Artykuł metodologiczny

Wykrywanie 3-nitrotyrozyny w środowisku atmosferycznym za pomocą wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej z detektorem elektrochemicznym

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58371

⸱

30 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Public Health, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences, 2Department of Pathophysiology-Periodontal Science, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę wykrywania chemicznych modyfikacji białek atmosferycznych 3-nitrotyrozyny za pomocą krążków o średnicy 6 mm wyciętych z filtrów wstępnych próbnika powietrza za pomocą wysokowydajnego detektora chromatografii cieczowej i elektrochemicznego (HPLC-ECD).

Streszczenie

3-nitrotyrozyna (3-NT) jest wytwarzana z reszty tyrozyny w białkach bioaerozolu atmosferycznego w reakcji z ozonem (O3) i dwutlenkiem azotu (NO2). Stabilny 3-NT jest specyficznym markerem uszkodzeń oksydacyjnych i mówi się, że ma działanie prowokujące w wywoływaniu alergii. W niniejszym badaniu informujemy o opracowaniu wysoce czułego testu do ilościowego oznaczania 3-NT w filtrach próbników powietrza w celu zebrania < 2,5 μm cząstek stałych (PM2,5) z powietrza miejskiego, w tym bioaerozolu. W tej metodzie z filtrów próbników powietrza wycięto okrągły otwór o średnicy 6 mm i zmieszano go z niespecyficznym koktajlem proteazy w celu hydrolizy białek. Próbki białek strawione do poziomu aminokwasów przebadano na obecność 3-NT za pomocą wysokosprawnego detektora elektrochemicznego do chromatografii cieczowej (HPLC-ECD). Maksymalną zawartość 3-NT wykryto w filtrze wstępnym dla cząstek stałych o rozmiarach od 4,5 do 7,3 μm, z granicą wykrywalności 1,13 pg/m3.

Wprowadzenie

Aerozol lub unoszący się w powietrzu PM zawiera białka różnego pochodzenia biologicznego, w tym wirusy, prokariota, grzyby, rośliny (pyłki) i zwierzęta (owady, ludzie)1. Stosunek zawartości białka w PM szacuje się na prawie 5%, co sugeruje, że odgrywa główną rolę jako alergen unoszący się w powietrzu2. Ostatnie doniesienia sugerują, że miejskie aerozole o różnych rozmiarach zawierają aminokwasy w proporcjach od 0,5% do 2%3. Ponadto zasugerowano, że chemiczne modyfikacje białek PM są generowane w reakcjach białek z różnymi zanieczyszczeniami, takimi jakO3, dwutlenek azotu (NO2) i dwutlenek siarki (SO2)4.

3-NT - modyfikacja białka - jest generowana przez nitrowanie reszt tyrozyny. Wykazano, że wyższe stężenieO3 i NO2 sprzyja nitrowaniu cząsteczek białka w przestrzeni pseudoatmosferycznej5,6. Nitrowanie reszt tyrozyny w łańcuchu polipeptydowym zwiększa potencjał alergiczny białek pyłku7. W związku z tym kwantyfikacja i ocena unoszącego się w powietrzu 3-NT jest ważnym aspektem w rozwiązywaniu problemów związanych ze zdrowiem środowiskowym.

3-NT jest również znany jako biomarker stresu oksydacyjnego i nitrozatywnego8. Pojawiający się materiał dowodowy wykazał znaczący związek zawartości 3-NT z kilkoma chorobami ludzkimi9,10. Ze względu na jego szkodliwe skutki, wykrycie i ilościowe oszacowanie 3-NT w próbce biologicznej ma ogromne znaczenie w określaniu stanu zdrowia danej osoby. W ostatnich latach wprowadzono różne metody szacowania zawartości 3-NT, w tym testy immunoenzymatyczne, HPLC i LC/MS11. W poprzednich badaniach opisaliśmy metodę wykrywania wykorzystującą technikę HPLC-ECD, która przyniosła kilka korzyści w porównaniu z poprzednimi metodami. Na przykład HPLC-ECD nie wymaga procedury ekstrakcji ani derywatyzacji, co czyni go stosunkowo prostym systemem testowym12. Potwierdziliśmy, że ta metoda ma zastosowanie do wykrywania 3-NT w próbkach biologicznych (osocze od człowieka i szczura).

Chociaż wiele badań kładło nacisk na wykrywanie 3-NT w próbkach biologicznych, jego wykrycie w próbkach niebiologicznych pozostaje nieuchwytne, dlatego też kontynuowano niniejsze badanie. W rzeczywistości, aby ocenić szkodliwy wpływ unoszącego się w powietrzu 3-NT, wymagana jest metoda ilościowa, która jest przydatna do wykrywania 3-NT bezpośrednio z cząstek unoszących się w powietrzu; w związku z tym zastosowaliśmy istniejącą metodę HPLC-ECD do wykrywania 3-NT z PM2,5 zebranego na filtrze z włókna szklanego. Dzięki zastosowaniu tej techniki 3-NT można było wykryć bezpośrednio z małych kawałków (okrągłe otwory o średnicy 6 mm) próbki z filtra zbierającego PM. Następnie oceniliśmy zawartość 3-NT dla różnych wielkości cząstek stałych i zmierzyliśmy granicę wykrywalności 3-NT. W niniejszym artykule zaproponowano wysoce czułą i wysokoprzepustową metodę wykrywania 3-NT bezpośrednio zarówno w próbkach niebiologicznych, jak i biologicznych.

Protokół

1. Zbiór całkowitych zawieszonych cząstek, PM2.5 lub PM7, oraz metoda hydrolizy białek PM

  1. Zbierz PM z filtra wstępnego lub filtru zapasowego.
    1. Przed zebraniem całkowitej ilości zawieszonych cząstek (TSP), PM2,5 i PM7 należy zważyć filtr kwarcowy.
      Uwaga: Biorąc pod uwagę, że zanieczyszczenie białkami i peptydami PM nie powinno wpływać na wykrywanie nitrowania tyrozyny (ponieważ nie mają one takiej grupy nitrowej), przed pomiarem nie traktowaliśmy filtra kwarcowego w wysokiej temperaturze. Dodatkowo zawartość 3-NT w filtrze kwarcowym była poniżej granicy wykrywalności, określonej przez HPLC-ECD.
    2. Ustaw filtr kwarcowy na próbniku powietrza o dużej objętości z selektorem wielkości cząstek, aby zbierać PM7 z natężeniem przepływu 1,000 l/min w sposób ciągły przez 7 dni (Rysunek 1B). TSP można zbierać na filtrze kwarcowym bez selektora rozmiaru (Rysunek 1A).
    3. Zbieranie PM2,5 za pomocą próbnika powietrza o małej objętości z jednostką klasyfikacji wielkości przy natężeniu przepływu 116 l/min w sposób ciągły przez 7 dni. Za pomocą tego urządzenia cząstki można sklasyfikować jako PM4,5-2,5, PM7,3-4,5, PM15-7,3 i TSP-PM15 i zebrać na filtrach kwarcowych w celu klasyfikacji. PM2.5 może być zbierany na filtrze zapasowym (Rysunek 1C).
    4. Zapisać całkowitą objętość przepływu w momencie zbierania filtra. Zmierz masę TSP, PM2.5 i PM7 na filtrach, odejmując wagę przed pobraniem od masy po pobraniu. Zamknąć filtr w plastikowej torbie i przechowywać go w temperaturze -30 °C do następnego kroku (patrz rozdział 2).
  2. Proteoliza próbek.
    1. Rozpuścić niespecyficzny koktajl proteazy w 0,1 M buforze octanowym (pH 7,4). Umieścić roztwór w membranie dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej = 5 000 Da) i zanurzyć go w 1 l 0,1 M buforu octanowego z mieszaniem w temperaturze 4 °C. Wymienić bufor 2 razy co 12 godzin, a następnie przeprowadzić dializę przez noc w celu usunięcia endogennego 3-NT i azotynów (NO2-). Po dializie zebrać roztwór i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA).
    2. Wybij okrągłe koła o średnicy 6 mm z filtra wstępnego lub filtra zapasowego i włóż je do mikroprobówek. Do analizy można użyć do pięciu kawałków o frakcjach 6 mm (Rysunek 2).
    3. Dodać 300 μl 0,1 M buforu octanowego zawierającego 50 μg białka z nieswoistego koktajlu proteazy (przygotowanego w kroku 1.2.1) do probówki w celu hydrolizy białek PM w temperaturze 50 °C przez 16 godzin z rotacją.
      Uwaga: Aby odjąć endogenny 3-NT od niespecyficznego roztworu koktajlu proteazy, konieczne jest przygotowanie i strawienie próbki zawierającej tylko niespecyficzny koktajl proteazy.
    4. Przepłukać membranę ultrafiltracyjną wraz z dołączoną rurką, dodając 0,1 M bufor octanowy i odwirowując (10 000 x g przez 30 sekund; dokładna prędkość zależy od membrany), ze względu na zanieczyszczenie substancji chemicznych podobnych do 3-NT w membranie. Powtórz płukanie 1x.
    5. Po proteolizie odwirować próbki o masie 2 500 x g przez 10 minut. Załadować supernatant do membrany ultrafiltracyjnej i odwirować go przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C dla ultrafiltracji (MWCO = 10 000), aż do zebrania wystarczającej objętości elucji. Przechowywać eluaty w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: Ze względu na wykrycie piku podobnego do 3-NT w kolumnie wirowej, przed użyciem należy ją dobrze umyć czystą wodą lub buforem, takim jak woda HPLC i bufor octanowy 0,1 M.

2. Oznaczanie zawartości 3-NT w TSP, PM2.5 i PM7 za pomocą systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej i detekcji elektrochemicznej (HPLC-ECD)

Uwaga: Zobacz Rysunek 3.

  1. Przygotuj fazę mobilną.
    1. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (pH 2,5) zawierający 50 mg/l EDTA. Odmierzyć 98 objętości buforu i dwie objętości acetonitrylu (klasa HPLC), przelać je do czystej szklanej butelki i energicznie wymieszać nakrętką.
    2. Osadzaj fazę ruchomą w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, aż rozpuszczone powietrze stanie się płaskie.
      Uwaga: Jeśli system zostanie uruchomiony wcześniej, faza ruchoma może zostać poddana sonikacji i odgazowaniu w próżni. Jednak nadmierne odgazowanie zmieni stosunek między wodą a fazą organiczną poprzez parowanie.
  2. System HPLC-ECD składa się z pompy, kolumny HPLC, odgazowywacza, ECD i wtryskiwacza. Zrównoważ fazę ruchomą i ustabilizuj system, aby zredukować tło i szumy.
    1. Zainstaluj fazę ruchomą i kolumnę HPLC w systemie HPLC. Włączyć pompę HPLC i ustabilizować kolumnę fazą ruchomą przy natężeniu przepływu 500 μL/min przy temperaturze kolumny 25 °C z dnia poprzedzającego dzień rozpoczęcia.
    2. Następnego dnia należy zapalić ECD i ustawić parametry (napięcie redukcji na poziomie -900 mV i napięcie wzbudzenia na poziomie 400 mV). Ustabilizuj go przez co najmniej 3 godziny.
  3. Zmierz stężenie 3-NT w PM7.
    1. Przygotować różne stężenia wzorców 3-NT (5 - 500 nM) i ślepą próbę (bez wzorca 3-NT i niespecyficznego koktajlu proteazy, aby upewnić się, że ani fiolka, ani bufor nie są zanieczyszczone) w 0,1 M buforze octanowym.
    2. Uruchom procesor danych HPLC.
    3. Umieścić fiolki z próbkami w automatycznym wstrzykiwaczu i ustawić objętość wstrzykniętego wstrzykiwania na 25 μl. Działać w tych samych warunkach fazy ruchomej i natężenia przepływu, jak wspomniano w kroku 2.2.1.
      Uwaga: Jeśli przygotowanie próbki jest zakończone, powinny być próbki, próbka wzorcowa (5 - 500 nM), próbka zawierająca tylko niespecyficzny koktajl proteazy oraz ślepa fiolka.
    4. Upewnij się, że linia podstawowa na chromatogramie jest płaska i rozpocznij wstrzykiwanie próbki.
      Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, 3-NT jest wykrywany w ciągu 20 - 21 minut; Zaleca się jednak około 30 minut jako czas pracy na wstrzyknięcie próbki. W przeciwnym razie szczyty zanieczyszczeń zostaną uwzględnione w następnym przebiegu.

3. Analiza chromatogramów i kwantyfikacja zawartości 3-NT w PM7

  1. Sprawdź pik 3-NT na chromatogramach i oblicz zawartość.
    1. Po zebraniu danych otwórz plik z danymi chromatogramu za pomocą oprogramowania analitycznego.
    2. Narysuj linię w poprzek piku 3-NT od płaskiej linii podstawowej i odczytaj wysokość piku od narysowanej linii.
      Uwaga: Limit ilościowy wynosi około 5 nM (125 fmol w wstrzyknięciu 25 μl).
      UWAGA: Elektroda w ECD powoli się wyczerpuje, a limit będzie wysoki ze względu na stosunek sygnału do szumu.
    3. Przygotuj linię regresji od standardowych szczytów 3-NT, oblicz nachylenie i przecięcie.
    4. Przypisz te stałe do poniższego równania i oblicz zawartość 3-NT w próbkach w następujący sposób.
      Próbka 3 – NT (nM) = [pik próbki – punkt przecięcia] / równanie nachylenia (1)
      Uwaga: Krzywa standardowa powinna być dobrze odwzorowana jako linia prosta między 5 nM a 500 nM.
  2. Obliczyć 3-NT w środowisku powietrznym i PM7 z fiolki z próbką.
    1. Pomnóż stężenie 3-NT przez objętość reakcji (i współczynnik rozcieńczenia, jeśli występuje) i oceń bezwzględną zawartość 3-NT w PM7 z okręgu.
    2. Zmierz zebraną powierzchnię filtra i oblicz zawartość 3-NT w całkowitym filtrze PM7 za pomocą następującego równania.
      Całkowity PM7 = [zawartość 3-NT w PM7 koła] x [stosunek powierzchni filtra PM7 do powierzchni okręgu] x 226,19 (w przypadku przeliczania moli na gramy) Równanie (2)
    3. Oceń zawartość 3-NT w środowisku powietrznym lub PM7, dzieląc całkowitą zawartość PM7 przez całkowitą objętość przepływu powietrza lub masę PM7 (zapisaną w kroku 1.1.3).

Wyniki

Zasada działania metody HPLC-ECD jest prosta. Próbki zawierające analizat są rozdzielane przez kolumnę HPLC i fazę ruchomą, a rozdzielony związek docelowy ulega redukcji i/lub utlenieniu w detektorze elektrochemicznym.

W systemie HPLC-ECD piki 3-NT są wykrywane w około 22 minucie. Detektory ECD (PEC-510 oraz HTEC-500) są połączone szeregowo w linii HPLC. Pierwszy detektor ECD redukuje grupy hydroksylowe w związkach, a kolejny utlenia zredukowane substancje chemiczne. Detektory ECD charakteryzują się wysoką czułością w zakresie 10-15 M. Granica wykrywalności systemu HPLC-ECD wyniosła 1,13 pg/m3, co obliczono jako średni sygnał podstawowy (mV) dla 10 części x 3.

Reprezentatywne chromatogramy przedstawiono na Rysunku 4. Poprzez analizę czystego standardu 3-NT można wykryć wyraźny pik ze stabilną linią bazową (Rysunek 4A). Poziom 3-NT w PM7 zmierzono również przy użyciu okrągłych próbek o średnicy 6 mm (Rysunek 4B).

W odniesieniu do dokładności możliwości wykrywania 3-NT, po wstrzyknięciu standardu 3-NT do układu HPLC, pik odpowiadający 3-NT wykryto w czasie retencji 20 minut. W próbkach PM 3-NT został oddzielony od innych substancji, a niezależny pik wykryto w tym samym czasie retencji co dla standardu. Typowa krzywa wzorcowa przedstawiona jest na Rysunku 5, gdzie zaobserwowano liniowość w zakresie od 5 do 40 nM. Liniowość można zaobserwować aż do 500 nM (dane nie zostały przedstawione).

Tabela 1 przedstawia zawartość 3-NT w atmosferze, obliczoną jako pg/m3 powietrza. Najwyższe stężenie 3-NT w przedfiltrze PM2.5 zaobserwowano w próbce nr 3 (PM7.3-4.5).

Schemat filtrów do poboru próbek powietrza: filtr zbiorczy (TSP), selektor wielkości, przefiltr i filtry zapasowe.
Rycina 1: Schemat pobierania próbek TSP, PM7 i PM2.5. (A) Całkowite zawieszone cząstki (TSP) są zbierane bezpośrednio na filtr zbiorczy (przy natężeniu przepływu 1,000 L/min). (B) Podczas pobierania PM7 duże cząstki są odrzucane przez selektor wielkości (przy natężeniu przepływu 1,000 L/min). (C) PM2.5 jest zbierany przez cztery przefiltry (przy natężeniu przepływu 116 L/min). Filtr kwarcowy jest powszechnie stosowany jako filtr zapasowy dla PM7 i PM2.5 lub jako filtr zbiorczy dla TSP, jak pokazano na tej rycinie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przenoszenia próbek do spektroskopii, analiza spektroskopowa, proces pomiaru absorpcji.
Rycina 2: Przygotowanie okrągłego wycinka o średnicy 6 mm. Filtr kolekcjonujący wycięto za pomocą wycinaka rurkowego o średnicy 6 mm. Następnie próbkę przechowywano w mikroprobowce o pojemności 1,5 mL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat systemu HPLC; układ chromatograficzny; utlenianie-redukcja; analiza danych; proces pompowania kolumny.
Rycina 3: Schemat blokowy systemu HPLC-ECD. 3-NT w wstrzykniętej próbce został rozdzielony w kolumnie HPLC, przez którą przepływa faza ruchoma. 3-NT został zredukowany do aminotyrozyny, utleniony do iminotyrozyny i wykryty elektrochemicznie w detektorze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny, analiza piku, czas retencji (min), diagram, porównanie wydajności rozdziału.
Rycina 4: Typowe chromatogramy w systemie HPLC-ECD. (A) Czysty 3-NT analizowany za pomocą systemu HPLC-ECD. (B) Próbka z koła o średnicy 6 mm z filtra PM7 użyta do wykrycia 3-NT. Pik 3-NT został wskazany strzałką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krzywa kalibracyjna, wysokość piku w funkcji standardu 3-NT, nM, z regresją liniową, R²=0,9946, wykres.
Rysunek 5: Krzywa wzorcowa dla czystych próbek 3-NT. Wyniki dla niższego stężenia przedstawiono na innym wykresie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

TematLiczba dni
Kolekcja		Plamka3-NT
(pg/m3 powietrze)
PM2,5Filtr wstępny nr 12748.25 ± 0.37
Wstępny filtr nr 227429.66 ± 1.94
Przefiltrowanie wstępne nr 327474.37 ± 4.09
Prefiltr nr 427432.70 ± 0.75
Filtracja wsteczna754.21 ± 0.91
PM7Filtracja wsteczna7189.16 ± 6.36
TSPFiltr7110.34 ± 2.09

Tabela 1: Poziom 3-NT w atmosferze zmierzony za pomocą systemu HPLC-ECD. Pomiaru okrągłych plamek o średnicy 6 mm z każdego filtra wykonano za pomocą systemu HPLC-ECD. Prefiltry #1 - #4 zostały zebrane w tym samym okresie. Należy zauważyć, że na stężenia 3-NT w powietrzu wpływają różne czynniki, takie jak data, rok lub miejsce pobrania próbek. Dane (n = 3 - 10) przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy.

Dyskusja

W artykule opisano metodę kwantyfikacji do oceny 3-NT w unoszących się w powietrzu cząstkach stałych zebranych na filtrach kwarcowych przy użyciu wysoce czułych technik HPLC-ECD.

Ogólnie rzecz biorąc, metody pomiaru 3-NT zostały opracowane jako biomarkery stresu oksydacyjnego w chorobach człowieka. Metody oparte na przeciwciałach (np. test immunoenzymatyczny z użyciem immunoenzymu) są uważane za półilościowe, ponieważ nie ma ścisłej walidacji testu i trudno jest ocenić wiarygodność testu. HPLC z detekcją elektrochemiczną (ECD) i testy oparte na spektrometrii mas mają odpowiednią czułość do oznaczania ilościowego 3-NT13. Chociaż są one czułe, metody oparte na spektrometrii mas, takie jak GC-MS lub GC-MS/MS wymagają derywatyzacji aminokwasów, a proces derywatyzacji często prowadzi do powstawania artefaktów14.

W porównaniu zarówno z technikami GC, jak i LC, HPLC-ECD jest stosunkowo tańsza i ma wystarczającą czułość do pomiaru 3-NT. Dodatkowo, etap derywatyzacji w GC-MS i LC-MS często wymaga dodatkowego czasu. Chociaż przedstawiona tutaj metoda wymaga 16 godzin na etap trawienia białka, to jednak można ją przeprowadzić w nocy (jak opisano powyżej, Na próbkę wymagane jest około 30 minut pracy praktycznej). Automatyczne powtarzanie pomiaru przy użyciu automatycznego podajnika próbek może zapewnić system pomiarowy o wysokiej przepustowości. Wcześniejsze badania opisywały metody immunologiczne do pomiaru 3-NT w PM 2,7; jednak takie metody nie były w stanie wykryć 3-NT w sezonie zimowym ze względu na niskie poziomy 3-NT w PM15.

Metoda HPLC-ECD ma dodatkowe zalety w porównaniu z innymi metodami standardowymi; Na przykład (i) w tej metodzie nie jest wymagany proces ekstrakcji, (ii) jest ona całkowicie wolna od detergentów, (iii) wymaga minimalnej próbki i, co ważne, (iv) ma wysoką czułość. Cząstki, które są zbierane na filtrach, są często oddzielane za pomocą sonikacji w celu dalszych badań, w tym kwantyfikacji różnych składników. Detergenty są również używane do izolowania białek związanych z cząstkami stałymi z filtrów. Jednak te dodatkowe kroki zwiększają ryzyko zanieczyszczenia, utraty próbki i niedoszacowania ze względu na wydajność ekstrakcji, a ponadto większość detergentów jest niekompatybilna z LC/MS. W obecnej metodzie HPLC-ECD próbki HPLC można łatwo oddzielić od filtra za pomocą prostego dziurkacza i bez konieczności dodatkowego procesu przygotowania próbki. Powierzchnia okrągłej próbki wynosi 28,3 mm2, co jest bardzo małe w porównaniu z rozmiarem oryginalnego filtra kwarcowego (8 x 10 cali = 203,2 x 254 mm = 51 600 mm2).

Warunek HPLC-ECD został dokładnie sprawdzony w celu uniknięcia zakłóceń sygnału 3-NT, jak opisano wcześniej12. Silne kwaśne pH fazy ruchomej i odpowiednie stężenie acetonitrylu są ważne dla wykrywania. Korzystając z tych warunków, inne związki, w tym zasada nitrowa, mogą być oddzielone od nitrotyrozyny. Obecne warunki są odpowiednie do wykrywania 3-NT w próbkach o różnych właściwościach fizycznych (np. cząstki stałe i osocze).

