Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie ekspresji genów w pojedynczej komórce umożliwia identyfikację typu komórki i stanu komórki. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki stało się potężnym narzędziem do badania profili transkrypcyjnych komórek, szczególnie w tkankach heterogenicznych, takich jak ośrodkowy układ nerwowy. Jednak metody dysocjacji wymagane do sekwencjonowania pojedynczych komórek mogą prowadzić do eksperymentalnych zmian w ekspresji genów i śmierci komórki. Co więcej, metody te są na ogół ograniczone do świeżych tkanek, co ogranicza badania nad materiałem archiwalnym i biobankowym. Sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) jest atrakcyjną alternatywą dla badań transkrypcyjnych, biorąc pod uwagę, że dokładnie identyfikuje typy komórek, umożliwia badanie tkanki, która jest zamrożona lub trudna do dysocjacji, oraz zmniejsza transkrypcję wywołaną dysocjacją. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół szybkiej izolacji jąder w celu dalszego sekwencjonowania snRNA. Metoda ta umożliwia izolację jąder ze świeżych lub mrożonych próbek rdzenia kręgowego i może być łączona z dwiema masywnie równoległymi platformami enkapsulacji kropel.
Wprowadzenie
Układ nerwowy składa się z heterogenicznych grup komórek, które wykazują różnorodny wachlarz właściwości morfologicznych, biochemicznych i elektrofizjologicznych. Podczas gdy sekwencjonowanie masowego RNA było przydatne do określania zmian w ekspresji genów w całej tkance w różnych warunkach, wyklucza wykrycie zmian transkrypcyjnych na poziomie pojedynczej komórki. Ostatnie postępy w analizie transkrypcyjnej pojedynczej komórki umożliwiły klasyfikację heterogenicznych komórek do grup funkcyjnych na podstawie ich repertuaru molekularnego, a nawet mogą być wykorzystane do wykrywania zestawów neuronów, które były ostatnio aktywne. 1,2,3,4 W ciągu ostatnich dziesięciu lat rozwój sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq) umożliwił badanie ekspresji genów w poszczególnych komórkach, zapewniając wgląd w różnorodność typów komórek. 5
Pojawienie się skalowalnych metod, takich jak masowo równoległe sekwencjonowanie scRNA, dostarczyło platform do sekwencjonowania heterogenicznych tkanek, w tym wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego. 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 Jednak metody dysocjacji pojedynczej komórki mogą prowadzić do śmierci komórki, a także do zmian eksperymentalnych w ekspresji genów. 16 Ostatnie prace dostosowały metody sekwencjonowania pojedynczych komórek, aby umożliwić zachowanie endogennych profili transkrypcyjnych. 1,3,4,17,18,19 Strategie te są szczególnie przydatne do wykrywania natychmiastowej wczesnej ekspresji genu (IEG) po bodźcu sensorycznym lub zachowaniu. 3,4 W przyszłości strategia ta może być również wykorzystana do badania dynamicznych zmian w tkankach w stanach chorobowych lub w odpowiedzi na stres. Spośród tych metod, sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) jest obiecującym podejściem, które nie obejmuje dysocjacji komórek wywołującej stres i może być stosowane na trudnych do dysocjacji tkankach (takich jak rdzeń kręgowy), a także na tkankach zamrożonych. 4,17,18,19 Dostosowane do poprzednich metod izolacji jąder,20,21,22,23,25snRNA-Seq zazwyczaj wykorzystuje szybkie rozerwanie tkanek i lizę komórek w niskich temperaturach, wirowanie i oddzielanie jąder od szczątków komórkowych. 4 Jądra mogą być izolowane do sekwencjonowania nowej generacji na wielu platformach enkapsulacji kropel mikroprzepływowych. 4,7,24,25 Ta metoda pozwala na uzyskanie migawki aktywności transkrypcyjnej tysięcy komórek w danym momencie.
Istnieje wiele strategii uwalniania jąder z komórek przed izolacją i sekwencjonowaniem, każda z nich ma swoje zalety i wady. W tym miejscu opisujemy i porównujemy dwa protokoły umożliwiające izolację jąder z dorosłego rdzenia kręgowego w celu przeprowadzenia masowo równoległego sekwencjonowania snRNA: liza mechaniczna detergentem i liza hipotoniczno-mechaniczna. Liza detergentowo-mechaniczna zapewnia całkowite rozerwanie tkanek i wyższą końcową wydajność jąder. Hipotoniczna liza mechaniczna obejmuje kontrolowany stopień rozerwania tkanki, co daje możliwość wyboru równowagi między ilością a czystością końcowej wydajności jądrowej. Podejścia te zapewniają porównywalną wydajność RNA, wykrytą liczbę genów na jądro i profilowanie typu komórki, a także mogą być z powodzeniem stosowane do sekwencjonowania snRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care and Use Committee. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano zbilansowane próbki samców i samic myszy typu dzikiego ICR/CD-1 w wieku od 8 do 12 tygodni. Z myszami należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania.
