Indywidualne hodowle widłonogów Tigriopus i analiza ilościowa ich zachowań związanych z ochroną partnerów

Satomi Tsuboko-Ishii; Ronald S. Burton

doi:10.3791/58378

Artykuł metodologiczny

Indywidualne hodowle widłonogów Tigriopus i analiza ilościowa ich zachowań związanych z ochroną partnerów

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58378

⸱

26 września 2018

Satomi Tsuboko-Ishii¹ , Ronald S. Burton¹

¹Marine Biology Research Division, Scripps Institution of Oceanography, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Zachowanie związane z ochroną partnera odgrywa ważną rolę w rozmnażaniu widłonogów z rodzaju Tigriopus. Jednak metody badania tego zachowania nie zostały dobrze opisane. Poniżej opisujemy metody: 1) indywidualnej hodowli dziewiczych zwierząt Tigriopus oraz 2) ilościowej analizy ich zachowań związanych z ochroną partnerów.

Streszczenie

Widłonogi z rodzaju Tigriopus, które są pospolitym zooplanktonem w skalistych basenach przypływowych, wykazują zachowanie prekopulacyjne, w którym samiec chwyta potencjalną partnerkę, tworząc parę. Zjawisko to wzbudziło zainteresowanie badaczy, jednak metody jego analizy nie zostały dobrze opisane. Poniżej opisujemy procedury dotyczące: 1) indywidualnej hodowli i inscenizacji młodych i dorosłych osobników Tigriopus oraz 2) analizy wideo ich zachowań związanych z ochroną partnera. Metoda hodowli umożliwia eksperymentalną kontrolę doświadczeń związanych z parowaniem zwierząt, a także możliwość śledzenia ich rozwoju przed testami behawioralnymi. Metoda analizy pozwala na ilościową ocenę kilku aspektów zachowań związanych z ochroną partnerów, w tym prób schwytania przez samce i trajektorii pływania par strzegących partnera. Chociaż metody te zostały pierwotnie opracowane dla badań etologicznych nad Tigriopusem, przy odpowiednich modyfikacjach można je również zastosować do badań innego zooplanktonu w różnych dziedzinach badawczych, takich jak fizjologia, toksykologia i genetyka ekologiczna.

Wprowadzenie

Widłonogi międzypływowe z rodzaju Tigriopus są szeroko rozpowszechnione w skalistych wysokich basenach międzypływowych na kilku kontynentach¹. Te widłonogi wykazują zachowanie chroniące partnera w ramach ich rozmnażania, w którym dorosły samiec chwyta potencjalną partnerkę (młodocianą lub dorosłą) za pomocą swoich haczykowatych pierwszych czułków przed kopulacją (Rysunek 1 i Rysunek 2)²^,³^,⁴^,⁵. Chociaż zjawisko to jest przedmiotem badań etologicznych i biochemicznych od dziesięcioleci²^,³^,⁶^,⁷, szczegółowe procedury badań nad tym zachowaniem, w tym indywidualna hodowla dziewiczych zwierząt i kryteria zdarzeń behawioralnych obserwowanych podczas próby ochrony partnera, nie zostały dobrze opisane. W ten sposób ustalamy tutaj metody umożliwiające badanie zachowania w kontrolowanym środowisku eksperymentalnym.

Indywidualna hodowla i inscenizacja zwierząt

Poprzednie badania nad rozmnażaniem Tigriopus tradycyjnie stosowały metodę rozdzielania par do przygotowania młodocianych (copepodids) i dorosłych samic do testów behawioralnych i eksperymentów hodowlanych³^,⁸^,⁹^,¹⁰. Jednak ta metoda pozwala zwierzętom łączyć się w pary i potencjalnie kopulować przed testami (omówionymi w Ito 1988¹¹), co może zmienić właściwości behawioralne zwierząt⁵. Ponadto istnieje również możliwość błędnej oceny etapów rozwojowych widłonogów w przypadku konwencjonalnych protokołów, ponieważ opierają się one na pozornej wielkości ciała do oceny stopnia. W tym artykule opisujemy indywidualną metodę hodowli zastosowaną w naszym niedawnym badaniu z udziałem Tigriopus californicus⁵, która została zaprojektowana w celu wyeliminowania tych ograniczeń poprzez kontrolowanie doświadczeń zwierząt w parowaniu i śledzenie ich rozwoju od widłołapu do stadium dorosłego.

Ilościowa analiza zachowań związanych z ochroną partnera

Zachowanie gatunku Tigriopus w zakresie ochrony partnera zostało zbadane nie tylko w dziedzinie etologii²^,⁶, ale także w innych dziedzinach, takich jak ekotoksykologia i genetyka ewolucyjna³^,⁴^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Jednak wcześniejsze badania wyjaśniały przebieg tego zachowania głównie w formie pisemnej bez wystarczających ilustracji wizualnych, aby nakreślić zarówno zachowanie, jak i metody jego badania, co stwarza techniczne przeszkody dla replikacji i postępu badań. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe opisy niektórych z kluczowych wydarzeń w zachowaniu kopulacyjnym widłonogów Tigriopus, poparte materiałami wizualnymi. Demonstrujemy również sprzęt i metody do ilościowej analizy zachowania. Metody te pozwalają na ocenę właściwości behawioralnych zwierząt podczas prób ochrony partnera w precyzyjnie odtworzonych eksperymentach.

Za pomocą tych metod staramy się zapewnić metodologiczną podstawę kontrolowanych i powtarzalnych badań nad zachowaniem rodzaju Tigriopus w zakresie ochrony partnerów.

Protokół

1. Przygotowanie dziewiczych zwierząt do obserwacji behawioralnych

Pozyskać zapłodnione jaja i pozwolić im się wykluć.
1. Zbierz ciążne samice noszące wyraźnie pomarańczowetj. zapłodnione i będące w zaawansowanych stadiach rozwoju jaja (Rycina 3C) z kultury macierzystej za pomocą pipety Pasteura. Przepłucz samice, delikatnie przenosząc je pipetą do czystego medium hodowlanego, aby uniknąć przeniesienia innych osobników, w tym larw naupliusów, które mogły wykluć się w kulturze.
  Uwaga: W niniejszym protokole jako pożywka hodowlana stosowana jest sztuczna woda morska o zasoleniu 35%. Należy użyć innej pożywki (np. sztuczną wodą morską o wyższym zasoleniu lub z dodatkowym rozpuszczalnikiem) w zależności od celu eksperymentu.
  Uwaga: Zob. Barreto i wsp. 2015¹² metody zakładania laboratoryjnych kolekcji kultur i Pereira i wsp. 2016¹³ przykłady miejsc poboru próbek naturalnych populacji T. californicus. Peterson i wsp. zgłosili również miejsca poboru próbek z T. californicus, T. fulvusi T. japonicus z informacjami o szerokości i długości geograficznej⁹Do pobierania należy użyć plastikowych pipet o pojemności około 30–50 ml. Tigriopus wioślarki z jeziorek skalnych.
2. Umieść każdą samicę pojedynczo w dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej z czystym medium hodowlanym (Rycina 4, po lewej). Należy upewnić się, że w dołku nie znajduje się żadne inne zwierzę (w tym larwa nauplius).
3. Przechowywać płytki w inkubatorze ustawionym na 20°C °C z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność, aby hodować samice do momentu wydalenia woreczków jajowych. Etap ten trwa zazwyczaj od jednego do dziesięciu dni, w zależności od gatunku i stadiów rozwojowych embrionów. W międzyczasie każdą ciążną samicę należy karmić dwa razy w tygodniu dwoma ziarnami drobno zmielonego (około < pokarm dla ryb o średnicy 0,5 mm (patrz Tabela materiałów po szczegóły).
  Uwaga: W zależności od celu eksperymentu należy stosować różne temperatury i cykle świetlne. Wyższe temperatury mogą przyspieszyć rozwój embrionów.
  Uwaga: Należy unikać pozostawiania nadmiaru rozkładającej się pożywki w dołkach. Jeśli resztki pożywki zaczną się rozkładać, należy je usunąć z dołków za pomocą pipety Pasteura.
4. Po uwolnieniu woreczków z jajami należy usunąć samice z dołków hodowlanych za pomocą pipety Pasteura.
  Uwaga: Zapłodnione samice są zdolne do składania wielu miotów potomstwa²^,³W razie potrzeby przenieść samice do innych dołków w celu zebrania kolejnych zniesień.
Należy zebrać copepodidy do hodowli indywidualnej.
1. Przechowywać płytki z wylęgnymi naupliusami w inkubatorze i hodować naupliusy do momentu, aż osiągną pierwsze stadium kopepoditu (CI) (Rysunek 4, środek). Ten etap trwa zazwyczaj od jednego do dwóch tygodni. Każdej studni należy podawać po kilka ziaren drobno zmielonej karmy dla ryb, kontrolując co dwa dni obecność zwierząt w stadium CI. Odparowaną wodę hodowlaną należy uzupełniać wodą destylowaną.
  Uwaga: Jeśli unoszące się zanieczyszczenia utrudniają widoczność, należy je usunąć za pomocą małego kawałka ręcznika papierowego.
2. Gdy tylko zaczną pojawiać się zwierzęta CI, należy zebrać je z dołków za pomocą mikropipety P-10 z objętością pipietowania ustawioną na około 8 µL, pod stereomikroskopem przy powiększeniu od 10X do 40X (Rycina 4, prawą stronę). Każde zwierzę CI należy wypłukać, delikatnie pipetując je w czystej sztucznej wodzie morskiej, a następnie umieścić w dołku 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej 2-3 mm głębokości (około 400-600 µL) sztucznej wody morskiej.
  Uwaga: Należy unikać przenoszenia wylinek naupliusów lub innych zwierząt do dołków przeznaczonych do hodowli indywidualnej.
Monitoruj rozwój osobników, licząc zrzucone wyglinki.
1. Co dwa do trzech dni (zmienić częstotliwość w razie potrzeby) należy sprawdzać wnętrze każdej dołki pod kątem obecności zrzuconych poczwerek (exuviae), stosując obserwację stereomikroskopową w oświetleniu ciemnym polu przy powiększeniu od 10x do 40x. Poczwěrki kopepoditów są przezroczyste i rozpoznawalne po szczeciniastych odnóżach oraz parze ramion kaudalnych (t. j. cienkie wystające struktury na końcu kaudalnym) i/lub segmentacja prosomu i urosomu (Rysunek 5). Zmień ogniskową oraz oświetlenie, aby wykryć wylinionki na różnych głębokościach w studzience (Rycina 6A).
  Uwaga: Wylinkowane egzuwie są mniejsze od zwierzęcia, które je zrzuciło. Badanie zwierzęcia i jego stosunkowo niedawnych egzuwii należy rozpocząć od małych powiększeń, a następnie przejść do większych powiększeń w przypadku starszych (t. j. (mniejsze) wylinionki.
  Uwaga: Jeśli w dołku znajdują się uszkodzone wyglinki, należy wyeliminować ten dołek z dalszego monitorowania rozwoju, aby uniknąć błędnej oceny stadiów rozwojowych.
  Uwaga: Jeśli widoczność jest ograniczona przez pływające zanieczyszczenia (Rycina 6B), a następnie zebrać nadmiar cieczy za pomocą małego kawałka ręcznika papierowego.
2. Zapisz całkowitą liczbę wylinek kopepodid w każdej studni, nanosząc kreski na pokrywkę płytki (Rysunek 7). Nanieś kreskę do oznaczeń w momencie znalezienia nowej wylinki w dołku.
  Uwaga: Jeśli w studzience znajdują się zanieczyszczenia w postaci wylinek naupliusów, należy je pominąć w obliczeniach.
3. Podawać każdemu osobnikowi po dwa ziarna drobno zmielonej karmy dla ryb. Uzupełniać odparowaną wodę hodowlaną wodą destylowaną w celu utrzymania zasolenia.
  Uwaga: Należy karmić kopepoditami co dwa do trzech dni, aby zapobiec konsumpcji i uszkodzeniu zrzuconych wylinek, co mogłoby potencjalnie wpłynąć na ocenę stadium rozwojowego (krok 1.3.4).
4. Oszacuj stadium rozwojowe zwierzęcia na podstawie liczby wylinek. W przypadku braku wylinek przyjmuje się, że osobnik znajduje się w stadium CI. Jeśli obecnych jest od jednej do czterech wylinek, osobnik jest uznawany za znajdującego się w stadiach od CII do CV. W przypadku wystąpienia pięciu wylinek osobnik jest uznawany za dorosły.
Określanie płci osobników dorosłych na podstawie morfologii.
1. Określ płeć zwierząt poprzez badanie ich morfologii. Osobniki dorosłe Tigriopus samce posiadają kolankowate pierwsze czułki z haczykowatymi i kulistymi strukturami na końcu dystalnym (Rycina 3A). Dorosłe samice posiadają gładsze i stosunkowo cieńsze pierwsze czułki (Rycina 3B) niż u samców. Niektóre samice wykazują również ciemnozielone zabarwienie ciała wynikające z obecności lipidów gonadalnych (Rycina 3B, 3D).
2. Oznacz płeć na pokrywie dołka (Rycina 7B).

2. Test behawioralny i rejestracja wideo zachowań związanych z ochroną partnera

W dniu testów należy wybrać zwierzęta odpowiedniego stadium i płci do testu behawioralnego.
1. Wybrane osobniki w dołkach hodowlanych należy nakarmić drobno zmieloną karmą dla ryb i pozostawić do żerowania na 30 minut. W tym czasie należy przejść do kroku 2.1.2 w celu przygotowania komór testowych.
2. Przygotować dwie 48-dołkowe płytki hodowlane z płaskim dnem jako komory testowe; jedna płytka (zwana dalej „płytką A”) jest przeznaczona dla samców, a druga („płytka B”) dla celów (np. kopepodidów, dorosłych samic, dorosłych samców). Do dołków płytek należy dodać 400 µL czystej sztucznej wody morskiej o zasoleniu 35%. Płytki należy umieścić na podkładce świetlnej LED przykrytej półprzezroczystą płytą akrylową pełniącą funkcję dyfuzora światła (Rycina 8).
  Uwaga: Należy stosować różne media w zależności od celu eksperymentu.
  Uwaga: Aby uniknąć nadmiernego nagrzewania, nie należy używać lamp żarowych ani fluorescencyjnych jako podświetlenia.
3. Po 30-minutowym czasie karmienia opisanym w punkcie 2.1.1, każde zwierzę należy wypłukać, delikatnie przenosząc je pipetą przez kolejne cztery dołki płytki 24-dołkowej wypełnionej czystą sztuczną wodą morską (Rycina 9), aby zapobiec przenoszeniu zanieczyszczeń i wylinek z dołków hodowlanych.
4. Wypłukane osobniki należy umieścić w dołkach płytek A i B na podkładce świetlnej LED. Pozostawić zwierzęta na 30 minut w celu aklimatyzacji w dołkach.
5. Podczas okresu aklimatyzacji należy ustawić kamerę wideo nad płytką A (Rycina 8). Do stabilizacji kamery należy użyć statywu lub uchwytu.
6. Kamerę należy ustawić tak, aby ostrość była skierowana na samce w płytce A, co umożliwi obserwację anten.
  Uwaga: Aby zredukować migotanie podświetlenia w nagraniach, należy ustawić częstotliwość klatek równą lub połowę częstotliwości prądu elektrycznego i zastosować dłuższy czas naświetlania. Ponadto należy pozostawić podkładkę świetlną LED przykrytą półprzezroczystą płytą akrylową, zgodnie z opisem w kroku 2.1.2.
Po okresie aklimatyzacji opisanym w kroku 2.1.4, należy rozpocząć nagrywanie wideo i test behawioralny.
1. Cele należy przenieść z płytki B do płytki A za pomocą pipety Pasteura. Jeśli eksperyment jest wrażliwy na komponenty chemiczne w medium, należy zmieniać pipety dla każdej pary testowej.
  Uwaga: Podczas pobierania zwierzęcia z płytki B nie należy gonić go w wodzie pipetą Pasteura, ponieważ zaburzenia wody mogą pobudzić zwierzę i wywołać jego nadmierny ruch. Końcówkę pipety należy trzymać nieco nad powierzchnią wody i poczekać, aż osobnik znajdzie się pod końcówką. Następnie należy go delikatnie zassać z niewielką ilością sztucznej wody morskiej i wydmuchać do dołka na płytce A.
2. Zgodnie z planem eksperymentalnym, po przeniesieniu należy pozwolić samcowi i celowi na interakcję w każdym dołku przez pożądany czas obserwacji (np. 10 minut).
3. Po czasie obserwacji należy zatrzymać nagrywanie wideo. W razie potrzeby nagrane filmy należy pobrać z kamery na komputer.

3. Ręczna analiza właściwości behawioralnych

Przeanalizuj nagranie w celu ustalenia momentu przeniesienia każdego osobnika docelowego do dołka na płytce A.
Przeanalizuj momenty rozpoczęcia i zakończenia interesujących zdarzeń, a następnie oblicz czas trwania, latencję oraz częstotliwość tych zdarzeń.
1. Zdefiniuj rozpoczęcie próby pilnowania przez samca jako kontakt czułka samca z dowolną częścią ciała osobnika docelowego (Rysunek 10, góra po lewej). Kontakt czułkowym jest często poprzedzony szybkim (<0.5 s) pościgiem lub skokiem.
2. Zdefiniuj zakończenie próby pilnowania jako moment, w którym oba czułki samca odrywają się od ciała osobnika docelowego (Rysunek 10, góra po prawej). Oblicz częstotliwość prób pilnowania według wzoru:
3. Zdefiniuj rozpoczęcie kopulacji jako zgięcie grzbietowe ciała samca, po którym następuje powtarzalne dociskanie urosomy samca do urosomy samicy (Rysunek 10, dół po prawej). Częstotliwość pchnięć wynosi kilka razy na sekundę.
  Uwaga: Samiec pilnujący pełznie w stronę końca ogonowego ciała samicy przed kopulacją (Rysunek 10, dół po lewej).
4. Zdefiniuj zakończenie kopulacji jako rozdzielenie się urosom po zdarzeniach opisanych w punkcie 3.2.4.
  Uwaga: W przypadku T. californicus i T. japonicus kopulacja trwa zazwyczaj kilka minut.

4. Dwuwymiarowe śledzenie osobników i par

Wygeneruj klip wideo przedstawiający interesujący epizod (np. pierwsze 3 s próby ochrony), przycinając film zarejestrowany w kroku 2 za pomocą oprogramowania do edycji wideo.
Zainstaluj ImageJ¹⁴ ze strony: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Następnie pobierz MTrackJ, wtyczkę do śledzenia ruchu dla ImageJ¹⁵, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
Otwórz ImageJ i zaimportuj interesujący film (np. File > Import > Using QuickTime; wybierz „Convert 8-bit grayscale”, aby zmniejszyć ilość pamięci wymaganej do przetwarzania obrazu).
Przeprowadź kalibrację przestrzenną i czasową.
1. W oknie ImageJ wybierz narzędzie Straight Line Selection w celu kalibracji przestrzennej.
2. W oknie filmu narysuj linię zaznaczenia wzdłuż obiektu o znanej długości (np. średnica studzienki).
3. Otwórz menu „Set Scale” (Analyze > Set Scale). W polu „Known Distance” wpisz znaną długość, a w polu „Unit of Length” jej jednostkę (np. mm). Zaznacz pole „Global”, aby używać tej skali dla innych klipów wideo.
4. W celu kalibracji czasowej otwórz menu „Properties” (Image > Properties). W polu „Frame interval” wpisz odstęp między klatkami (odwrotność liczby klatek na sekundę).
Skonfiguruj śledzenie w MTrackJ.
1. Uruchom wtyczkę MTrackJ z menu Plugins > MtrackJ w programie ImageJ. Kliknij przycisk „Tracking” w oknie dialogowym MTrackJ, aby otworzyć menu konfiguracji śledzenia.
2. Ustaw interwał śledzenia, zaznaczając „Move to next time index after adding point” i wpisując liczbę w polu „Time step size” w oknie dialogowym konfiguracji. Aby przeprowadzić śledzenie klatka po klatce, wpisz „1” w polu „Time step size”.
3. Zaznacz „Apply local cursor snapping during tracking” i jako funkcję przyciągania wybierz „Dark centroid”. Opcja ta umożliwia automatyczne wykrywanie centroidu ciemnego obiektu (tzn. osobnika lub pary) w kwadracie detekcji („snap range”) wokół kursora. Wybierz rozmiar kwadratu tak, aby obejmował całą parę lub zwierzę na filmie (np. 31 x 31 pikseli).
4. Kliknij „OK”, aby zastosować wybrane opcje.
Przeprowadź śledzenie dwuwymiarowe.
1. Kliknij przycisk „Add” w oknie dialogowym MTrackJ, aby rozpocząć śledzenie.
2. Umieść kursor (kwadrat detekcji) tak, aby obejmował parę lub osobnika, który ma być śledzony. Kliknij, aby wykryć ciemny centroid obiektu wewnątrz kwadratu.
3. Powtórz krok 4.6.2 dla żądanej liczby klatek.
4. Aby wygenerować tabele danych, kliknij przycisk „Measure” w oknie dialogowym MTrackJ. Dane są wyświetlane w dwóch oknach: okno „MTrackJ: Tracks” pokazuje podsumowanie śledzonej trajektorii dwuwymiarowej, a okno „MTrackJ: Points” zawiera szczegółowe dane dla każdego punktu czasowego. Aby zapisać każdą tabelę, wybierz menu File > Save as… w programie ImageJ.
  Uwaga: Opisy poszczególnych kolumn danych znajdują się w podręczniku online udostępnionym przez twórcę (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/).
5. Aby wygenerować film ze śledzoną trajektorią narysowaną w formie kolorowej linii, kliknij przycisk „Movie” w oknie dialogowym MTrackJ. Aby zapisać wygenerowany film, wybierz menu File > Save as… w programie ImageJ.
Zapisz cały wynik. Kliknij przycisk „Save” w oknie dialogowym MTrackJ, aby zapisać wyniki, w tym dane (krok 4.6.4) oraz śledzoną trajektorię dwuwymiarową (kroki 4.6.2 i 4.6.3).

Wyniki

Metoda indywidualnej hodowli opisana w kroku 1 umożliwia przygotowanie i etapowanie osobników dziewiczych, które nie miały wcześniejszego doświadczenia w parowaniu.

Test behawioralny opisany w kroku 2 umożliwia rejestrację wideo i obserwację zachowań związanych z ochroną partnera u wiołnoków z rodzaju Tigriopus. Następująca analiza nagranego wideo z zastosowaniem metod opisanych w krokach 3 i 4 pozwala na ilościową ocenę kilku aspektów zachowania przedstawionych na Rysunku 1.

Rysunek 11 przedstawia różnicę w średnim czasie trwania prób ochrony między parami samiec-samica a parami samiec-samiec u T. californicus. Analiza manualna wykazała, że pary samiec-samiec wykazywały stosunkowo krótszy czas parowania niż pary samiec-samica.

Przykłady trajektorii śledzonych za pomocą metody analizy przedstawiono na Rycynie 12, a reprezentatywny wynik analizy prędkości pokazano na Rycynie 13. Dwuwymiarowe śledzenie przestrzenne nowo utworzonych par strzegących T. californicus wykazało, że pary samiec-samiec miały tendencję do wykazania wyższej prędkości niż pary samiec-samica w ciągu pierwszych 3 s prób strzeżenia.

figure-results-1
Rycina 1: Zachowanie strzegące partnera u Tigriopus. (A) Dorosły samiec chwytający osobnika młodzieńczego (copepodida) za pomocą pierwszych anten (wskazane niebieskimi strzałkami). Skala = 1 mm. (B) Schemat zachowania strzegącego partnera. Samiec próbuje schwytać osobnika docelowego (lewo) i tworzy z nim parę (środek). W parach samiec-samiec oraz w niektórych parach samiec-samica próba strzeżenia kończy się bez kopulacji. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Tsuboko-Ishii i Burtona z 2017 roku⁵. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Stadia rozwojowe Tigriopus. Gatunki Tigriopus przechodzą zazwyczaj przez sześć stadiów naupliosa (od NI do NVI), pięć stadiów kopepodita (od CI do CV) oraz stadium dorosłe (CVI)¹⁶. Samce podejmują próby ochrony osobników młodocianych już od wczesnych stadiów kopepoditów (CI u T. japonicus i T. fulvus⁶^,¹⁷ oraz CII u T. californicus³), a także osobników dorosłych obu płci⁵. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Tsuboko-Ishii i Burtona z 2017 r.⁵. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Morfologia osobników dorosłych (T. californicus). (A) Samiec dorosły. (B) Samica dorosła. (C) Ciężarna samica dorosła z workiem jajowym zawierającym zapłodnione i rozwinięte (jasnopomarańczowe) jaja. (D) Ciężarna samica dorosła z workiem jajowym zawierającym niezapłodnione lub nierozwinięte (ciemnozielone) jaja. Strzałki wskazują worki jajowe. Skala = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Schemat przygotowania do hodowli indywidualnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Zrzucne egzuwie. (A) Egzuwie z etapów CI do CV jednego osobnika T. californicus. Pasek skali = 1 mm. (B) Egzuwie z etapów CI do CV w pojedynczej studience hodowlanej. Białe zanieczyszczenia to odchody zwierzęcia hodowanego w studience (niewidocznego na zdjęciu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Poszukiwanie wylinek pod stereomikroskopem. Paski skali = 1 mm. (A) Zmiana ogniskowej stereomikroskopu w celu wykrycia wylinek na różnych głębokościach. Purpurowe strzałki wskazują wylinki w ostrości, a szare strzałki wylinki poza ostrością. Górne zdjęcie przedstawia ostrość ustawioną na lewej wylince, która znajduje się na dnie dołka. Dolne zdjęcie przedstawia ostrość ustawioną na prawej wylince, która unosi się pod powierzchnią medium. (B) Górne zdjęcie pokazuje przykład utrudnienia badania przez zanieczyszczenia pływające na powierzchni medium. Zielona strzałka wskazuje wylinkę ukrytą pod zanieczyszczeniami. Dolne zdjęcie pokazuje efekt oczyszczenia powierzchni za pomocą małego kawałka ręcznika papierowego. Po oczyszczeniu widoczna jest wylinka (wskazana zieloną strzałką). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Określanie stadium rozwoju i płci zwierząt. Przykłady sposobów oznaczania liczby wylinek oraz płci zwierząt na pokrywie płytki hodowlanej. (A) Przykład dołka zawierającego pięć wylinek i jednego dorosłego osobnika. Liczba kresek w zapisie kreskowym na pokrywce odpowiada liczbie wylinek znalezionych w dołku. Gdy liczba wylinek osiągnie pięć, płeć zwierzęcia można określić na podstawie morfologii czułków (patrz również Rycina 3). (B) Przykład opisanego wieczka płytki hodowlanej. Górne rzędy zawierają starsze zwierzęta (CIV do osobników dorosłych), a dolne rzędy zawierają młodsze (t. j. świeżo zebranych) zwierząt (CI do CIII). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-8
Rycina 8: Schemat testu behawioralnego. Układ do rejestracji wideo zachowań związanych z ochroną partnera (po lewej) oraz zarys testu behawioralnego (po prawej). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Tsuboko-Ishii i Burton 2017⁵. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-9
Rysunek 9: Płukanie zwierząt przed testem behawioralnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Definicja zdarzeń badanych w analizie manualnej. Ilustracje zdarzeń obserwowanych w związku z próbą ochrony partnera. Wyróżniono nazwy zdarzeń zdefiniowanych i analizowanych w kroku 3. Zdarzenia objęte linią przerywaną mogą nie występować w niektórych próbach ochrony partnera. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-11
Rycina 11: Różnica w czasie trwania ochrony między parami samiec-samica a parami samiec-samiec u T. californicus. Każdy symbol trójkąta reprezentuje dane z jednej badanej pary. Słupki i wąsy reprezentują odpowiednio mediany oraz rozstęp międzykwartylowy. Średni czas trwania przechwycenia był większy dla par samiec-samica (samiec-samica (n=22), samiec-samiec (n=29); **p < 0.01 testem U Manna-Whitneya). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-12
Rycina 12: Trajektorie par w ciągu pierwszych trzech sekund prób ochrony. Przykłady śledzonych dwuwymiarowych trajektorii par samiec-samica (po lewej) i par samiec-samiec (po prawej) T. californicus. Kropki na trajektoriach reprezentują punkty czasowe (30 klatek na sekundę). Paski = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-13
Rycina 13: Różnica w średniej prędkości po rozpoczęciu zachowań ochronnych (guarding) pomiędzy parami samiec-samica a parami samiec-samiec T. californicus. Każdy symbol trójkąta reprezentuje dane z jednej badanej pary. Słupki i wąsy reprezentują odpowiednio mediany oraz rozstęp międzykwartylny. Średnia prędkość pary w pierwszych 3 s prób ochronnych była wyższa dla par samiec-samiec (samiec-samica (n=13), samiec-samiec (n=35). ***p < 0,001 testem U Manna-Whitneya). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-14
Rycina uzupełniająca 1: Wpływ zabiegu płukania na zachowanie Tigriopus. Każdy symbol koła lub trójkąta reprezentuje dane z jednego badanego osobnika lub pary. Słupki i wąsy reprezentują odpowiednio mediany i rozstęp międzykwartylowy. Osobniki w grupach „płukanych” i „niepłukanych” były traktowane w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że grupa „niepłukana” nie była poddawana zabiegowi płukania (krok 2.1.3) przed 30-minutowym czasem aklimatyzacji (krok 2.1.4). (A) Średnia prędkość samców płukanych miała tendencję do bycia większą niż prędkość samców niepłukanych (płukane (n=6), niepłukane (n=6), n.s.: nie stwierdzono istotnej różnicy testem U Manna-Whitneya). Prędkość mierzono przez 30 s na podstawie filmów nagranych po czasie aklimatyzacji. (B) Średnia prędkość samic płukanych miała tendencję do bycia większą niż prędkość samic niepłukanych (płukane (n=6), niepłukane (n=6), n.s.: nie stwierdzono istotnej różnicy testem U Manna-Whitneya). Prędkość mierzono przez 30 s na podstawie filmów nagranych po czasie aklimatyzacji, zgodnie z krokiem 4 (interwał śledzenia = 0.5 s). (C) Częstość prób ochrony była większa u par osobników płukanych (płukane (n=6), niepłukane (n=6). ** p < 0.01 testem U Manna-Whitneya). (D) Czas trwania prób ochrony miał tendencję do bycia większy u par osobników płukanych (płukane (n=6), niepłukane (n=6), n.s.: nie stwierdzono istotnej różnicy testem U Manna-Whitneya). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Indywidualna hodowla i określenie etapu i płci

Tutaj opisaliśmy metodę zastosowaną w naszym poprzednim badaniu⁵ do przygotowania dziewiczych zwierząt Tigriopus z kontrolą ich doświadczenia w parowaniu podczas śledzenia ich rozwoju (Ryc. 4 i Ryc. 7). Ponieważ gatunki Tigriopus są wykorzystywane jako zwierzęta modelowe w różnych dziedzinach biologii, takich jak toksykologia^16,18, fizjologia ekologiczna 19,20,21 i genetyka ewolucyjna 13,22,23,24, metoda ta może potencjalnie zapewnić cenny środek do oceny wpływu czynników środowiskowych i genetycznych na cykl życiowy tych widłonogów.

Aby osiągnąć pomyślne stadium zaawansowania, kluczowe znaczenie ma regularne wyszukiwanie i zbieranie widłaków implantów ślimakowych z kultury masowej (krok 1.2), ponieważ pobieranie na późniejszych etapach może skutkować błędnym stopniowaniem oceny gatunku zwierząt. Ponadto dokładne wyszukiwanie wysięków (krok 1.3) jest również niezbędne do dokładnego określenia stopnia zaawansowania. W razie potrzeby należy zwiększyć częstotliwość zbierania i inscenizacji, ponieważ odstęp między linieniem waha się od jednego do kilku dni w zależności od gatunku i warunków chowu ^2,25,26. Różnice w morfologii czułków między widłołapami a dorosłymi samicami nie są widocznie znaczące u niektórych gatunków i populacji Tigriopus^16,25. W związku z tym ocena stopnia zaawansowania przed seksem jest pomocna w odróżnieniu dorosłych samic od zaawansowanych widłaków obu płci.

Testy behawioralne i manualna analiza właściwości behawioralnych

Ogólnie rzecz biorąc, jedną z najbardziej krytycznych części badań etologicznych jest definiowanie i opisywanie interesujących wydarzeń. Metody przedstawione w tym artykule zostały po raz pierwszy opracowane dla naszego ostatniego badania⁵ i uzupełnione o opis kopulacji i pomocy wizualnych (ryc. 10). Oprócz tego konsekwencja w obchodzeniu się ze zwierzętami odgrywa również ważną rolę w eksperymentach behawioralnych. Na przykład płukanie widłonogów może potencjalnie ułatwić niektóre aspekty ich zachowania (rysunek uzupełniający 1) i dlatego pożądane jest, aby było wykonywane w spójny sposób wśród próbek, tak jak zostało to znormalizowane w kroku 2.1.3. Oczekujemy, że materiały zawarte w tym artykule pomogą w kontrolowanych i powtarzalnych badaniach nad zachowaniem Tigriopusa w zakresie ochrony partnerów, promując badania reprodukcyjne i ekologiczne tego licznego mieszkańca basenów przypływowych.

Jednym z możliwych ograniczeń tej metody jest małe powiększenie uzyskiwanych obrazów. Chociaż filmy nagrane za pomocą naszego systemu pozwalają na identyfikację widocznych struktur ciała, w tym urosomów i pierwszych czułków samców, możemy nie być w stanie zaobserwować bardziej subtelnych struktur, takich jak nogi i genitalia, za pomocą naszej metody, ponieważ nie wykorzystuje ona mikroskopijnego powiększenia do nagrywania wideo. Podczas gdy Kelly i wsp. stwierdzili, że byli w stanie zaobserwować transfer spermatoforu z samców do samic T. japonicus pod mikroskopową obserwacją przy 100-krotnym powiększeniu (bez nagrania wideo)⁷, nie byliśmy w stanie zaobserwować spermatoforu w naszych filmach, być może z powodu ograniczenia rozdzielczości obrazu.

Dwuwymiarowe śledzenie par

Chociaż metoda ta nie pozwala na trójwymiarowe śledzenie zwierząt, umożliwia dwuwymiarową analizę trajektorii zooplanktonu bez chemicznego znakowania zwierząt (porównaj j. Lard i in. 2010:²⁷), wykorzystując programy rozpowszechniane za darmo. Jeśli rozmiar pliku filmowego jest zbyt duży, aby można go było przetworzyć w ImageJ, można zmniejszyć rozdzielczość pliku i przekonwertować go na film w skali szarości. Chociaż opisana metoda została pierwotnie opracowana dla dorosłych par T. californicus (ryc. 12 i ryc. 13), jest również dostępna dla par dorosły-młodocianych i pojedynczych osobników (ryc. uzupełniająca 1), a także zasadniczo dla innych gatunków Tigriopus . Oczekujemy również, że metoda ta będzie miała zastosowanie do krótkoterminowej (od milisekundy do drugiej skali czasowej) analizy trajektorii zooplanktonu innych taksonów z odpowiednimi korektami.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty z Fundacji Sumitomo w Japonii (Grant na Projekty Badawcze w Naukach Podstawowych, numer grantu: 150932) i Instytutu Badawczego Bezkręgowców Morskich w Japonii (indywidualny grant badawczy 2018) dla STI i RSB, oraz grant z US National Science Foundation (DEB-1556466) dla RSB. Dziękujemy Pani Kianie Michelle Woodward za informacje zwrotne na temat metody hodowli i inscenizacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Natychmiastowa sól morska oceaniczna	Spectrum Brands. Inc.	SS1-160P	Do przygotowania podłoża hodowlanego
PRO PlecoWafle	Tetra	16447	Pokarm dla widłonogów (stosowany po zmieleniu w moździerzu)
Płaska dno 6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej z pokrywką	Corning Co., Ltd.	353224	Pojemnik do hodowli ciężarnych samic i wyklutych naupliów
Płaska denna 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej z pokrywką	Corning Co., Ltd.	353226	Pojemnik do hodowli indywidualnej
Płaska 48-dołkowa płytka do hodowli komórkowej z pokrywką	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	Komory do obserwacji behawioralnej Podkładka
świetlna LED	Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.	Podświetlenie Litup LP4	do obserwacji behawioralnej
Kamera	Canon	0591C003 (model: Rebel T6i)	Do nagrywania zachowania
Pipeta Pasteura	Fisher Scientific	13-678-6A	Do przenoszenia widłonogów
Końcówki do mikropipet P10	VWR	613-0735	Do przenoszenia kopepodyów stopnia C1
ImageJ		NIH Wersja 1.49t	Do półautomatów analiza filmów
MTrackJ		Wersja 1.5.1	Wtyczka ImageJ do śledzenia opracowana przez Dr. Erika Meijeringa (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Centrum Medyczne Uniwersytetu Erazma, Holandia)

Bibliografia

Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758(2017).
Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236(2017).
Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516(2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wideo stadium copepodid w morfologia anten wtyczka MTrackJ ledzenie przestrzenne czas trwania pr by ochrony trajektoria p ywania

Indywidualne hodowle widłonogów Tigriopus i analiza ilościowa ich zachowań związanych z ochroną partnerów