Aby ocenić 3-NT w powietrzu, krytycznymi krokami są pomiar masy filtra i eliminacja tła. Ogólnie rzecz biorąc, ponad 100 mg PM7 jest zbierane w okresie od czterech do siedmiu dni; jednak na wagę filtra przed i po zebraniu PM7 wpływa kilka czynników, w tym wilgotność i statyczny ładunek elektryczny. Aby uniknąć tych efektów, konieczna jest stabilizacja masy filtra przez długi czas przy nierównej temperaturze i wilgotności. Miejsce, w którym zainstalowana jest waga elektroniczna, powinno być utrzymywane w stabilnym środowisku. W celu przygotowania próbki ważne jest, aby skorygować efekty tła z niespecyficznego koktajlu proteazy i membrany ultrafiltracyjnej, które często wykazują podobny pik do 3-NT.

Metodę tę można zastosować do innych cząstek, w tym tych znajdujących się w pomieszczeniach. Nitracja białek może zwiększać ich potencjał alergizujący2. Dlatego metoda ta może pomóc w ocenie czystości środowiska i zapobieganiu stresowi nitrozacyjnemu.

W tym badaniu przedstawiamy bardzo czułą metodę pomiaru atmosferycznych filtrów próbnika powietrza 3-NT za pomocą łatwej w obsłudze i niedrogiej aparatury. Wytwarzanie 3-NT w atmosferze jest związane z zanieczyszczeniami środowiska, takimi jakO3, NO2, białka PM i elementy meteorologiczne, które wpływają na alergię u ludzi. Podsumowując, metoda opracowana w niniejszym badaniu może pomóc w ocenie reakcji atmosferycznejO3, różnych zanieczyszczeń i białek PM w różnych warunkach meteorologicznych. Dzięki tym wysiłkom zmierzającym do opracowania HPLC-ECD do oszacowania 3-nitrotyrozyny w atmosferze, przewidujemy lepszą czystość środowiska, poprawiając zdrowie ludzi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Masayuki Kubo z Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska za pomoc w pobraniu próbek TSP/PM2.5. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Number JP16K15373 i JP18H03039.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr kwarcowy, zapasowy filtr kwarcowyPALL life sciences7204Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
Próbnik powietrza o dużej objętościSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYHV-1000F
Selektor wielkości cząstek dla SPMSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY080130-061SPM (zawieszone cząstki stałe) są definiowane w Japonii jako cząstki o średnicy 10 μm i 100% średnicy odcięcia. SPM jest prawie identyczny z PM7.
Próbnik powietrza o małej objętościSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYAH-600F
Jednostka klasyfikacji rozmiarów dla PM2.5SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYAH-600
Filtry kwarcowe do klasyfikacji (PM4.5– 2,5, PM7,3– 4,5, PM15– 7.3 i TSP-PM15)Tokyo DylecAHQ-630
Niespecyficzny koktajl proteazyRoche11459643001Pronase ze Streptomyces griseus 
3-NitrotyrozynaSIGMAN7389
Membrany ultrafiltracyjneMilliporeUFC5010BKAMICON ULTRA 0,5 mL - 10kDa odcięcie
ECDEicomHTEC-500, PEC-510samodzielna jednostka HPLC-ECD (HTEC-510) i komórka do elektrolizy wstępnej (PEC-510), zawiera
pompę kolumnę HPLCEicomSC-5ODS
Procesor danychEicomEPC-300
WtryskiwaczHitachi High-Tech Science L-7200Automatyczny próbnik
Oprogramowanie analityczneeDAQ JapanES280 Oprogramowanie PowerChrom

Bibliografia

  1. Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
  2. Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
  3. Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
  4. D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
  5. Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
  6. Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
  7. Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
  8. Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. , Humana Press. 149-158 (2014).
  9. Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282(2015).
  10. Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
  11. Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
  12. Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
  13. Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
  14. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
  15. Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie 3 nitrotyrozynysystem HPLC ECDfiltry do pr bek powietrzakoktajl proteazpobieranie PM25hydroliza bia ekdetekcja elektrochemicznaanaliza rodowiskowamarker uszkodze oksydacyjnychbia ka bioaerozoli

Powiązane artykuły