1. Przygotowanie materiałów i
- Przygotować wszystkie w dniu użycia i wstępnie schłodzić na lodzie (patrz Tabela 1).
- W przypadku stosowania lizy mechanicznej detergentu należy przygotować bufor do lizy detergentu (> 500 μl na próbkę), bufor o niskiej zawartości sacharozy (> 6 ml na próbkę), bufor o gęstości sacharozy (> 12,5 ml na próbkę) i roztwór do ponownego zawieszania (> 1 ml).
- W przypadku stosowania lizy hipotoniczno-mechanicznej należy przygotować hipotoniczny bufor do lizy (> 5 ml na próbkę), pożywkę HEB (> 5 ml na próbkę), bufor o niskiej zawartości sacharozy (> 3 ml na próbkę), bufor o gęstości sacharozy (>12,5 ml na próbkę) i roztwór do rezawieszania (> 1 ml).
- Dodać 25 μl ditiotreitolu (DTT) do 25 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy i kolejne 25 μl DTT do 25 ml buforu gradientu gęstości sacharozy tuż przed rozpoczęciem protokołu.
- Przykryj powierzchnię preparacyjną folią aluminiową, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki włóknami z ręczników papierowych lub ochraniaczy stołów, które mogą zatkać kanały mikroprzepływowe używane do wychwytywania pojedynczych jąder.
- Spryskaj narzędzia preparacyjne i przestrzeń stołu roztworem do odkażania RNazy. Dodatkowo spryskaj wnętrze probówki homogenizatora Dounce (w przypadku stosowania detergentowo-mechanicznej lizy komórek) i probówki Oak Ridge roztworem do odkażania RNazy. Wypłucz rurkę Dounce i Oak Ridge ultraczystą wodą wolną od RNaz.
- Wstępnie schłodzić wszystkie probówki zbiorcze (50 ml stożkowe, Oak Ridge) i zanurzyć probówki homogenizatora na lodzie.
- Wypoleruj ogniowo serię pipet Pasteura (w przypadku korzystania z hipotoniczno-mechanicznej lizy komórek).
2. Przygotowanie rdzenia kręgowego
- Jeśli używasz świeżej tkanki, poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 . Po eutanazji spryskaj sierść myszy 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie włosów w próbce.
- Odetnij głowę myszy ostrymi, wolnymi od RNaz nożyczkami chirurgicznymi. Następnie delikatnie unieś skórę brzucha kleszczami i wykonaj nacięcie wzdłuż ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
- Wypatrosz mysz, wyciągając narządy wewnętrzne z jamy ciała za pomocą kleszczy. Nie używaj ręczników papierowych do czyszczenia obszaru lub usuwania narządów, ponieważ może to wprowadzić zanieczyszczenia. Za pomocą nożyczek przetnij kręgosłup między kręgami kręgowymi L2 i L3.
UWAGA: Przy odrobinie wprawy ten krok można osiągnąć w mniej niż 30 sekund.- Aby wysunąć rdzeń kręgowy, załóż strzykawkę o pojemności 3 ml zawierającą lodowaty PBS z igłą 25 G 1/4 cala. Umieść końcówkę igły w krzyżowym końcu kręgosłupa. Użyj dwóch palców, aby ścisnąć kręgi, aby stworzyć szczelne uszczelnienie wokół końcówki igły i naciśnij tłok, aby wysunąć rdzeń kręgowy rostrally. Umieść rdzeń kręgowy na szalce Petriego z lodowatym PBS.
- W tym momencie zamrozić tkankę i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do lizy detergentowo-mechanicznej (etap 3) lub hipotoniczno-mechanicznej (etap 4).
- Jeśli używasz zamrożonej tkanki, utrzymuj ją na suchym lodzie, przystąp do lizy detergentowo-mechanicznej (Krok 3) lub hipotoniczno-mechanicznej (Krok 4).
3. Detergentowo-mechaniczna liza komórek
- Umieść rdzeń kręgowy lędźwiowy w wstępnie schłodzonym homogenizatorze Dounce i dodaj 500 μl wstępnie schłodzonego buforu do lizy detergentu.
UWAGA: Rdzeń kręgowy lędźwiowy myszy wynosi 325,5 mg ± 63,9 mg błąd standardowy średniej (SEM, N = 4). Z powodzeniem można zastosować 50 mg–1,5 g tkanki. - Odbij 5 pociągnięciami tłuczka A ("luźny" tłuczek), a następnie 5-10 uderzeń tłuczka B ("ciasny" tłuczek). Unikaj wyjmowania homogenizatora z roztworu do lizy między pociągnięciami i unikaj wprowadzania pęcherzyków.
- Umieścić sitko o pojemności 40 μm na wstępnie schłodzonej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilżyć 1 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy.
- Dodać 1 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy do homogenizatora Dounce zawierającego surowe jądra w buforze do lizy i delikatnie wymieszać, pipetując 2-3 razy.
- Przepuścić przygotowane jądra surowe przez sitko o średnicy 40 μm do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Przepuścić dodatkowy 1 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy przez sitko o wielkości 40 μm, doprowadzając końcową objętość do 3 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy i 500 μl buforu do lizy.
- Powtórz kroki 3.1–3.6, jeśli łączysz wiele przewodów, gromadząc się w tej samej stożkowej rurce.
- Odwirować próbkę o masie 3 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant. Przejdź do kroku 5.
4. Hipotoniczno-mechaniczna liza komórek
- Umieścić lędźwiowy rdzeń kręgowy w 5 ml hipotonicznego buforu do lizy w naczyniu do hodowli tkankowej. Użyj końca nożyczek sprężynowych, aby przeciąć rdzeń kręgowy na pół, a następnie użyj nożyczek sprężynowych, aby pociąć sznur na kawałki o grubości 3–4 mm, ale nie miażdż.
Uwaga: Z powodzeniem można stosować 50 mg–1,5 g tkanki. - Wysiaduj na lodzie przez 15 minut, obracając 2-3 razy.
- Dodać 5 ml pożywki HEB w celu rozcieńczenia hipotonicznego buforu do lizy .
- Rozcierać tkankę 10 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub do momentu, gdy wszystkie kawałki tkanki płynnie przejdą przez otwór pipety.
- Wykonaj tartarację za pomocą serii trzech polerowanych ogniowo pipet Pasteura o stopniowo węższych średnicach (~900–600 μm).
- Dla każdej pipety rozcierać 5-15 razy, pozostawić tkankę do opadnięcia, usunąć 1–2 ml supernatantu zawierającego zdysocjowane jądra i przepuścić przez sitko o wielkości 40 μm do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Po roztarciu za pomocą najmniejszej pipety Pasteura upewnij się, że homogenat płynnie przepływa przez końcówkę pipety. Przelać pozostały roztwór przez sitko 40 μm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Całkowitą liczbę tryturacji można dowolnie dostosowywać. Opony mózgowe rdzenia kręgowego myszy pozostaną, ale ważne jest, aby rozwarstwić wszelkie widoczne fragmenty rdzenia kręgowego. Przepuścić pozostały homogenat przez sitko o wielkości 40 μm. Unikaj wprowadzania bąbelków podczas rozcierania.
- Odwirować przefiltrowaną próbkę o masie 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania zdekantować i wyrzucić supernatant. Przejdź do kroku 5.
5. Homogenizacja i gradient gęstości sacharozy
- Po Kroku 3 lub 4 ponownie zawiesić osad za pomocą 3 ml buforu o niskiej zawartości sacharozy. Delikatnie zamieszaj, aby usunąć granulat ze ścianki i ułatwić ponowne zawieszenie. Pozostawić próbkę na lodzie na 2 minuty i przenieść zawiesinę do probówki Oak Ridge.
- Używając homogenizatora w ustawieniu 1, homogenizować jądra w buforze o niskiej zawartości sacharozy przez 15–30 s, utrzymując próbkę na lodzie.
UWAGA: Użyj 15 s w przypadku korzystania z jednego lędźwiowego rdzenia kręgowego lub 30 s w przypadku korzystania z próbek zbiorczych lub całego rdzenia kręgowego. - Za pomocą pipety serologicznej ułóż warstwę 12,5 ml buforu sacharozy o dużej gęstości pod buforem o niskiej zawartości sacharozy, uważając, aby nie utworzyć pęcherzyka, który naruszy warstwy gęstości.
- Odwirować probówki o masie 3 200 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Po zakończeniu wirowania natychmiast zdekantować supernatant ruchem ruchowym.
UWAGA: Pozostałą objętość (mniejszą niż 400 μl) buforu sacharozy można w razie potrzeby odrzucić, aby uzyskać mniejszą objętość i czystszą próbkę końcową, ale ta pozostała objętość zawiera jądra i może być zachowana w celu maksymalizacji wydajności jąder. - Używając 100 μl - 1 ml roztworu do resuspensji, ponownie zawiesić jądra pozostające na ścianie. Unikaj "grymasu" mieliny, który pozostaje po preparacie na bazie detergentu.
- Przefiltrować jądra przez sitko o wielkości porów 30–35 μm i zebrać w wstępnie schłodzonej probówce.
- Określ wydajność jąder za pomocą hemocytometru, aby policzyć jądra pod obiektywem 10X.
UWAGA: Błękit trypanowy można dodać w celu uwidocznienia jąder, które powinny wydawać się niebieskie. Zwróć uwagę na ilość resztek komórkowych. - