Artykuł metodologiczny

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

DOI:

10.3791/58393

⸱

28 września 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California - Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chloroplasty to organelle w roślinach zielonych, odpowiedzialne za przeprowadzanie wielu ważnych szlaków metabolicznych, w szczególności fotosyntezy. W obrębie chloroplastów system błon tylakoidowych zawiera wszystkie pigmenty fotosyntetyczne, kompleksy centrum reakcji i większość nośników elektronów i jest odpowiedzialny za zależną od światła syntezę ATP. Ponad 90% białek chloroplastowych jest kodowanych w jądrze, ulegających translacji w cytozolu, a następnie importowanych do chloroplastu. Dalszy transport białek do błony tylakoidów lub przez nią wykorzystuje jeden z czterech szlaków translokacji. W tym miejscu opisujemy wysokowydajną metodę izolacji tylakoidów kompetentnych do transportu z grochu (Pisum sativum), wraz z testami transportu przez trzy zależne od energii szlaki, w których pośredniczy cpTat, cpSec1 i cpSRP. Metody te umożliwiają prowadzenie eksperymentów związanych z lokalizacją białek tylakoidów, energetyką transportu oraz mechanizmami translokacji białek przez błony biologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie cała białkowa maszyneria odpowiedzialna za prawidłowe funkcjonowanie chloroplastów musi zostać przeniesiona z cytozolu1. W otoczkach chloroplastowych substraty białkowe są importowane przez translokon błony zewnętrznej (TOC) i translokon błony wewnętrznej (TIC)2. Dalsze ukierunkowanie na błonę tylakoidową i światło odbywa się poprzez bliźniaczą translokację argininy (cpTat)3, wydzielniczą (cpSec1)4, cząstkę rozpoznającą sygnał (cpSRP)5, oraz spontaniczne ścieżki insercji6. Metoda wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych chloroplastów i błon tylakoidów jest niezbędna do pomiaru energii i kinetyki zdarzenia translokacji, zrozumienia różnorodnych mechanizmów transportu w każdym szlaku oraz zlokalizowania określonego substratu białkowego interesującego w dowolnym z sześciu odrębnych przedziałów chloroplastu.

Izolacja membran od chloroplastu zapewnia lepszą eksperymentalną kontrolę nad czynnikami środowiskowymi (takimi jak stężenie soli i substratu, obecność ATP/GTP i warunki pH), które wpływają na pomiar energetyki transportu i kinetyki. To środowisko in vitro nadaje się do badania mechanistycznych szczegółów translokacji z tych samych powodów. Ponadto, podczas gdy oprogramowanie predykcyjne do lokalizacji białek chloroplastowych uległo poprawie7,8, testy transportu in vitro zapewniają szybszą metodę potwierdzenia w porównaniu z testami fluorescencyjnymi opartymi na mikroskopii, które wymagają genetycznie kodowanego znacznika fluorescencyjnego, transformacji rośliny i/lub specyficznych przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy protokoły izolacji chloroplastów i tylakoidów z grochu (Pisum sativum), a także testów transportu zoptymalizowanych dla każdego ze szlaków translokacji tylakoidów zależnych od energii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiały początkowe

  1. Namocz około 55 g grochu przez 3 godziny w 400 ml wody destylowanej, a następnie wysiej na plastikowej tacy (35 cm x 20 cm x 6 cm) w glebie pokrytej cienką warstwą wermikulitu.
  2. Hodować tacę z groszkiem w temperaturze 20 °C w cyklu 12/12 godzin światła/ciemności (50 μE/m2s) przez 9 do 15 dni.
  3. Przygotować substrat białkowy zgodnie z preferowaną metodą.
    Uwaga: Przygotowaliśmy substraty białkowe przy użyciu różnych metod, w tym 1) transkrypcji in vitro z oczyszczonych plazmidów, a następnie translacji przy użyciu ekstraktów z kiełków pszenicy lub lizatów retikulocytów królika w obecności [3H]-leucyny lub [35S]-metioniny, 2) translacji in vitro przy użyciu sprzężonego zestawu do transkrypcji/translacji, takiego jak zestawy TnT firmy Promega, z radioznakowaniem jak powyżej, oraz 3) oczyszczanie z nadekspresji białka w E. coli. Radioaktywne produkty translacji in vitro są zazwyczaj schładzane zimnym aminokwasem o stężeniu 50 mM przed użyciem w reakcjach transportowych. Każda z tych metod zazwyczaj wymaga pewnej optymalizacji dla każdego nowego substratu białkowego. Przykład sprzężonego systemu in vitro można znaleźć w Ling and Jarvis (2016)9.

