Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

DOI:

10.3791/58390

⸱

21 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciągły rozwój immunoonkologii wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów immunologii nowotworów. Analiza immunoprofilowa próbek tkanek z biopsji utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) stała się kluczowym narzędziem do zrozumienia złożoności immunologii nowotworów i odkrycia nowych biomarkerów predykcyjnych dla immunoterapii nowotworów. Analiza immunoprofilowania tkanek wymaga oceny złożonych markerów, w tym subpopulacji komórek zapalnych i immunologicznych punktów kontrolnych, w mikrośrodowisku guza. Pojawienie się nowatorskich metod immunohistochemicznych multipleksowych pozwala na bardziej wydajną analizę wieloparametryczną pojedynczych skrawków tkanek niż w przypadku standardowej immunohistochemii monopleksowej (IHC). Jedna z dostępnych na rynku metod immunofluorescencji multipleksowej (IF) opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidowego i w połączeniu z wielospektralną analizą mikroskopową pozwala na lepszą separację sygnałów różnych markerów w tkance. Metodologia ta jest zgodna z użyciem niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych, które zostały zoptymalizowane pod kątem standardowego IHC na próbkach tkanek FFPE. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy zautomatyzowany protokół, który umożliwia multipleksowe znakowanie IF próbek tkanek raka za pomocą sześciomarkerowego panelu przeciwciał multipleksowych składającego się z cytokeratyn PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 i AE1 / AE3 z 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem jako barwnikiem przeciwbarwiącym komórkę jądrową. Protokół panelu multipleksowego jest zoptymalizowany w automatycznym barwiarce IHC pod kątem czasu barwienia krótszego niż w przypadku protokołu ręcznego i może być bezpośrednio stosowany i dostosowywany przez dowolnego badacza laboratoryjnego do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek ludzkich FFPE. Opisano również kilka elementów sterujących i narzędzi, w tym metodę kontroli upuszczania do precyzyjnej kontroli jakości nowego panelu IF multipleksu, które są przydatne do optymalizacji i walidacji techniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza immunoprofilowania próbek tkanek nowotworowych FFPE stała się istotnym elementem badań immunoonkologicznych, szczególnie w celu odkrycia i walidacji nowych biomarkerów predykcyjnych dla immunoterapii nowotworów w kontekście badań klinicznych1,2. Chromogenne IHC, wykorzystujące chemiczne chromogeny, takie jak diaminobenzydyna, pozostaje standardową techniką w patologii diagnostycznej do immunoznakowania tkanek biopsyjnych3. Standardowy IHC może być również stosowany do immunoprofilowania tkanek nowotworowych, w tym do ilościowego oznaczania subpopulacji limfocytów związanych z nowotworem oraz oceny poziomów ekspresji immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak ligand programowanej śmierci komórki 1 (PD-L1)4,5. Standardowy IHC jest jednak ograniczony, ponieważ tylko jeden antygen może być znakowany na każdy wycinek tkanki. Ponieważ badania immunoprofilowania zazwyczaj wymagają analizy połączonej ekspresji kilku markerów, zastosowanie standardowego IHC wymagałoby barwienia wielu odcinków tkanki, z których każda jest barwiona jednym markerem, a zatem byłoby znacznie ograniczone do analizy małych próbek tkanek, takich jak biopsje gruboigłowe. Standardowe metody IHC są również ograniczone do oceny markerów, które są współwyrażane przez różne populacje komórek, jak to ma miejsce w przypadku markerów immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak PD-L1, który ulega ekspresji zarówno przez makrofagi związane z nowotworem, jak i komórki rakowe. Ograniczenie to zostało zgłoszone na przykład w przypadku stosowania przez patologów standardowego monopleksu IHC do analizy ilościowej markera IHC wyrażanego przez różne typy komórek6. Rozwój multipleksowych technik chromogennych IHC wykorzystujących różne kolorowe chromogeny na tym samym wycinku tkanki stanowi postęp w stosunku do standardowej metody monopleksowej IHC, 7, chociaż pozostają one ograniczone przez znakowanie immunologiczne zaledwie kilku markerów, a także stanowią ważne wyzwanie techniczne dla właściwej oceny markerów wyrażonych w tych samych subkomórkowych przedziałach tych samych populacji komórek.

Wyżej wymienione zastrzeżenia dotyczące dostępności tkanek z próbek klinicznych, jak również ograniczenia technik multipleksowych chromogenicznych IHC, spowodowały potrzebę opracowania ulepszonych metod multipleksowych dla badań immunoonkologicznych opartych na znakowaniu fluorescencyjnym w połączeniu z systemami obrazowania, które mogą skutecznie oddzielać sygnały wielu fluoroforów z tego samego szkiełka. Jedna z takich technik opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidu (TSA) w połączeniu z obrazowaniem za pomocą mikroskopii wielospektralnej w celu efektywnej separacji kolorów8. Dostępny na rynku zestaw oparty na TSA wykorzystuje fluorofory zoptymalizowane pod kątem obrazowania wielospektralnego8 (patrz Tabela Materiałów). Krytyczną zaletą tego systemu jest jego kompatybilność z tymi samymi nieznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które zostały już zwalidowane i zoptymalizowane pod kątem standardowego chromogennego IHC9,10,11. Pozwala to nie tylko na szybszą optymalizację, ale także na elastyczność w optymalizacji i modyfikacjach paneli o nowe cele. Co więcej, metoda TSA immunofluorescencji multipleksowej (mIF) może być zoptymalizowana pod kątem dostępnych na rynku zautomatyzowanych systemów barwienia IHC, co pozwala na proste przejście z monopleksowego chromogenicznego IHC na mIF.

Tutaj prezentujemy protokół dla panelu mIF do badań immunoonkologicznych, który opiera się na automatycznym barwieniu mIF TSA i wykorzystuje skaner wielospektralny do obrazowania. Protokół ten może być dostosowywany i modyfikowany przez każdego użytkownika laboratoryjnego mającego dostęp do opisanego oprzyrządowania i odczynników. Protokół zawiera panel sześciu podstawowych przeciwciał do immunoprofilowania raków: PD-L1, PD-1, CD68 (jako marker panmakrofagów), CD8 (komórki T-cytotoksyczne), Ki-67 i AE1/AE3 (pan-cytokeratyna, stosowana jako marker nabłonkowy do identyfikacji komórek rakowych). Niedawne badanie opisuje optymalizację ręcznego protokołu TSA mIF przy użyciu chromogennego IHC jako standardowego odniesienia do walidacji barwienia multipleksowego12. Przedstawiona tu zaktualizowana metoda została opracowana przy użyciu dostępnego na rynku, siedmiokolorowego zestawu TSA zoptymalizowanego w automatycznym barwieniu, drastycznie skracającego czas barwienia z 3-5 dni do 14 godzin, przy jednoczesnej poprawie konsystencji barwienia. Oprócz przedstawionego tutaj szczegółowego protokołu głównego, sekcja Materiały uzupełniające zawiera metodę "kontroli zrzutu", dodatkowy proces kontroli jakości w celu oceny nowego panelu mIF, a także uwagi techniczne dotyczące optymalizacji, rozwiązywania problemów i opracowywania nowych paneli multipleksowych, aby pomóc użytkownikowi laboratorium w skonfigurowaniu i optymalizacji metody mIF TSA dla niestandardowych paneli mIF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół opisuje, jak przeprowadzić immunoprofilowanie panelu mIF za pomocą TSA dla sześciu przeciwciał (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 i AE1/AE3) na automatycznym barwniku (patrz Tabela materiałów). W protokole opisano również, w jaki sposób przeprowadzać kontrolę upuszczania w celu kontroli jakości nowego panelu mIF (patrz Materiały uzupełniające). W tym protokole barwienie przeprowadza się za pomocą ośmiu niebarwionych szkiełek FFPE z ludzkiego migdałka (kontrola pozytywna) i ośmiu niebarwionych szkiełek z ludzkiego gruczolakoraka płuc. Pierwszy szkiełko służy do pełnego barwienia multipleksowego wszystkimi sześcioma markerami, drugie szkiełko do kontroli izotypu, w której nie stosuje się przeciwciał pierwszorzędowych, a pozostałe sześć szkiełek do kontroli kropli (patrz Materiały uzupełniające). Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie dodatkowej kontroli autofluorescencji tkankowej, która zawsze powinna być uwzględniona w badaniu multipleksowym (patrz Materiały uzupełniające). Jednak badacze mogą stosować inne typy nowotworów i grupy kontrolne zgodnie z własnymi celami projektu. Użytkownicy laboratoriów, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia z metodą mIF TSA i technikami skanera wielospektralnego, powinni zapoznać się z Przewodnikiem Rozwoju Multiplex IHC (dostępnym online pod adresem http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Chociaż ten przewodnik opisuje protokół ręczny, stanowi również dobre wprowadzenie do metody barwienia mIF. Wszystkie skrawki tkanek wykorzystane w tym protokole zostały zanonimizowane i zatwierdzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Próbki tkanek

