Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Summary

Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.

Abstract

Nieprawidłowa sygnalizacja komórkowa odgrywa kluczową rolę w rozwoju i progresji raka. Większość nowatorskich terapii celowanych jest rzeczywiście ukierunkowana na białka i funkcje białek, a aberracje sygnalizacji komórkowej mogą zatem służyć jako biomarkery wskazujące spersonalizowane opcje leczenia. W przeciwieństwie do analiz DNA i RNA, zmiany w aktywności białek mogą skuteczniej oceniać mechanizmy leżące u podstaw wrażliwości i oporności na leki. Fosfo cytometria przepływowa to potężna technika, która mierzy zdarzenia fosforylacji białek na poziomie komórkowym, co jest ważną cechą, która odróżnia tę metodę od innych podejść opartych na przeciwciałach. Metoda pozwala na jednoczesną analizę wielu białek sygnałowych. W połączeniu z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek, większe zestawy danych o średniej i wysokiej przepustowości mogą być pozyskiwane przez standardowy sprzęt cytometryczny w krótkim czasie. Fosfo cytometria przepływowa ma zastosowanie zarówno w badaniach biologii podstawowej, jak i w badaniach klinicznych, w tym w analizie sygnalizacji, odkrywaniu biomarkerów i ocenie farmakodynamiki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do analizy przepływu fosfo oczyszczonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, na przykładzie komórek przewlekłej białaczki limfocytowej.

Introduction

Fosfochromatyczna cytometria przepływowa jest używana do analizy poziomów fosforylacji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ogólnym celem metody jest mapowanie wzorców sygnalizacji komórkowej w określonych warunkach. Wykorzystując wieloparametrową zdolność cytometrii przepływowej, można jednocześnie analizować kilka szlaków sygnałowych w różnych podzbiorach niejednorodnej populacji komórek, takich jak krew obwodowa. Cechy te mają przewagę nad innymi technologiami opartymi na przeciwciałach, takimi jak immunohistochemia, test immunoenzymatyczny (ELISA), macierz białkowa i macierz białek z odwróconymi fazami (RPPA)¹. Fosfomorfometria przepływowa może być połączona z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek (FCB), co oznacza, że poszczególne próbki komórek są znakowane unikalnymi sygnaturami barwników fluorescencyjnych, dzięki czemu można je mieszać ze sobą, barwić i analizować jako pojedynczą próbkę². Zmniejsza to zużycie przeciwciał, zwiększa odporność danych dzięki połączeniu próbek kontrolnych i poddanych działaniu substancji oraz zwiększa szybkość akwizycji. Połączoną populację FCB można następnie podzielić na mniejsze próbki i wybarwić maksymalnie 35 różnymi przeciwciałami specyficznymi dla fosfo, w zależności od ilości materiału wyjściowego. W związku z tym duże eksperymenty profilowania można przeprowadzać przy użyciu standardowego sprzętu cytometrycznego. Fosfo cytometria przepływowa została zastosowana do profilowania szlaków sygnałowych w próbkach pacjentów z kilku nowotworów hematologicznych, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL)^3,4,5, ostra białaczka szpikowa (AML)⁶ i chłoniaki nieziarnicze⁷. Fosfo-przepływowa cytometria jest zatem skutecznym podejściem do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół analizy próbek pacjentów z PBL za pomocą fosfocymetrii przepływowej (Rysunek 1A). Przedstawiono przykłady charakterystyki sygnalizacji podstawowej, stymulacji receptora komórek anty-IgM/B i zaburzeń działania leków. Znajduje się tam szczegółowy opis matrycy FCB. Protokół można łatwo dostosować do innych typów komórek zawiesinowych.

Protocol

Próbki krwi otrzymano po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody od wszystkich dawców. Badanie zostało zatwierdzone przez Regionalny Komitet ds. Etyki Badań Medycznych i Zdrowotnych w Norwegii Południowo-Wschodniej, a badania nad ludzką krwią przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską⁸.

UWAGA: Kroki 1-3 powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z próbek krwi pacjenta z PBL

UWAGA: Krew ludzka powinna być traktowana zgodnie z przepisami dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) i przenieść do probówek o pojemności 50 ml (30 ml / probówkę).
2. Ostrożnie nałożyć 10 ml pożywki o gradiencie gęstości (np. Lymphoprep) na dno probówki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
3. Wirować przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. PBMC są teraz widoczne na wierzchu warstwy medium o gradiencie gęstości.
4. Za pomocą pipety Pasteura przenieś komórki do dwóch nowych probówek o pojemności 50 ml. Umyj dwukrotnie PBS (napełnij tubki).
5. Wirować przy 350 x g przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml PBS.
6. Policz komórki przy użyciu preferowanej metody.
7. Odwirować komórki przy stężeniu 350 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. UWAGA: Kroki od 1.8 do 3.2 są opcjonalne. Możliwe jest bezpośrednie przejście do kroku 3.3.
8. Ponownie zawiesić komórki w płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i zamrozić w odpowiednich porcjach za pomocą krioprobówek.
   nuta: DMSO jest toksyczny dla komórek. Pracuj szybko po zmieszaniu komórek z FBS/DMSO. Komórki mogą być przechowywane przez długi czas w ciekłym azocie.

2. Rozmrażanie komórek

1. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   nuta: DMSO jest toksyczny dla komórek. Pracuj szybko, aby ograniczyć narażenie na DMSO.
2. Umyj komórki raz 10 ml zimnego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 z dodatkowym GlutaMAX, patrz Tabela Materiałów).
3. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
4. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej pirogronianem sodu, aminokwasami endogennymi MEM i penicyliną/streptomycyną (dodawaną w 1x rozcieńczeniu zgodnie z instrukcją) i 10% FBS. Przenieść komórki do małej kolby do hodowli komórkowej i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C na 1 godzinę, aby umożliwić kalibrację komórek.

3. Przygotowanie komórek

1. Policz żywe komórki przy użyciu preferowanej metody.
2. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 (krok 2.2) uzupełnionej 1% FBS do nie więcej niż 50 x 10⁶ komórek/ml.
4. Przenieść wymaganą ilość zawiesiny komórek do studzienek w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V.
   nuta: Liczba studzienek odpowiada liczbie warunków, które mają zostać przetestowane. Próbki do przebiegu stymulacji w czasie pobiera się z jednej studzienki. Obliczyć 50 μl próbki na punkt czasowy + 50 μl objętości martwej. Zachowaj próbki do kontroli kompensacji (jedna próbka niebarwiona + jedna próbka na barwnik do kodów kreskowych).
5. Przenieść płytkę 96-dołkową do wstępnie podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odpocznij komórki przez 10 minut.

4. Stymulacja i utrwalanie komórek

UWAGA: Wykonaj kroki 4-8 na stole laboratoryjnym (tzn. nie sterylnie).

UWAGA: Głównym składnikiem Fix Buffer I jest paraformaldehyd, który jest toksyczny (wdychanie i kontakt ze skórą). Obchodź się ostrożnie.

1. Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z 60 μl buforu fix I na studzienkę na próbkę. Pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   nuta: Komórki: Napraw bufor powinien mieć wartość 1:1. Aby umożliwić odparowanie w temperaturze 37 °C, bufor Fix jest początkowo dostępny w dużych ilościach.
2. Opcjonalnie potraktuj komórki lekami przed stymulacją.
3. Przenieść próbkę kontrolną o objętości 50 μl na płytkę utrwalającą. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
4. Opcjonalnie rozpocznij przebieg stymulacji od dodania 10 μg/ml anty-IgM do komórek. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
5. Przenieść próbkę o objętości 50 μl na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym. Mieszać pipetując w górę i w dół.
   nuta: Sygnalizacja indukowana przez anty-IgM jest zwykle inicjowana wcześnie (minuty).
6. Pozostawić płytkę utrwalającą w temperaturze 37 °C na 10 minut po dodaniu ostatniej próbki.

5. Fluorescencyjne kody kreskowe komórek (FCB)

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zobaczyć listę odczynników do kodów kreskowych.

1. Umyj stałe komórki 3x PBS (napełnij studzienki).
2. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
3. Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych. Odpipetować 5 μl każdego odczynnika do kodów kreskowych na studzienkę w liczbie kombinacji wymaganych do wybarwienia wszystkich próbek zgodnie z matrycą barwienia, np. w Rysunek 1B. Każda próbka będzie miała unikalną kombinację różnych stężeń kodów kreskowych.
4. Ponownie zawiesić komórki w 190 μl PBS i przenieść na płytkę z kodami kreskowymi. Dokładnie wymieszaj.
   nuta: Wybarwić jedną próbkę kompensacyjną o najwyższym stężeniu końcowym stosowanym dla każdego odczynnika do kodów kreskowych i zachować jedną niebarwioną próbkę.
5. Pozostaw komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
6. Przepłukać wybarwione komórki 2x płukaniem przepływowym (PBS, 1% FBS, 0,09% azydku sodu) (napełnić studzienki).
7. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
8. Dodać 190 μl płynu do płukania do komórek i połączyć próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej probówce o pojemności 15 ml. Przenieś każdą kontrolkę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 ml.
9. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.

6. Przepuszczalność komórek do wewnątrzkomórkowego barwienia antygenów

UWAGA: Głównym składnikiem Perm Buffer III jest metanol, który jest toksyczny (wdychanie i kontakt ze skórą) i łatwopalny. Obchodź się ostrożnie.

1. Przenieść 2 ml buforu do trwałej ondulacji III do probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić w temperaturze -20 °C, aby po użyciu była lodowata.
   nuta: Bufor do trwałej ondulacji można pozostawić w temperaturze -20 °C od początku eksperymentu.
2. Dodaj 1,5 ml lodowatego buforu do populacji komórek z kodem kreskowym (w probówce o pojemności 15 ml) i 100 μl do każdej kontroli kompensacyjnej (w probówkach o pojemności 1,7 ml) kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.
3. Przenieść komórki bezpośrednio do temperatury -80 °C. Pozostawić na minimum 30 min.
   nuta: Naturalne jest, że w tym momencie przerywa się eksperyment. Komórki w buforze Perm mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.

7. Barwienie przeciwciał

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać listę zgłoszonych przeciwciał specyficznych dla fosfonu.

1. Przenieść komórki z temperatury -80 °C do pojemnika z lodem.
2. Mycie 3x z flow wash.
   nuta: Ważne jest, aby dodać płukanie przepływowe w nadmiarze, aby zobaczyć osad komórek, np. dodać 3 ml płukania przepływowego do populacji komórek z kodem kreskowym i 1 ml do każdej kontroli kompensacji.
3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
4. Ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, co pozwala na 25 μl zawiesiny komórek na barwienie przeciwciałami fosfologicznymi. Zawiesić regulatory kompensacji w 200 μl płukania przepływowego.
5. Przygotować przeciwciała do barwienia w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V. Ostateczna objętość wyniesie 50 μl/studzienkę. Na basenik dodać przeciwciało specyficzne dla fosfologii rozcieńczone w płukaniu przepływowym do końcowej objętości 10 μl, marker powierzchniowy rozcieńczony w płukaniu przepływowym do końcowej objętości 15 μl i 25 μl zawiesiny komórkowej.
   nuta: Rozcieńczenia przeciwciał należy miareczkować przed eksperymentem. Uwzględnij kontrolę izotypu.
6. Pozostaw komórki na 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
7. Umyj poplamione komórki 2x płukaniem przepływowym (napełnij studzienki).
8. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
9. Ponownie zawiesić komórki w 150 μl płukania przepływowego.

8. Przygotowanie kontroli kompensacji

1. Przygotować kontrole kompensacyjne dla fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami równolegle z barwieniem przeciwciał. Użyj koralików kompensacyjnych zgodnie z instrukcjami sprzedawcy.

9. Analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić na cytometrze przepływowym z próbnikiem o wysokiej przepustowości (HTS).

1. Zoptymalizuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT) za pomocą niezabarwionego sterowania.
2. Uruchom kontrolki wynagrodzeń i oblicz macierz wynagrodzeń.
3. Uruchamianie próbek. Częstotliwość zdarzeń powinna być zgodna ze specyfikacją instrumentu.

10. Strategia bramkowania i analiza danych

1. Zaimportuj pliki FCS z eksperymentu do oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo lub Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Strategia bramkowania
   1. Wybierz limfocyty, wykreślając SSC-A i FSC-A na wykresie kropkowym gęstości.
   2. Wyświetl limfocyty i wybierz podkoszulki, wykreślając SSC-A w stosunku do FSC -W.
   3. Wyświetl pojedyncze komórki i bramkuj typ komórki, wykreślając SSC-A w stosunku do znacznika powierzchni.
   4. Wyświetl populację typów komórek na wykresie gęstości Pacific Blue w porównaniu z SSC-A i wybierz różne populacje FCB na podstawie ich intensywności barwienia Pacific Blue (patrz Rysunek 1A).
   5. Wykreśl kanał przeciwciała fosfo względem kanału FCB lub jako mapę cieplną (patrz Rysunek 1A), aby wyświetlić zdarzenia fosforylacji.
3. Oblicz fosfosygnały za pomocą odwrotnego sinusa hiperbolicznego (arcsinh) MFI (mediana intensywności fluorescencji) kontroli sygnału fosfo w porównaniu z izotypem (podstawowe poziomy fosforylacji, patrz Rysunek 1D) lub populacji komórek stymulowanych i niestymulowanych (patrz Rysunek 1E).

Results

Główne etapy protokołu cytometrii przepływowej fosfo są zilustrowane w Rysunek 1A. W przedstawionym przykładzie komórki PBL barwiono odczynnikiem do kodów kreskowych Pacific Blue w czterech rozcieńczeniach. Trójwymiarowe kody kreskowe można przeprowadzić poprzez połączenie trzech barwników kodów kreskowych, jak pokazano na rysunku Rysunek 1B. Poszczególne próbki są następnie dekonwolucyjne poprzez późniejsze bramkowanie na każdym...

Discussion

Fosfochromatyczna cytometria przepływowa jest potężną techniką pomiaru poziomu fosforylacji białek w pojedynczych komórkach. Ponieważ metoda opiera się na barwieniu przeciwciałami, fosfoprzepływowa cytometria jest ograniczona dostępnością przeciwciał. Ponadto, w celu uzyskania wiarygodnych wyników, wszystkie przeciwciała powinny być miareczkowane i weryfikowane przed użyciem. Szczegółowy protokół miareczkowania przeciwciał swoistych dla fosfo został opisany w innym miejscu¹². Podczas projektowania...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Pożywka do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca	płodu ThermoFisher Scientific	10270169	Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
Pirogronian sodu	ThermoFisher Scientific	11360-039	Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
MEM Aminokwasy endogenne	ThermoFisher Scientific	11140-035	Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Medium gradientu gęstości
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Do stymulacji receptora komórek B
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Bufor utrwalający
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Bufor permeabilizacyjny
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Odczynnik do kodów kreskowych
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Odczynnik do kodów kreskowych
Pacific Orange Succinimidylowy, sól trietyloamonowa	ThermoFisher Scientific	P30253	Odczynnik do kodów kreskowych
Koraliki kompensacyjne	Zdefiniowane przez użytkownika		Prawidłowe gatunki reaktywność
Probówki Falcon<	em>Zdefiniowane przez użytkownika
Probówki Eppendorfa	Zdefiniowane przez użytkownika
96 dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V	Zdefiniowane przez użytkownika		Kompatybilne z cytometrem przepływowym
Wirówki	Zdefiniowane przez użytkownika		Do probówek Eppendorf, probówek Falcon i płytek
Kąpiel wodna	Zdefiniowany przez użytkownika		z regulacją temperatury
	Zdefiniowany przez użytkownika		Z próbnikiem o wysokiej przepustowości (HTS)
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
>< strong>Antygen
AKT (pS473)	Technologie sygnalizacji komórkowej	4075	Clone: D9E Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Odniesienie: Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Redukcja inhibitorów kinazy tyrozynowej śledziony…, Hematologica, 101(2):e59-62 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust i wsp., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Odniesienie: Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Klon: 24a/BTK (Y551)  Odniesienie: Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skå nland i in., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)Technologie	sygnalizacji komórkowej	9716	Clone: D2C8 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Iκ B&alfa;	Technologie sygnalizacji komórkowej	5743	Clone: L35A5 Odniesienie: Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Klon: I58-1169 Odniesienie: Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Źródło: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κ B p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κ B p65 (pS536)	Technologie sygnalizacji komórkowej	4887	Klon: 93H1 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)Technologie	sygnalizacji komórkowej	4552	Clone: 28B10 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland i in., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Technologie sygnalizacji komórkowej	4375	Clone: E10 Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce…, Hematologica, 101(2):e59-62 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Technologie sygnalizacji komórkowej	NN	silny>klon: 16G8 Odniesienie: Irish i in., 2007, duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2…, Krew, 109(6):2589-96
p53 (pS20)Technologie	sygnalizacji komórkowej	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2…, Krew, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Technologie sygnalizacji komórkowej	NN	strong>Clone: Poliklonalny Odniesienie: Irish i wsp., 2007, duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2…, Krew, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Technologie sygnalizacji komórkowej	NN	strong>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplikacja i nadekspresja Bcl-2…, Krew, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Technologie sygnalizacji komórkowej	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2…, Krew, 109(6):2589-96
PLCγ 2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Klon: K86-689.37 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Klon: J112-906 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Technologie sygnalizacji komórkowej	4851	klon: D57.2.2E Reference: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)Technologie	sygnalizacji komórkowej	9257	Clone: G9 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	klon: J141-668.36.58  Indeks: Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Klon: 4/P-STAT3 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Klon: Poliklonalny Referencyjny: Uzel i wsp., 2001, Wykrywanie wewnątrzkomórkowego fosforylowanego STAT-4 za pomocą cytometrii przepływowej, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)Technologie	sygnalizacji komórkowej	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Redukcja inhibitorów kinazy tyrozynowej śledziony…, Hematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skå nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust i wsp., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w…, Krew, 129(6): 759-770