2. Izolacja i kwantyfikacja chloroplastów

Uwaga: Pierwszym krokiem w przygotowaniu tylakoidów jest izolacja nienaruszonych chloroplastów10. Podczas przygotowania wszystkie materiały powinny być przechowywane w chłodzie. Z ponownym wywieszeniem chloroplastów należy obchodzić się delikatnie, ponieważ pęknięcie na tym etapie może poważnie ograniczyć późniejszą wydajność tylakoidów.

  1. Wcześniej przygotuj następujące rozwiązania.
    1. 2x Bufor mielący (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7,3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2% BSA.
    2. 2x bufor importowy (2xIB): 100 mM K-Tricine lub K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2,
      Uwaga: Stężenia MgCl2 w zakresie od 3 mM do 10 mM zostały użyte bez zauważalnych różnic.
  2. Przygotować ciągły gradient gęstości przez odwirowanie mieszaniny 15 ml Percollu i 15 ml 2 x GB przy 30 900 g w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu.
  3. Zbierz około 25 g 9-15-dniowego groszku i homogenizuj w 95 ml 1xGB. Z powodzeniem użyto blendera z zaostrzonymi ostrzami lub Polytrona. Przefiltruj tę mieszaninę przez co najmniej 2 warstwy Miracloth w lejku.
    Uwaga: Ograniczenie ilości tkanki macierzystej nie jest konieczne, ale może ułatwić proces homogenizacji, zmniejszając w ten sposób pękanie chloroplastów, które może wystąpić przy długotrwałym mieszaniu.
  4. Granulat o masie 3 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie ponownie zawiesić w 1 ml 1 x GB. Pędzel może być najdelikatniejszą techniką ponownego zawieszenia.
  5. Ostrożnie ułóż zieloną zawiesinę na wierzchu gradientu Percoll i odwiruj przy 8 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu.
  6. Ostrożnie zbierz dolny zielony pasek zawierający nienaruszone chloroplasty do świeżej probówki. Odzyskane nienaruszone chloroplasty należy odwirować w temperaturze 1 800 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 5 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1xIB. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz, ponownie zawieszając za każdym razem w 30 ml 1xIB, z końcowym ponownym zawieszeniem w 1 ml 1xIB.
  7. Aby określić ilościowo zawartość chlorofilu (Chl), należy zmieszać 10 μl całkowicie zawieszonych chloroplastów z 5 ml 80% acetonu i przefiltrować przez bibułę filtracyjną Whatman 1 (grubość nominalna 180 μm). Zapisać absorbancję przy 720 nm, 663 nm i 645 nm w spektrofotometrze i obliczyć stężenie Chl za pomocą następującego wzoru11:
    [Chl] mg/ml = [40,2*(A663 – A720) + 101,4*(A645 – A720)]*0,1
  8. Dostosuj chloroplasty do 1 mg/ml ekwiwalentu Chl za pomocą 1xIB.

3. Izolacja tylakoidów

Uwaga: Tylakoidy są przygotowywane przez hipotoniczną lizę nienaruszonych chloroplastów. Osiąga się to poprzez wystawienie chloroplastów na działanie hipotonicznego buforu pozbawionego sorbitolu. Wyizolowane tylakoidy mogą być używane do oznaczania dowolnego szlaku translokacji, ale ekstrakt zrębu (SE) musi być również wyizolowany podczas tego przygotowania, jeśli mają być badane szlaki cpSec1 lub cpSRP.

  1. Przygotuj z wyprzedzeniem następujące rozwiązania.
    1. Hipotoniczny bufor do lizy: 50 mM K-tricine lub K-HEPES pH 8,0, 8 mM MgCl2.
    2. 2x Surowy bufor zrębu (do stężenia SE): 100 mM K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitolu, 8 mM MgCl2.
    3. Bufor do próbek Laemmli (dla SDS-PAGE, uzupełniony o EDTA): 125 mM Tris pH 6,8, 10% SDS, 20% glicerol, 0,05 mg/ml błękitu bromofenolowego, 10% β-merkaptoetanol, 10 mM EDTA.
  2. Jeżeli odzysk SE nie jest konieczny, należy odwirować nienaruszone chloroplasty o masie 1 000 g w obrotowym wirniku kubełkowym przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić do 1 mg/ml w hipotonicznym buforze do lizy. Inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając.
    2. Tylakoidy należy odzyskać przez odwirowanie z stężeniem 3 200 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Tylakoidy należy przemyć dwukrotnie, za każdym razem ponownie dodając 1 do 2 ml buforu do lizy. Zawiesić ponownie za pomocą 1 ml 1xIB i ponownie określić ilościowo Chl jak powyżej w protokole izolacji chloroplastów.

4. Odzyskiwanie i koncentracja ekstraktu zrębu

  1. Jeśli konieczne jest odzysk SE, podzielić nienaruszone chloroplasty na 600 μl podwielokrotności w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odwirować każdą probówkę przy 1 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Ta objętość jest wygodna w przypadku korzystania z probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, co pomaga zapobiec zakłóceniu ewentualnego osadu w przypadku resztek membran.
    1. Zawiesić do 1 mg/ml Chl w hipotonicznym buforze do lizy i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, jak w kroku 3.2.1.
    2. Odwirować każdą probówkę o masie 3 200 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C i przenieść jasnozielony lub żółty supernatant po lizie chloroplastów do nowej probówki mikrowirówkowej o równej objętości 2x surowego buforu zrębu.
    3. Przemyć tylakoidy 2 objętościami buforu do lizy (w przybliżeniu 0,5 mg/ml) i zebrać przez odwirowanie w stężeniu 3 200 g w obrotowym wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić do 1 mg/ml Chl w 1xIB na lodzie.
    4. Wirować zrąb surowy o masie 42 000 g w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek membran. Immunoblotting dla białek otoczki zewnętrznej i wewnętrznej może być stosowany do weryfikacji czystości supernatantu.
    5. Zbierz 95% objętości z każdej tuby, nie naruszając małego żółto-zielonego granulatu. Zwróć uwagę na objętość pobraną z każdej probówki.
    6. Aby przygotować skoncentrowany ekstrakt zrębu (SE), zebrać zebrane supernatanty i zagęścić pięciokrotnie za pomocą koncentratora MWCO o pojemności 4 ml 30 kDa.
      Uwaga: SE przygotowany w ten sposób jest równoważny zrębowi pochodzącemu z chloroplastów w stężeniu 2,5 mg/ml Chl. W razie potrzeby SE można zagęścić dziesięciokrotnie do 5 mg/ml ekwiwalentu Chl. SE będzie miał złoty kolor i lepkość. W laboratoryjnej wirówce Legend RT z wahliwym wirnikiem kubełkowym wymaga to około 10 minut na ml koncentratu.

5. Transport przez ścieżkę cpTat

Uwaga: W przeciwieństwie do cpSec1 lub cpSRP, ścieżka cpTat nie wymaga rozpuszczalnych składników ani egzogenicznie dodanych źródeł energii; potrzebna jest tylko siła napędowa protonów napędzana światłem3. Dlatego do testu wymagane są tylko wyizolowane tylakoidy i białko substratowe. Typowymi substratami są pośrednie formy podjednostek 17 kDa (jak pokazano na rysunku 1) i 23 kDa kompleksu wydzielającego tlen, odpowiednio iOE17 i iOE23, ale formy prekursorowe, prOE17 i prOE23, mogą być również z powodzeniem transportowane. Formy prekursorowe mają całą dwudzielną N-końcową sekwencję celowania, podczas gdy formy pośrednie mają tylko sekwencję celującą w tylakoidy.

  1. Przygotować mieszaninę transportową cpTat z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 5 mM ATP z bulionu przygotowanego w 1xIB i 8 mM ditiotreitolu (DTT) z podkładu przygotowanego w 1xIB, na lodzie. ATP nie jest ściśle wymagane do tej reakcji, jeśli jest prowadzona w oświetleniu.
  2. Rozpocznij transport, wprowadzając białko substratowe w proporcji 1:30 objętościowo do mieszanki transportowej. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB, a następnie użyć 1:30 objętościowo rozcieńczonego substratu w mieszance transportowej.
    Uwaga: Stężenia podłoża będą się różnić w zależności od metody przygotowania. Zazwyczaj preparaty in vitro pozwolą na ilości nanomolowe do mikromolowych, podczas gdy nadekspresja pozwoli na ilości mikromolowe do milimolowych. Należy również wziąć pod uwagę metody wykrywania, ponieważ autoradiografia i fluorografia są bardziej czułe niż immunoblotting.
  3. Oświetlać zawiesinę w 80 - 100 μE/m2s promieniowania fotosyntetycznie aktywnego (PAR) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli wymagana jest kinetyka transportu, należy wstępnie zrównoważyć zarówno tylakoidy, jak i mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i oświetlać przez maksymalnie 30 minut.
  4. Zatrzymać reakcję transportu za pomocą 8-krotnego rozcieńczenia lodowatego 1xIB i odzyskać tylakoidy przez odwirowanie w stężeniu 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć resztki substratu, który nie został przetransportowany, ponownie zawiesić osad tylakoidu w 120 μl 1xIB i strawić białko zewnętrzne przez dodanie 6 μl 2 mg/ml termolizyny i 10 mM CaCl2 w 1xIB.
  6. Inkubować reakcję proteazy na lodzie przez 40 minut, a następnie wygasić proteazę, podwajając objętość za pomocą 25 mM EDTA przygotowanego w 1xIB.
  7. Odzyskać tylakoidy przez odwirowanie z stężeniem 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskane tylakoidy przemyć w 120 μl 5 mM EDTA w 1xIB i przenieść do nowej probówki.
  8. Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w odpowiedniej objętości bufor próbki Laemmli uzupełniony 10 mM EDTA. Objętość 40 μl jest zwykle wystarczająca do wykrycia podłoża na żelu SDS-PAGE i w razie potrzeby zachowuje próbkę do powtórzenia żelu.
  9. Umieścić próbki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE. Autoradiografia, fluorografia lub Western blot białek nienatywnych lub znakowanych epitopami są z powodzeniem stosowane do wykrywania transportowanych białek.

6. Transport przez ścieżkę cpSec1

Uwaga: Transport przez translokon cpSec1 wymaga białka zrębu cpSecA112,13, które można uzyskać poprzez nadekspresję w E. coli14,15 lub odzyskane przez zagęszczenie zrębu podczas izolacji tylakoidu. Typowym substratem jest podjednostka 33 kDa kompleksu wydzielającego tlen (prOE33), jak pokazano na rysunku 2.

  1. Przygotować mieszaninę transportową cpSec1 z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 0,83 mg/ml ekwiwalentu Chl SE lub 1,5 μg rekombinowanego cpSecA1 i 5 mM ATP na lodzie i inkubować przez 10 minut. Typowa mieszanina reakcyjna transportu wynosi tutaj 72 μl, w porównaniu z 60 μl ze względu na dodatek SE.
    1. Jeśli zamiast SE zostanie użyty rekombinowany cpSecA1, należy dostosować oczyszczony cpSecA1 o równej objętości 2xIB, a następnie rozcieńczyć do dogodnego stężenia, aby dodać do reakcji transportu (np. 0,75 μg/μL).
      Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania, cpSecA1 jest przechowywany na lodzie w kontrolowanym, chłodzonym pomieszczeniu po oczyszczeniu, ponieważ zamrażanie znosi aktywność.
  2. Rozpocznij transport, wprowadzając do mieszanki transportowej białko substratowe w stosunku 1:10 objętościowo. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB i dodać 1:10 objętościowo rozcieńczonego białka do mieszaniny transportowej.
  3. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 80 – 100 μE/m2s PAR. Ponownie, dłuższe czasy mogą być konieczne dla kinetyki lub niektórych substratów.
  4. Po lekkiej obróbce rozcieńczyć 8-krotnie lodowatym 1xIB i odwirować reakcje przy 3200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Leczyć termolizyną i gasić EDTA, jak powyżej w krokach od 5.5 do 5.7.
  6. Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do próbek Laemmli uzupełnionego 10 mM EDTA. Umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut przed załadowaniem żelu SDS-PAGE.

7. Wprowadzanie przez ścieżkę cpSRP

Uwaga: Integracja białek kompleksu zbierającego światło (LHCP) za pośrednictwem cpSRP widoczna na rysunku 3 wymaga cpSRP54, cpSRP43 i cpFtsY16. Składniki te są dostarczane do reakcji transportu poprzez skoncentrowany ekstrakt zrębu, zgodnie z opisem w protokole transportowym cpSec1.

  1. Przygotować mieszaninę transportową cpSRP z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 0,83 mg/ml ekwiwalentu Chl SE i 5 mM ATP na lodzie i inkubować przez 10 minut.
  2. Rozpocznij transport, wprowadzając do mieszanki transportowej białko substratowe w stosunku 1:10 objętościowo. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB i dodać 1:10 objętościowo rozcieńczonego białka do mieszaniny transportowej.
  3. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut w 80 – 100 μE/m2s PAR.
  4. Po lekkiej obróbce rozcieńczyć 8-krotnie lodowatym 1xIB i odwirować reakcje przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 120 μl 1xIB.
  5. Leczyć termolizyną, jak powyżej w sekcjach od 5.5 do 5.7. Trawienie termolizyną jest tutaj konieczne, aby ocenić pomyślną integrację błony. Odzyskane tylakoidy przemyć w 120 μl 5 mM EDTA w 1xIB i przenieść do nowej probówki.
  6. Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości 2x bufor Laemmli uzupełniony 10 mM EDTA. Umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut przed analizą za pomocą SDS-PAGE.
    Uwaga: Integracja dojrzałego LHCP (mLHCP) ocenia się na podstawie pojawienia się produktu degradacji chronionego przed proteazą (mLHCP-D) o około 1,5-2 kDa mniejszego niż nienaruszony mLHCP17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić ilość pomyślnie przetransportowanego substratu, warto uwzględnić jeden lub więcej pasów "procentowego wkładu". Dla danych przedstawionych poniżej wykorzystano 10% końcowej reakcji transportu bez tylakoidów. Ten "procentowy wkład" pomaga również zwizualizować rozmiar substratu prekursora. Wartość procentowa reprezentuje znaną, zdefiniowaną ilość substratu, z którą można porównać transportowany substrat i może być skalowana w górę lub w dół w zależności od potrzeb przy użyciu wst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja chloroplastów i tylakoidów

Nadmierne pękanie może skutkować słabą izolacją chloroplastów, a tym samym słabą wydajnością tylakoidów po oddzieleniu w gradiencie. Najlepiej jest delikatnie homogenizować pobraną tkankę, upewniając się, że cały materiał jest zanurzony przed zmieszaniem i pulsowaniem w cyklach 15 sekund, aż do pełnej homogenizacji. Jeśli to konieczne, użyj wielu krótszych rund mieszania z mniejszą ilością tkanki w każdej rundzie.

Chłodzenie wszystki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt został przygotowany dzięki finansowaniu przez Wydział Nauk Chemicznych, Nauk o Ziemi i Nauk Biologicznych, 408 Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii USA poprzez Grant DE-SC0017035

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pisum sativumnasiona Seedway LLC, Hall, NY8686 - Little Marvel
MiraclothCalbiochem, Gibbstown, NJ475855-1
80% AcetonSigma, Saint Louis, MO67-64-1
Blender z zaostrzonymi ostrzamiWaring CommercialBB155S
Polytron 10-35Fischer Sci13-874-617
PercollSigma, Saint Louis, MOGE17-0891-01
Beckman J2-MC z wirnikiem JA 20Beckman-Coulter8043-30-1180
Sorvall RC-5B z wirnikiem HB-4Sorvall8327-30-1016
100 mM ditiotreitol (DTT) w 1xIBSigma, Saint Louis, MO12/3/83Może być zamrożony w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości
200 mM MgATP w 1xIBSigma, Saint Louis, MO74804-12-9Może być zamrożony w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości
Termolizyna w 1xIB (2mg/mL)Sigma, Saint Louis, MO9073-78-3Można zamrozić w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości
HEPESSigma, Saint Louis, MOH3375
K-TricineSigma, Saint Louis, MOT0377
SorbitolSigma, Saint Louis, MO50-70-4
Chlorek magnezuSigma, Saint Louis, MO7791-18-6
Chlorek manganuSigma, Saint Louis, MO13446-34-9
EDTASigma, Saint Louis, MO60-00-4
BSASigma, Saint Louis, MO9048-46-8
TrisSigma, Saint Louis, MO77-86-1
SDSSigma, Saint Louis, MO151-21-3
GlycerolSigma, Saint Louis, MO56-81-5
Bromophenol BlueSigma, Saint Louis, MO115-39-9
B-merkaptoetanolSigma, Saint Louis, MO60-24-2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).
  2. Li, H. -m, Chiu, C. -C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
  3. Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
  4. Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
  5. Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
  6. Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
  7. Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
  8. Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953(2007).
  9. Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).
  10. Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
  11. Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
  12. Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
  13. Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
  14. Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
  15. Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
  16. Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
  17. Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
  18. Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
  19. Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
  20. Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
  21. Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
  22. Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
  23. Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja tylakoid wizolacja chloroplast wszlak cpTatszlak cpSec1szlak cpSRPprzygotowanie ekstraktu stromowegobufor do lizy hipotonicznejwirowanie w gradiencie Percollspektrofotometryczny pomiar chlorofilu

Powiązane artykuły