  1. Należy wybrać próbkę migdałków ludzkich FFPE zawierającą przerost limfoidalny, która ma być wykorzystana jako kontrola pozytywna, oraz próbkę ludzkiego gruczolakoraka płuc FFPE, o której wiadomo, że jest PD-L1-dodatnia. Przejrzyj slajdy hematoksyliny i eozyny (H&E) wybranych bloków raka płuc, aby potwierdzić obecność guza. Ważne jest, aby unikać guzów z licznymi obszarami martwicy, ponieważ może to zwiększyć niespecyficzne barwienie tła.
    nuta: W celu tej optymalizacji należy unikać stosowania bloków parafinowych, które były przechowywane przez 10 lat lub dłużej oraz tkanek o wysuszonym wyglądzie w bloku parafinowym (skonsultuj się z technikiem histologiem).
  2. Za pomocą mikrotomu wytnij 10 kolejnych odcinków szeregowych z każdego bloku o grubości 4 μm. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanym szkiełku szkiełkowym używanym do IHC, po jednej sekcji na prowadnicę.
    nuta: Sekcje muszą być montowane idealnie płasko bez zmarszczek, ponieważ zmarszczki mogą generować artefakty barwiące. Ponumeruj slajdy sekcji szeregowych od 1 do 10.
  3. Przygotuj nowy slajd BHP na pierwszej sekcji. Przejrzyj szkiełko H&E z pomocą patologa, aby potwierdzić obecność tkanki migdałków lub guza płuc pozostającego w bloku.
    nuta: Ten slajd H&E może pomóc później w wyborze obszarów zainteresowania do analizy wielospektralnej i fenotypowania.
  4. Przechowywać niepoplamione skrawki w plastikowym pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.

2. Tworzenie nowego programu do barwienia mIF na automatycznym barwieniu: Rejestracja odczynników

UWAGA: Odczynniki muszą zostać dodane do listy odczynników w oprogramowaniu do automatycznego barwienia, zanim będą dostępne do użycia w protokołach. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat modelu automatycznego barwienia i wersji oprogramowania.

  1. Kliknij kartę Odczynniki w oprogramowaniu do automatycznego barwienia. Kliknij przycisk Dodaj, aby wyznaczyć nowy odczynnik. Wprowadź nazwę (np. "Odczynnik 520 TSA") i skróconą nazwę (np. "520 TSA"), zwracając uwagę, że maksymalnie jest osiem znaków. Z menu rozwijanego wybierz opcję Pomocniczy i ustaw dostawcę. Nie zmieniaj Pojedynczej/Podwójnej Bejcy z Pojedynczej/Sekwencyjnej DS. Ustaw domyślny protokół barwienia na Protokół F. Ustaw domyślny protokół HIER na ER1 20.
  2. Zapisz nowy odczynnik i powtórz krok 2.1 dla wszystkich odczynników wymienionych w Tabeli 1.

3. Automatyczna plama: Rejestracja pojemników

  1. Napisz nazwę odczynnika, który ma być użyty, na boku każdego pojemnika. Zeskanuj kod kreskowy z boku. W wyskakującym okienku wybierz odpowiedni odczynnik z listy. Wybierz datę wygaśnięcia i zapisz.
  2. Powtórzyć procedurę opisaną w kroku 3.1 dla wszystkich odczynników wymienionych w Tabeli 1.
  3. Zarejestruj Otwarty Zestaw Badawczy. Zeskanuj oba kody kreskowe znajdujące się z boku zestawu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Nazwij zestaw "Multiplex Research Kit 1". Zarejestruj 1x sól fizjologiczną buforowaną tris(hydroksymetylo)aminometanem (Tris) jako część tego zestawu (Tabela 1).

4. Automatyczny Stainer: Tworzenie programu protokołu mIF

  1. Podstawowy protokół multipleksowy jest fabrycznie załadowany nazwą Opal 7 Multiplex na nowych automatycznych barwierkach (patrz model i wersja oprogramowania w Tabeli materiałów). Zlokalizuj protokół, filtrując pod kątem "wszystkich" zamiast "preferowanych" na ekranie protokołu. Jeśli protokół podstawowy nie jest obecny, zaktualizuj oprogramowanie automatycznego barwienia z pomocą producenta.
  2. Wszelkie modyfikacje powinny być dokonywane na kopiach oryginalnego protokołu. Przed wprowadzeniem zmian zapisz oryginał i utwórz kopię, klikając kartę Protokoły, a następnie klikając prawym przyciskiem myszy protokół Opal 7 Multiplex i wybierając opcję Kopiuj.
  3. Zmień nazwę na 7 Protokół multipleksu 1 w nowym oknie i wybierz zakładkę powiązaną z właściwym urządzeniem (model podłogowy lub stołowy). Zgodność z protokołem w tabeli uzupełniającej S1. Kliknij Dodaj odczynnik, aby dodać 10-minutowy krok hamowania peroksydazy (nie jest częścią standardowego protokołu) i wybierz inhibitor peroksydazy jako odczynnik.
  4. Upewnij się, że kroki blokowania korzystają z buforu blokowania infrastruktury kluczy publicznych. Upewnij się, że każde przeciwciało pierwszorzędowe odnosi się do odpowiedniego odczynnika, że etapy przeciwciał drugorzędowych wykorzystują polimer HRP i że wykorzystuje się spektralny 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) dostarczony z zestawem do automatyzacji wielospektralnej. Potwierdź wszystkie wybory, sprawdzając odczynnik, który został wyznaczony dla każdego odpowiedniego kroku w menu rozwijanym na ekranie protokołu.

5. Automatyczne barwienie: dodanie kontroli upuszczania i protokołu kontroli izotypu

  1. Skopiuj nazwę 7 Multiplex protocol 1 i zmień ją na 7 Multiplex protocol 1 CD68 DROP. Zmień odczynnik przeciwciała CD68 na Mouse IgG i zapisz protokół.
  2. Stwórz sześć kolejnych nowych protokołów, po jednym dla każdej kontroli kropli i jeden dla pełnej kontroli izotypu (zmieniając wszystkie przeciwciała na odpowiednie izotypy) w ten sam sposób.

6. Automatyczna Stainer: Protokół Przygotowania Preparatu

  1. Skopiuj protokół wstępnego barwienia *Piecz i odwoskuj i zmień nazwę tego protokołu na Multispectral Bake and Dewax 2 h.
  2. Dostosować protokół tak, aby odpowiadał odczynnikom przedstawionym w Tabeli 2. Piec szkiełka przez 2 godziny w temperaturze 60 °C. Odwoskowywać przez 30 s w temperaturze 72 °C.

7. Automatyczne barwienie: Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj jeden zestaw do wykrywania badań. Jeden odczynnik musi być na stałe powiązany z tym zestawem, więc napełnij otwarty pojemnik o pojemności 30 ml oznaczony na 1x sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) 1x TBS i umieść go w pozycji 1 (najdalej od uchwytu) w zestawie do wykrywania badań oznaczonym Multiplex Research Kit 1. Ten odczynnik będzie na stałe powiązany z tym zestawem badawczym i nie może zmienić pozycji do wykorzystania w przyszłości.
  2. Oznacz dwa otwarte pojemniki o pojemności 30 ml jako Multispectral Block i Multispectral Secondary. Napełnij pojemnik Multispectral Block 30 ml buforu blokującego/rozcieńczalnika przeciwciał z zestawu do barwienia multispektralnego. Napełnij pojemnik Multispectral Secondary 30 ml polimeru przeciwciała wtórnego przeciwko myszy/królikowi z zestawu do barwienia wielospektralnego.
  3. Przygotuj dziesięć otwartych pojemników o pojemności 7 ml. Wymagana objętość w mikrolitrach to 600 + (150 x [liczba szkiełek]). W tym przypadku każde przeciwciało zostanie nałożone na 12 szkiełek (sześć migdałków i sześć płuc). Oznakowanie i objętości wszystkich pojemników są oznaczone w tabeli 3.
  4. Do każdej probówki z przeciwciałem należy najpierw dodać rozcieńczalnik przeciwciał, a następnie skoncentrowane przeciwciało pierwszorzędowe w objętościach wskazanych w tabeli 3. Wymieszać delikatnie pipetując.
  5. Przygotuj otwarty pojemnik o pojemności 7 ml na DAPI, używając czterech kropli koncentratu DAPI na mililitr podwójnie destylowanej wody; w sumie 16 zostanie zabarwionych DAPI (600 + [150 x 16] = 3,000 μL). Dodaj 3 ml podwójnie destylowanej wody plus 12 kropli spektralnego DAPI do pojemnika. Przygotuj świeże DAPI dla każdego przebiegu.
  6. Przygotuj otwarty pojemnik o pojemności 7 ml na inhibitor peroksydazy. Wszystkie 16 szkiełek zostanie potraktowanych inhibitorem peroksydazy (600 + [150 x 16] = 3,000 μL). Dodaj 3 ml bloku peroksydazy do pojemnika.
  7. Przed przygotowaniem stężeń roboczych fluorów należy ponownie zamieszać wszystkie liofilizowane fluory, dodając 75 μl dimetylosulfotlenku do każdej lampki fluorowej dostarczonej przez producenta. Wymieszać pipetując. To jest kolba fluorowa TSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować sześć pojemników do miareczkowania, po jednym dla każdego fluoru. Wymagana objętość w mikrolitrach wynosi 350 + (150 x [liczba szkiełek]). W tym przypadku każdy fluor zostanie zastosowany do 16 szkiełek (osiem migdałków i osiem płuc). Oznakowanie i objętości wszystkich pojemników są oznaczone w tabeli 4.
  9. Gdy wszystkie odczynniki zostaną zarejestrowane i przygotowane, umieść każdy pojemnik w dowolnym miejscu na stojaku i załaduj wszystkie odczynniki na automatyczny barwnik. Sonda potwierdzi objętość każdego odczynnika.

