Artykuł metodologiczny

Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58389

⸱

25 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Rak jajnika tworzy przerzuty w całej jamie otrzewnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i stosowania nanosond rozpraszających Ramana z rezonansem wzmocnionym powierzchniowo, ukierunkowanych na receptor kwasu foliowego, które ujawniają te zmiany z wysoką swoistością za pomocą obrazowania ratiometrycznego. Nanosondy podaje się dootrzewnowo żywym myszom, a uzyskane obrazy dobrze korelują z histologią.

Streszczenie

Rak jajnika reprezentuje najbardziej śmiercionośny nowotwór ginekologiczny. Większość pacjentów występuje w stadium zaawansowanym (III lub IV stopień wg FIGO), kiedy miejscowe przerzuty już wystąpiły. Jednak rak jajnika ma unikalny wzorzec rozprzestrzeniania się przerzutów, w którym implanty nowotworowe są początkowo zawarte w jamie otrzewnej. Funkcja ta może w zasadzie umożliwić całkowitą resekcję implantów nowotworowych z zamiarem wyleczenia. Wiele z tych zmian przerzutowych jest mikroskopijnych, co utrudnia ich identyfikację i leczenie. Uważa się, że neutralizacja takich mikroprzerzutów jest głównym celem w kierunku wyeliminowania nawrotu guza i osiągnięcia długoterminowego przeżycia. Obrazowanie ramanowskie z rezonansem powierzchniowym ze wzmocnionym powierzchniowo Nanosondy rozpraszające Ramana mogą być używane do wyznaczania mikroskopijnych guzów o wysokiej czułości, ze względu na ich jasne i bioortogonalne sygnatury spektralne. W tym miejscu opisujemy syntezę dwóch "smaków" takich nanosond: funkcjonalizowanej przeciwciałem, która celuje w receptor kwasu foliowego – nadekspresję w wielu nowotworach jajnika – oraz niecelowanej nanosondy kontrolnej o wyraźnym widmie. Nanosondy są jednocześnie podawane dootrzewnowo mysim modelom przerzutowego gruczolakoraka ludzkiego jajnika. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Jama otrzewnowa zwierząt jest chirurgicznie odsłaniana, przemywana i skanowana za pomocą mikrospektrometru Ramana. Następnie sygnatury Ramana dwóch nanosond są rozprzęgane za pomocą klasycznego algorytmu dopasowywania metodą najmniejszych kwadratów, a ich odpowiednie wyniki są dzielone w celu uzyskania ratiometrycznego sygnału sond ukierunkowanych na kwas foliowy w porównaniu z sondami nieukierunkowanymi. W ten sposób mikroskopijne przerzuty są wizualizowane z dużą swoistością. Główną zaletą tego podejścia jest to, że miejscowa aplikacja do jamy otrzewnej – którą można wygodnie wykonać podczas zabiegu chirurgicznego – może oznaczać guzy bez narażania pacjenta na ogólnoustrojową ekspozycję na nanocząsteczki. Fałszywie dodatnie sygnały wynikające z niespecyficznego wiązania nanosond z powierzchniami trzewnymi można wyeliminować, stosując podejście ratiometryczne, w którym jako mieszaninę stosuje się ukierunkowane i nieukierunkowane nanosondy z wyraźnymi sygnaturami Ramana. Procedura jest obecnie nadal ograniczona ze względu na brak komercyjnego systemu kamer do obrazowania ramanowskiego o szerokim polu, który po udostępnieniu pozwoli na zastosowanie tej techniki na sali operacyjnej.

Wprowadzenie

Obrazowanie ramanowskie z nanocząstkami 'powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana' (SERS) okazało się bardzo obiecujące w określaniu zmian chorobowych w różnych ustawieniach i dla wielu różnych typów nowotworów1,2,3,4. Główną zaletą nanocząstek SERS jest ich sygnatura spektralna podobna do odcisku palca, zapewniająca im niekwestionowaną detekcję, która nie jest zakłócana przez biologiczne sygnały tła5. Dodatkowo, intensywność emitowanego sygnału jest dodatkowo wzmacniana za pomocą cząsteczek reporterowych (barwników) o maksymalnych maksimach absorbancji zgodnych z laserem wzbudzającym, co daje początek nanocząstkom "rozpraszania Ramana w rezonansie powierzchniowym o jeszcze większej czułości6,7,8,9,10,11,12.

