwajcaria #100-125
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Przegląd kompozycji pożywki. Niektóre z tych informacji są identyczne z tymi podanymi powyżej, ale posortowane według składu Mediów 1-3.
Nazwa produktuŚredni 18Średni 2Średni 3
OdczynnikiKulturaIndukcja liniiŚródbłonek diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 Szynka 65%65%
Penicylina-Streptomycyna  (P/S)1%1%
Płodowa surowica bydlęca (FBS)3.5%≤ 0,1%
L-glutamina 2 mM2 mM
Glutation0,2 nM0,2 nM
B27 Suplement1,3%
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)6,5 ng / ml
Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)13 ng / ml
Kardiotrofina 1 0,65 ng/ml
Trombina0,0005 U/mlWszystkie niezbędne elementy zawarte w zestawie
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EGM)-2 BulletKitWszystkie niezbędne elementy zawarte w zestawie
szerokokątny ThermoFisher#S2828 szerokokątny Corning Sól fizjologiczna Strzykawki jednorazowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Terapia kom rkowar nicowanie liniowepod o e lamininowetworzenie cewekmikroskopia fluorescencyjnag sto kom rektrawienie kolagenaz

Powiązane artykuły