8. Automatyczny Stainer: Konfiguracja próbki i barwienie wielospektralne

  1. W oprogramowaniu do automatycznego barwienia kliknij opcję Slide Setup (Ustawienia suwaka) u góry ekranu. Kliknij przycisk Dodaj badanie. Wypełnij wyskakujące okienko identyfikatorem badania, nazwą badania i komentarzami.
    1. Z listy rozwijanej należy wybrać imię i nazwisko badacza przeprowadzającego proces barwienia. Pozostaw objętość dozowania na poziomie 150 μl. Wybierz Multispektralny Dewax do protokołu przygotowania. Kliknij przycisk OK i dodaj slajd. W obszarze Komentarze wpisz "Multiplex 1 Lung 123ABC". Wypełnij następujące pola zgodnie ze wskazaniami: Typ tkanki = Badana tkanka; Objętość dozowania = 150 μL; Tryb barwienia = Pojedynczy, Rutynowy; Znacznik = Negatywny; Barwienie = Wpisz "7 Multiplex Protocol 1"; Przygotowanie = Pieczenie Multispektralne, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min z ER1.
  2. Kliknij przycisk Dodaj slajd i zmień komentarze oraz protokół, aby dodać slajdy kontrolne upuszczania i suwak kontrolny izotypu. Gdy wszystkie slajdy zostaną dodane do badania, zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj etykiety. Zastosuj etykiety do odpowiedniego obszaru etykiety na każdym slajdzie.
  3. Załaduj szkiełka do stojaków, nałóż płytki przykrywające we właściwej orientacji, włóż kosze do automatycznego bejcowania i opuść tace. Urządzenie zeskanuje etykiety slajdów.
  4. Gdy wszystkie preparaty i odczynniki zostaną zeskanowane i zmierzone. Przycisk uruchamiania (►) stanie się aktywny. Jeśli autostainer wykryje jakiekolwiek błędy, takie jak niewystarczająca objętość odczynnika, przy tacy, której dotyczy problem, pojawi się żółty symbol ostrzegawczy. Jeśli wystąpi błąd, kliknij prawym przyciskiem myszy symbol ostrzeżenia i usuń błąd.
  5. Rozpocznij barwienie natychmiast lub zaplanuj opóźniony start. Protokół trwa około 14 godzin. nuta: Upewnij się, że protokół zostanie zakończony w momencie, gdy szkiełka można natychmiast wyjąć, ponieważ mycie po wyjęciu może wpłynąć na wyniki barwienia.

9. Szkiełko nakrywkowe preparatów wielospektralnych

  1. Wyjmij szkiełka z automatycznego barwiarza i przechowuj je w stojaku zanurzonym w 1x TBS.
  2. Próbki należy zamontować za pomocą szkiełek nakrywkowych nr 1,5 i 15 μl materiału montażowego (patrz tabela materiałów). Usuń wszelkie pęcherzyki, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe końcówką pipety.
  3. Pozostaw szkiełka do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym. Nieutwardzone preparaty można natychmiast zeskanować przy ostrożnym obchodzeniu się z nimi.

10. Skaner wielospektralny

  1. Włącz skaner multispektralny i jego komputer (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać informacje o modelu i oprogramowaniu). Uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Otwórz przednie drzwiczki skanera multispektralnego, naciskając przycisk dotykowy z przodu urządzenia. Każdy nośnik sprężynowy w skanerze mieści cztery szkiełka. Załaduj wszystkie slajdy do nośników i zapisz zamówienie przed załadowaniem nośników do urządzenia.
  2. Wybierz opcję Edit Protocol (Edytuj protokół) i kliknij przycisk New (Nowy...), a następnie utwórz nazwę protokołu Multiplex Panel 1 (Panel multipleksu 1) i Drop Controls (Kontrolki upuść). Utwórz nazwę badania Multiplex Panel Development, kliknij przycisk Create Protocol (Utwórz protokół) i wpisz Overview Scan Filter DAPI; następnie wybierz Skanowanie całego slajdu i Rozdzielczość pikseli 0,50 μm (20X). Wszystkie filtry i pasma powinny być reprezentowane. Jeśli nie, kliknij przycisk Edytuj filtry i pasma, zaznacz wszystkie pięć filtrów (DAPI, FITC, CY3, Texas Red i CY5), a następnie kliknij przycisk Edytuj ekspozycje.
  3. Załaduj nośnik, wybierając nośnika z pełnym multipleksem gruczolakoraka płuc. Wybierz odpowiedni slajd za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Ustaw ostrość tkanki ręcznie lub za pomocą autofokusa. Przejdź do dowolnego obszaru z akceptowalnym barwieniem DAPI i kliknij opcję Automatyczna ekspozycja, aby ustawić ekspozycję w milisekundach (0–2,000 ms).
  4. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich pięciu zestawów filtrów zarówno w kolumnach Whole Scan, jak i MSI Region. Pamiętaj, aby przejść do obszaru z dopuszczalnym zabarwieniem i ponownie ustawić ostrość mikroskopu przed ustawieniem ekspozycji dla każdego filtra i poziomu powiększenia. Automatyczna ekspozycja dla wszystkich pięciu filtrów w 20-krotnym ogólnym skanie i 20-krotnym obrazowaniu wielospektralnym (MSI) w obszarach wielospektralnych. Wybierz rozdzielczość piksela 0,50 μm (20x). Zapisz protokół i kliknij Wstecz, aby powrócić do ekranu głównego oprogramowania Vectra; następnie kliknij opcję Skanuj slajdy.
  5. Otwórz interfejs dla każdego slajdu i ustaw Zadanie na Skanowanie. Ustaw Study na Multiplex Panel Development, ustaw Protocol na Multiplex Panel 1 i Drop Controls oraz ustaw Slide ID na Multiplex Lung ABC123, Multiplex CD68 Drop Lung ABC123 itp. Po oznaczeniu wszystkich slajdów i ustawieniu zadań kliknij przycisk Skanuj. Zautomatyzowany skaner multispektralny wykona pełne skany wszystkich slajdów przy użyciu wszystkich pięciu filtrów.

11. Skaner wielospektralny: Obrazowanie wielospektralne

  1. Po zakończeniu skanowania otwórz oprogramowanie QPTIFF ("Phenochart") i kliknij przycisk Załaduj slajd w lewym górnym rogu. Spowoduje to otwarcie QPTIFF, który jest pięciofiltrowym skanowaniem całego slajdu. Każda warstwa zawiera informacje z więcej niż jednego fluoru, więc użyteczność jest ograniczona, ale struktura tkankowa i szerokie wzorce ekspresji są widoczne i mogą być użyte do wybrania regionów dla MSI.
  2. Przejdź do odpowiedniego slajdu w badaniu i otwórz go, korzystając z rozwijanego drzewa po lewej stronie. Zaloguj się (w prawym górnym rogu) za pomocą inicjałów użytkownika.
  3. Wybierz pięć regionów dla MSI za pomocą narzędzia Stempel u góry ekranu. Skonsultuj się z patologiem, jeśli jest dostępny. W obszarze Wybierz dla wybierz pozycję Pozyskiwanie; w obszarze Rozmiar w polach wybierz opcję 1x1; i w obszarze Ograniczenie pola wybierz 0,5 μm (20x). Na podstawie barwienia cytokeratyną (CK) (głównie w Cy5) wybierz kilka regionów z guzem (CK+), jak i zrębem (CK-), które mają być zobrazowane z całego skanu. Powtórz tę procedurę dla każdego slajdu.
  4. Po wybraniu wszystkich MSI zamknij oprogramowanie Phenochart i wróć do oprogramowania Vectra. Zmień zadanie z Skanuj na MSI dla każdego slajdu, a następnie ponownie kliknij przycisk Skanuj, aby wykonać zbieranie MSI.

12. Odmieszanie widmowe

UWAGA: Krok demiksowania widmowego jest wymagany do separacji kanałów i analizy obrazu slajdów. Zanim zostanie przeprowadzone rozmieszanie spektralne w oprogramowaniu inForm, należy zbudować bibliotekę spektralną przy użyciu szkiełek z gruczolakorakiem płuc barwionych każdym fluorem osobno i samym DAPI. Procedura ta jest również opisana we wspomnianym wcześniej Przewodniku po opracowywaniu testów Multiplex IHC.

  1. Po zakończeniu pobierania pliku MSI należy użyć oprogramowania do rozmieszania spektralnego ("InForm"), aby otworzyć pliki w folderze MSI. Pliki te kończą się rozszerzeniem .im3.
  2. W obszarze Image format (Format obrazu) wybierz opcję Multispectral (Wielospektralny), w obszarze Sample format (Format próbki) wybierz opcję Fluorescence, a w obszarze Spectral library source (Źródło biblioteki spektralnej) wybierz opcję InForm.
  3. Aby wybrać fluory, wybierz i załaduj wszystkie sześć fluorów i DAPI z biblioteki zbudowanej ze slajdów biblioteki gruczolakoraka płuc. Kliknij przycisk Przygotuj wszystko (lewy dolny róg). Oprogramowanie do demiksowania spektralnego wykona demiksowanie spektralne na wszystkich otwartych obrazach, korzystając z dostarczonych profili spektralnych.
  4. Z patologiem oceń wzór barwienia w stosunku do chromogennych pojedynczych plam tego samego celu na sekwencyjnych szkiełkach tej samej tkanki.

13. Ocena intensywności fluorescencji i tłumienia sygnału

UWAGA: Narzędzie do liczenia, które pojawia się jako strzałka z małym brązowym polem, jest najważniejszym narzędziem do optymalizacji multipleksów i powinno być często używane (zobacz Materiały dodatkowe). Korzystając z narzędzia do zliczania w oprogramowaniu do rozmieszania spektralnego, oceń stosunek sygnału do szumu, który powinien co najmniej przekraczać 10:1 (patrz Materiały dodatkowe w celu rozwiązywania problemów i oceny barwienia multipleksowego za pomocą kontroli kropli).

  1. 13.1. Mając obraz otwarty w oprogramowaniu do rozmieszania widma, włącz narzędzie zliczające i obrazy przeglądowe, aby ocenić intensywność fluorescencji każdego kanału. Docelowa intensywność w tkance płucnej wynosi od 10 do 20 znormalizowanych zliczeń. Narzędzie do znormalizowanych zliczeń jest pokazane w Rysunek 1.
  2. Wyklucz slajdy z maksymalną liczbą sygnałów mniejszą niż 10 lub normalną liczbą obszarów sygnału mniejszą niż pięć dla dowolnego markera, tak aby autofluorescencja i barwienie poza celem nie konkurowały z autentycznym sygnałem.
  3. Wyklucz slajdy z maksymalną liczbą większą niż 30 dla dowolnego kanału, aby uniknąć krwawienia spektralnego lub nieefektywnego rozmieszania spektralnego.
  4. Zajmij się wysokimi lub niskimi znormalizowanymi liczbami, dostosowując stężenie TSA.

14. Wielospektralna analiza obrazu

  1. Otwórz jeden lub więcej MSI w oprogramowaniu do rozmieszania spektralnego i wybierz tylko te fluory do rozmieszania, które są reprezentowane na co najmniej jednym otwartym obrazie. Kliknij przycisk Przygotuj wszystko, aby usunąć wymieszanie wszystkich aktualnie otwartych obrazów kolorowych w celu uzyskania obrazów niezmieszanych spektralnie.
  2. Wybierz narzędzie do zliczania, aby sprawdzić liczbę na każdym obrazie, umieszczając kursor na interesujących Cię obszarach.
  3. Wybierz ikonę oka, aby otworzyć edytor widoków. Wybierz i dostosuj intensywność wyświetlania każdego niezależnego kanału.
  4. Wybierz pozycję Konfiguruj, aby otworzyć moduły segmentacji tkanek, segmentacji komórek, fenotypowania i oceniania. Narzędzia te są niezbędne do obiektywnej walidacji barwienia multipleksowego w stosunku do pojedynczych barwień chromogennych i mogą być wykorzystywane do generowania ilościowych danych fenoptycznych (ryc. S1).
  5. Karta Eksport służy do zapisywania plików TIFF w skali szarości, fluorescencyjnych, nieskompresowanych plików TIFF w stylu pathview oraz plików danych z modułów analizy fenoptycznej w celu dalszej analizy, archiwizacji i prezentacji (Rysunek S1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół dostarczy wyników takich jak te pokazane w Rysunek 2. Zacznij od oceny zabarwienia w kontroli migdałków, zaczynając od powierzchniowego nabłonka płaskonabłonkowego. Histologia próbki migdałków może być omówiona przez patologa, używając szkiełka H&E jako odniesienia. Jeśli chromogenne przekroje IHC są wykonywane z tymi samymi markerami na tym samym bloku tkanki, można je wykorzystać do potwierdzenia gęstości i rozmieszczenia każdego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trwająca rewolucja w immunoterapii nowotworów otwiera nowe i obiecujące opcje terapeutyczne dla pacjentów z rakiem13. Postępy w dziedzinie immunoonkologii będą wymagały zwiększonej wiedzy na temat mikrośrodowiska guza zapalnego, nie tylko w celu zrozumienia biologii mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w kancerogenezę, ale także w celu znalezienia biomarkerów predykcyjnych dla nowych terapii opartych na immunoterapii 1,2. Ze względu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez MedImmune, globalny dział badawczo-rozwojowy firmy AstraZeneca zajmujący się badaniami i rozwojem w dziedzinie leków biologicznych. C.W., K.R. i C.C.H. są pracownikami firmy Perkin Elmer, która produkuje odczynniki (zestaw TSA) i skanery multispektralne, które zostały użyte w tej pracy. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. i J.R.C. są pracownikami MedImmune posiadającymi akcje i/lub udziały w akcjach lub opcje w AstraZeneca.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie redakcyjne zapewniła Deborah Shuman z MedImmune.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
"InForm 2.4.2" Oprogramowanie do rozmieszania spektralnego i analizy obrazuPerkinElmerCLS151066Nazywane "oprogramowaniem do rozmieszania spektralnego" w tekście
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Oprogramowanie do wyboru MSI i ogólnego przeglądania skanów slajdówPerkinElmerCLS151067Nazywany "oprogramowaniem QPTIFF" w tekście
#1.5 Szkiełka nakrywkoweSigma Aldrich2975246
200-procentowy etanolKoptecV1001
20x tris-buforowana sól fizjologicznaVWRJ640-4L
Rozcieńczalnik przeciwciałDAKOS2203
Anti-CD68 Mysz monoklonalnaDAKOM087601-2klon PG-M1
anty-CD8 monoklonalny królikVentanaM5392klon SP239
Anti-CK mysz monoklonalnaDAKOM351501-2Klon AE1 / AE3
Anti-ki67 Mysz monoklonalnaDAKOM724001-2Klon MIB-1
Anty-PD-1 Sygnalizacja komórek monoklonalnych królika#86163Klon D4W2J
Anti-PD-L1 Monoklonalny królikVentana790-4905Klon SP263
Roztwór do dewaxowania BondLeicaAR9222Nazywany "roztworem dewax" w tekście
Bond Epitope Retrieval Solution 1LeicaAR9961Nazwany "ER1" w tekście
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640Nazywany "ER2" w tekście
Otwarte pojemniki Bond, 30 mlLeicaOP309700Nazywany "30 ml otwartymi pojemnikami" w tekście
Otwarte pojemniki Bond, 7 mlLeicaOP79193Nazywany "7 ml otwartych pojemników"" w tekście
Bond Polymer Refine DetectionLeicaDS9800Nazywany "chromogenicznym zestawem do wykrywania" w tekście
Zestaw do wykrywania badań nad BondemLeicaDS9455Nazywany "zestawem do wykrywania badań" w tekście
Zestaw do miareczkowania BondaOPT9049nazywany "zestawem do miareczkowania" w tekście
Uniwersalna osłona Bond NovocastraLeicaS21.2001Nazywany "covertiles" w tekście
Bond Wash Solution 10X KoncentratLeicaAR9590Nazywany "10x roztwór do mycia" w tekście
Autostainer BondRXLeicaNazywany "automatycznym stainerem" w tekście
BondRX Software Version 5.2.1.204LeicaNazywana "automatycznym oprogramowaniem do barwienia" w tekście
Opal 7-Color Automation Zestaw IHCPerkinElmerNEL801001KTNazywany "zestawem do barwienia multispektralnego" w tekście
Blok peroksydazyLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965Nazywany "mocowaniem do slajdów" w tekście
StarfrostSlides Fisher15-183-51
Mikroskop multispektralny Vectra Polaris z oprogramowaniem "Vectra 3.0.5" do sterowania mikroskopem wielospektralnymPerkinElmerCLS143455Nazywany "oprogramowaniem do sterowania mikroskopem" w tekście

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Preparaty tkankowe FFPEautomatyczny barwiarka do IHCamplifikacja sygna u tyramidowegomikroskopia multispektralnaPD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3metoda kontroli kroplowejoprogramowanie do demiksowania spektralnegoplatforma obrazowania multispektralnego

Powiązane artykuły