Jedną z barier, którą należy się zająć, aby przyjąć nanocząstki SE(R)RS13 i wiele innych konstruktów nanocząstek14,15 do użytku klinicznego to sposób ich podawania, ponieważ wstrzyknięcie dożylne powoduje ogólnoustrojowe narażenie na czynnik i wymaga szeroko zakrojonych badań w celu wykluczenia potencjalnych działań niepożądanych. W tym artykule przedstawiamy inny paradygmat oparty na zastosowaniu nanocząstek miejscowo in vivo, bezpośrednio do jamy otrzewnej podczas operacji, a następnie na etapie płukania w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych nanocząstek1. Podejście to jest zgodne z nowatorskimi podejściami terapeutycznymi, które są obecnie badane, a które również wykorzystują miejscowe wkraplanie środków do jamy otrzewnej, zwane hipertermiczną chemioterapią dootrzewnową (HIPEC). W związku z tym sama zasada powinna być stosunkowo łatwa do zintegrowania z klinicznym przepływem pracy. Badaliśmy biodystrybucję nanocząstek po podaniu dootrzewnowym i nie zaobserwowaliśmy żadnej wykrywalnej absorpcji do krążenia ogólnoustrojowego1. Dodatkowo, podejście oparte na aplikacji lokalnej pozwala uniknąć sekwestracji nanocząstek przez układ siateczkowo-śródbłonkowy, dzięki czemu liczba wymaganych nanocząstek jest znacznie zmniejszona. Jednak przy stosowaniu miejscowym nanocząstki funkcjonalizowane przeciwciałami mają tendencję do przylegania do powierzchni trzewnych nawet przy braku celu. W celu zminimalizowania sygnałów fałszywie dodatnich spowodowanych niespecyficzną adhezją nanocząstek, stosujemy podejście ratiometryczne, w którym nanosonda ukierunkowana molekularnie dostarcza specyficzny sygnał, a nieukierunkowana nanosonda kontrolna, o różnym widmie Ramana, odpowiada za niespecyficzne tło16,17. Niedawno zademonstrowaliśmy tę metodologię miejscowo stosowanej spektroskopii ratiometrycznej rezonansu ramanowskiego ze wzmocnieniem powierzchniowym w mysim modelu rozlanego raka jajnika1.

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie dwóch nanosond SERS, jednej celowanej i jednej niespecyficznej, do zastosowania lokalnie w modelach mysich, w celu zobrazowania występowania/nadekspresji biomarkera związanego z rakiem za pomocą ratiometrycznej detekcji dwóch sond za pomocą obrazowania Ramana. W tej pracy jako cel wybrano receptor kwasu foliowego (FR), ponieważ jest to marker regulowany w górę w wielu nowotworach jajnika18,19. Mikroobrazowanie Ramana z nanocząstkami na bazie SERS zostało również zademonstrowane do identyfikacji komórek nowotworowych20. Syntetyzowane są dwa różne "smaki" nanocząstek Ramana, z których każdy wywodzi swój odcisk palca z innego barwnika organicznego. Nanocząstki składają się ze złotego rdzenia w kształcie gwiazdy otoczonego krzemionkową powłoką i wykazują powierzchniowy rezonans plazmonowy przy około 710 nm. Reporter Ramana (barwnik organiczny) osadza się równocześnie z tworzeniem się powłoki krzemionkowej. Wreszcie, w przypadku nanosond ukierunkowanych na FR (αFR-NPs) otoczka krzemionkowa jest sprzężona z przeciwciałami, podczas gdy nieukierunkowane nanosondy (nt-NPs) są pasywowane monowarstwą glikolu polietylenowego (PEG).

Ta technika została z powodzeniem wykorzystana do mapowania mikroskopijnych guzów w mysim modelu ksenoprzeszczepu rozlanego przerzutowego raka jajnika (SKOV-3), demonstrując jej przydatność do stosowania in vivo. Może być również rozszerzony do stosowania w tkankach wycinanych, do fenotypowania guza lub określania marginesu po odmasowaniu, jak pokazano w pokrewnym badaniu21.

Nanosondy SERRS stanowią solidną platformę do tworzenia wielu ukierunkowanych znaczników dla biomarkerów, syntetyzowanych za pomocą prostych reakcji chemicznych, jak schematycznie opisano na rysunku 1. W tym miejscu przedstawiamy protokół syntezy dwóch typów nanosond SERRS (sekcje 1-3), opracowania odpowiedniego mysiego modelu raka jajnika (sekcja 4), podawania nanosond i obrazowania (sekcja 5), a na końcu analizy i wizualizacji danych (sekcja 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011).

1. Synteza rdzenia Gold Nanostar

UWAGA: Złote nanogwiazdy są używane jako rdzenie dla obu wersji nanosond SERRS używanych w tym eksperymencie.

  1. Przygotować 800 ml 60 mM roztworu kwasu askorbinowego (C, 6, H, 8O6) w wodzie dejonizowanej (DI) i 8 ml 20 mM roztworu kwasu tetrachloroaurowego (HAuCl4) w wodzie DI. Schłodzić do 4 °C.
  2. Wykonać ten etap reakcji w temperaturze 4 °C. Umieścić kolbę stożkową zawierającą 800 ml roztworu kwasu askorbinowego na magnetycznej płytce mieszającej i wywołać stały wir. Szybko dodaj 8 ml roztworu kwasu tetrachloroaurowego do wiru. W ciągu kilku sekund uformują się nanogwiazdy, a roztwór przyjmie ciemnoniebieski kolor. W przypadku, gdy kolor w dowolnym momencie stanie się różowy lub fioletowy, co oznacza tworzenie się nanosfer, zawiesinę należy odrzucić i wznowić syntezę.
  3. Wlać zawiesinę nanostar do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przez 20 minut (4 °C, 3,220 x g). Odessać supernatant, pozostawiając około 200 μl roztworu w każdej probówce. Zachowaj ostrożność, aby nie naruszyć osadu nanocząstek na dnie tuby.
    nuta: Supernatant powinien mieć niebieski odcień ze względu na pozostałe zawieszone nanogwiazdy.
  4. Za pomocą mikropipety wymieszać roztwór, aby zawiesić i zebrać nanocząstki z każdej probówki. Część osadu może zostać zagęszczona na dnie probówki i nie ulega ponownemu zawieszeniu nawet przy energicznym pipetowaniu - wyrzuć tę część.
  5. Przenieś zawiesinę nanocząstek do kasety dializacyjnej (MWCO 3,5 kDa) i dializuj przez co najmniej trzy dni w 2 litrach wody demineralizowanej, zmieniając wodę codziennie. Przechowuj nanogwiazdy w dializie w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca z podmianą wody co 3-4 dni.
    nuta: Nanogwiazdy powinny być poddawane dializie do czasu, gdy będzie to konieczne do przeprowadzenia reakcji krzemionkowania, jak opisano w sekcji 2.

2. Formowanie się powłoki krzemionkowej

UWAGA: Syntetyzowane są dwa rodzaje nanosond Ramana. Procedura syntezy jest taka sama dla obu, a jedyną różnicą jest zastosowana cząsteczka reporterowa Ramana (barwnik). W tym eksperymencie użyto nadchloranu IR780 i IR140. Reakcja powinna być zawsze przeprowadzana w plastikowych pojemnikach. Synteza jest wysoce skalowalna i może być dostosowana do pożądanej wymaganej ilości iniekcji. W tym miejscu opisano syntezę średnio seryjną, którą można skalować liniowo do mniejszych lub większych objętości w zależności od potrzeb, przy tych samych stężeniach i czasach reakcji. Reakcje dla dwóch typów nanosond SERRS mogą być przeprowadzane równolegle. Zwróć uwagę, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Sonikacja powinna być przeprowadzana w celu redyspersji granulek nanocząstek po odwirowaniu podczas etapów mycia lub po przechowywaniu nanocząstek przez okres dłuższy niż jedna godzina. Sonikację należy przeprowadzać do momentu, gdy nanocząstki zostaną wyraźnie zawieszone w roztworze, zwykle przez 1 s.

  1. W probówce A (stożkowa probówka o pojemności 50 ml) wymieszaj 10 ml izopropanolu, 500 μl TEOS, 200 μl wody DI i 60 μl barwnika (nadchloran IR780 lub IR140, 20 mM w DMF (dimetyloformamid)).
  2. W probówce B (stożkowa probówka 15 ml) wymieszaj 3 ml etanolu i 200 μl wodorotlenku amonu. Sonikuj nanogwiazdy z kroku 1.4, aby rozproszyć wszelkie klastry w roztworze i dodaj 1,2 ml nanogwiazd do probówki.
    UWAGA: roztwór wodorotlenku amonu jest bardzo lotny i trudny do dokładnego pipetowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie potrzebny, aby ułatwić pipetowanie.
  3. Umieść rurkę A na mieszadle wirowym i wywołaj stały wir. Szybko dodaj zawartość probówki B do wiru i mieszaj przez około 5 sekund. Natychmiast przenieść do wytrząsarki i pozostawić na 15 minut, wstrząsając z prędkością 300 obr./min, w temperaturze pokojowej.
  4. Po 15 minutowej inkubacji wygasić reakcję, dodając etanol w celu napełnienia probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 20 minut w temperaturze 3 220 x g i temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant, pozostawiając około 0,5 ml roztworu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodać 1 ml etanolu i wymieszać pipetą, aby ponownie zawiesić nanocząstki. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przemyć 4 razy etanolem, wirując przy 11 000 x g przez 4 minuty, zasysając supernatant i ponownie zawieszając osad za pomocą ultradźwięków przez około 1 s.
    nuta: Na tym etapie krzemionkowe nanocząstki mogą być funkcjonalizowane, jak opisano w sekcji 3, lub ponownie zawieszone w wodzie DI z dodatkowym etapem mycia, w celu przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.

3. Funkcjonalizacja powierzchni

UWAGA: Nanosondy IR780 SERRS będą sprzężone z przeciwciałami skierowanymi przeciwko receptorowi kwasu foliowego za pomocą środka sieciującego PEG, tworząc αFR-NPs; Nanosondy sterujące IR140 SERRS będą sprzężone z pasywującą monowarstwą PEG dla nt-NPs. Oba aromaty powstają w wyniku reakcji tiol-maleimid w oddzielnych, ale równoległych reakcjach.

  1. Przepłukać nanocząstki dwukrotnie, wirując przy 11 000 x g przez 4 minuty, odsysając supernatant i ponownie zawieszając osad w 1 ml etanolu za pomocą ultradźwięków. Powtórz etap prania jeszcze raz, ale ponownie rozpuść się w 1 ml 85% etanolu, 10% 3-MPTMS (3-merkaptopropylotrimetoksysilanu) i 5% wody DI. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny w celu wprowadzenia tioli na powierzchnię cząstek.
  2. Przepłukać nanocząstki funkcjonalizowane tiolem przez odwirowanie przy 11 000 x g przez 4 minuty, zasysanie supernatantu i ponowne zawieszenie osadu za pomocą ultradźwięków, dwa razy w etanolu, dwa razy w DI, a na koniec w buforze HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (10 mM, pH 7,1) i odstawić.
    nuta: Należy stosować bufor MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy) lub HEPES. o wyższym zasoleniu, takie jak PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), mogą indukować agregację nanocząstek.
  3. W przypadku funkcjonalizowanych przeciwciałami αFR-NPs, należy zareagować 200 μg przeciwciał (klon przeciwciała wiążącego białko antyfolianów [LK26]) z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym środka sieciującego PEG (poli(glikol etylenowy)(N-hydroksysukcynimid 5-pentanian) N′-(3-maleimidopropionylo)aminoetan (CAS: 851040-94-3), w dimetylosulfotlenku (DMSO)) w 500 μl buforu MES (10 mM, pH 7,1) przez 30 min.
  4. Usunąć nadmiar środka sieciującego i skoncentrować przeciwciało poprzez odwirowanie roztworu przeciwciało-PEG w filtrze odśrodkowym (MWCO 100 kDa). W przypadku filtrów odśrodkowych stosowanych w tym badaniu należy przeprowadzić wirowanie przez 10 minut w temperaturze 14 000 x g i temperaturze 23 °C. Odzyskać sprzężone przeciwciała w świeżej probówce, odwracając filtr i odwirowując przy 1 000 x g przez 2 minuty.
  5. Odpipetować nanocząstki IR780 z kroku 3.2 do probówki z przeciwciałami i zamieszać pipetą, aby wymieszać. Inkubować mieszaninę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc w celu wytworzenia αFR-NPs.
  6. Aby utworzyć nt-NPs, dodaj 1% w/v metoksy-zakończony (m)PEG5000-maleimidem (CAS: 99126-64-4) rozpuszczony w DMSO do nanocząstek IR140 SERRS z kroku 3.2 i pozwól im reagować w 500 μl buforze MES (10 mM, pH 7,1) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc.
  7. W przypadku podawania myszom (sekcja 5) należy odwirować oba aromaty nanosondy przy 11 000 x g przez 4 minuty, odessać supernatant w celu usunięcia roztworu z wolnymi nieprzereagowanymi przeciwciałami/PEG i ponownie rozproszyć każdy smak w buforze MES (10 mM, pH 7,1) przy stężeniu 600 pM. Podczas ponownego zawieszania nanocząstek należy zminimalizować niepotrzebną ekspozycję na ultradźwięki, aby zapobiec denaturacji przeciwciała.

4. Rozwój modelu myszy

  1. Ustalić stałą hodowlę linii komórkowej ludzkiego gruczolakoraka jajnika (SKOV-3). Opcjonalnie, aby umożliwić monitorowanie za pomocą bioluminescencji/fluorescencji, należy użyć transfekowanych komórek SKOV-3 Luc+/GFP+. Hodowla komórek w pożywce RPMI (Roswell Park Memorial Institute) z 10% płodową surowicą cielęcą i pasażem dwa razy w tygodniu. Do wstrzykiwań inkubować komórki z 0,25% trypsyny/0,05% EDTA przez 3 minuty w celu odłączenia, a następnie przemyć i ponownie zawiesić w PBS w temperaturze 2 x 106 komórek/100 μl.
  2. Aby ustalić model mikroprzerzutów do jajników, wstrzyknij 200 μl zawieszonych komórek SKOV-3 dootrzewnowo samicom myszy atymicznym (myszy FOXn1nu/FOXn1nu, 6-8 tygodni). Rozsiane rozsiew otrzewnowej nastąpi po około 4 tygodniach. W przypadku stosowania komórek SKOV-3 Luc+ wzrost guza można monitorować za pomocą bioluminescencji, podając 2 mg lucyferyny chrząszcza w 50 μl PBS poprzez wstrzyknięcie zaoczodołowe.

5. Wstrzykiwanie i obrazowanie nanosondy

  1. Przygotować nanosondy (αFR-NPs i nt-NPs) zgodnie z opisem w sekcjach 1-3 i wymieszać w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie 300 pM każdego typu w buforze MES (10 mM, pH 7,1). Opcjonalnie należy przygotować wzorce referencyjne 30 pM każdego z aromatów nanosondy w małych (100 μL) stożkowych probówkach.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 1 ml zawiesiny nanocząsteczek każdej myszy i delikatnie masować brzuch, aby rozprowadzić nanocząsteczki w jamie otrzewnej. Umieść mysz z powrotem w obudowie. Po 25 lub więcej minutach poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 .
  3. Przymocuj mysz na platformie operacyjnej, w pozycji leżącej na plecach (w przypadku obrazowania całego brzucha platforma musi być montowana na pionowym stoliku mikroskopu).
    1. Za pomocą ząbkowanych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń skórę, aby odsłonić otrzewną i wykonaj duże nacięcie strzałkowe (o długości od 2 do 3 cm), aby odsłonić cały brzuch. Przymocuj płaty otrzewnowe do platformy. Umyj wnętrze jamy otrzewnej co najmniej 60 ml PBS za pomocą plastikowej butelki ze spryskiwaczem.
      nuta: Aby umożliwić niezakłócone obrazowanie całej jamy brzusznej, jelita muszą zostać zmobilizowane lub wycięte. W celu wycięcia należy wykonać wycięcie z podwiązaniem naczyń krezkowych w celu zmniejszenia krwotoku do jamy brzusznej.
    2. Alternatywnie, aby zobrazować określone narządy, wyciąć je po umyciu PBS i umieścić na szkiełku mikroskopowym.
  4. Przenieś platformę lub szkiełko do mikrospektrofotometru Ramana z pionową konfiguracją optyczną i zmotoryzowanym stolikiem do obrazowania; użyj komercyjnego systemu z laserem diodowym o mocy 300 mW i długości fali 785 nm, z siatką 1200 rowków na mm, wyśrodkowaną na 1 115 cm-1.
    1. Skoncentruj się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki światła białego, parafokalnej z laserem Ramana. Wybierz obszar, który ma być obrazowany, i żądaną rozdzielczość; W tym raporcie zastosowano tryb szybkiej akwizycji (widma uzyskane przy ciągłym oświetleniu laserowym przy stale poruszającym się stoliku mikroskopu, z efektywną rozdzielczością przestrzenną 14,2 μm na 200 μm; przy 5-krotnym powiększeniu, mocy 100 mW przy obiektywie i <100 ms ekspozycji na punkt).
      nuta: W razie potrzeby probówki z referencyjnymi nanosondami z kroku 5.1 można umieścić w obrazowanym obszarze, aby zapewnić wewnętrzne wzorce referencyjne do późniejszej analizy. Upewnij się, że żadne zewnętrzne źródła światła inne niż laser nie docierają do celu.
  5. Opcjonalnie przygotować próbkę do przetwarzania histologicznego i walidacji przez utrwalenie w 4% paraformaldehydzie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać PBS w temperaturze 4 °C przez 15 minut co najmniej dwa razy. Przechowywać próbkę w 70% etanolu w wodzie do czasu standardowego przetwarzania histologicznego i zatopienia parafiny. W celu walidacji histologicznej guzów, skrawki (o grubości 5 μm) z różnych głębokości bloku parafinowego można wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E).

6. Przetwarzanie i wizualizacja danych

UWAGA: Wszystkie dane były przetwarzane za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opracowanego przez nas przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Wszystkie używane funkcje mają ogólne odpowiedniki dostępne w innych środowiskach obliczeniowych.

  1. Uzyskaj widma referencyjne dla dwóch smaków, badając czyste zawiesiny każdego z nich. Widma referencyjne można uzyskać na podstawie skanów punktowych nanosond, obrazowania nanosond w płytkach studzienkowych lub poprzez włączenie wewnętrznych odniesień do skanów eksperymentalnych w probówkach referencyjnych (patrz krok 5.1).
  2. Wstępnie przetworzyć widma odniesienia, stosując odejmowanie linii bazowej (filtr Whittakera, λ = 200), normalizację przez obszar pod krzywą i filtr pochodnej Savitzky'ego-Golaya (dopasowanie wielomianu drugiego stopnia, pochodna pierwszego rzędu, szerokość = 15 kroków). Te wstępnie przetworzone widma posłużą jako odniesienia dla klasycznego modelu najmniejszych kwadratów (CLS).
  3. Wstępnie przetworzyć dane próbki z obrazu w taki sam sposób, jak widma referencyjne. Uzyskaj wyniki CLS dla każdego punktu próbkowania przy użyciu dostępnego algorytmu CLS. Bezpośrednie wyniki CLS (DCLS) to po prostu współrzędne rzutu widma próbki na przestrzeń liniową zdefiniowaną przez uogólnioną macierz odwrotną (odwrotność Moore'a-Penrose'a) widm odniesienia. Można użyć innych algorytmów dopasowania (nieujemne metody najmniejszych kwadratów, częściowe metody najmniejszych kwadratów lub inne).
    nuta: Niektóre algorytmy dopasowania mogą prowadzić do negatywnych ocen, które w tym kontekście nie są fizyczne. W takim przypadku można ustawić próg, aby wykluczyć ujemne wyniki, lub zamiast tego zastosować ograniczony nieujemny algorytm najmniejszych kwadratów.
  4. Obliczyć punktowy stosunek wyników w punkcie odniesienia dla docelowych nanocząstek (wynikiαFR) w stosunku do wyników w punkcie odniesienia dla nanocząstek, na które nie były docelowe (wynikint). Jeśli wyniki są nieujemne, stosunek można wyrazić w sposób logarytmiczny:
    R = log10(WynikiαFR/ Wynikint).
    Stosunek R najlepiej jest wyświetlić w rozbieżnej skali kolorów wyśrodkowanej na zero, aby wyrazić względną obfitość sond w rzędach wielkości. Uzyskany obraz można nałożyć na obraz próbki w świetle białym, aby ujawnić obszary nadekspresji receptora kwasu foliowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celach kontroli jakości nanocząstki mogą być charakteryzowane za pomocą różnych metod podczas procesu syntezy, w tym TEM, DLS, analizy śledzenia nanocząstek oraz spektroskopii absorbancji UV/Vis, jak pokazano na Ryc. 2.

W ten sposób można zweryfikować rozmiar rdzenia złotej nanogwiazdy (opisany w sekcji 1), formowanie się otoczki krzemionkowej (sekcja 2) oraz następującą po niej funkcjonalizację p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zawiera instrukcję syntezy dwóch "smaków" nanosond SERRS i ich zastosowania u myszy do obrazowania Ramana guza jajnika z nadekspresją receptora kwasu foliowego, przy użyciu algorytmu ratiometrycznego. Główną przewagą obrazowania ramanowskiego nad innymi technikami obrazowania optycznego (np. fluorescencji) jest wysoka specyficzność sygnału nanosondy, której nie można pomylić z żadnymi sygnałami pochodzenia biologicznego. W tym przykładzie obrazowania ramanowskiego nanocząstki nie są podawane dożyln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

• M.F.K. jest wymieniony jako wynalazca w kilku wydanych lub oczekujących na rozpatrzenie wnioskach patentowych związanych z tą pracą. M.F.K. jest współzałożycielem firmy RIO Imaging, Inc., której celem jest translacja nanocząstek SERRS na praktyki kliniczne.

• Autorzy oświadczają, że nie mają innych konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Następujące źródła finansowania (dla M.F.K.) są potwierdzone: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 i K08 CA16396; Nagroda Damona Runyona-Rachleffa za innowacyjność DRR-29-14, Nagroda Pershing Square Sohn przyznana przez Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance oraz MSKCC Center for Molecular Imaging & Nanotechnology (CMINT) oraz granty na rozwój technologii. Podziękowania są również rozszerzone na wsparcie w postaci dotacji udzielone przez MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa odczynnika
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
3-MPTMSSigma-Aldrich175617
Ammonium Wodorotlenek (28%)Sigma-Aldrich338818
Przeciwciało przeciwko receptorowi folianowemu [LK26] AbCamab3361
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich276855
Dimetylosulfotlenek (bezwodny)Sigma-Aldrich276855
EtanolSigma-Aldrich792780
IR140Sigma-Aldrich260932
IR780 nadchloran*Sigma-Aldrich576409wycofane*
IzopropanolSigma-Aldrich650447
N.N.DimetyloformamidSigma-Aldrich227056
PEG sieciującySigma-Aldrich757853
PEG-maleimidSigma-Aldrich900339
Kwas tetrachloroaurowySigma-Aldrich244597
OrtokrzemiantetraetyluSigma-Aldrich86578
*IR792Sigma-Aldrich425982*Alternatywny
Nazwa urządzenia
kaseta dializacyjna (3,500 MWCO)ThermoFIsher87724
Filtry odśrodkoweMilliporeUFC510096
inVia konfokalny mikroskop RamanaRenishaw
MATLAB (v2014b)Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)Badania
wektorów własnych

Bibliografia

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570(2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277(2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33(2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008(2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ratiometria nanosond SERRSwykrywanie raka jajnikasynteza nanocz stekfunkcjonalizacja przeciwcia amimikrofotospektrometr Ramanowskiklasyczna metoda najmniejszych kwadrat wobrazowanie jamy otrzewnejwizualizacja przerzut w mikroskopowych

Powiązane artykuły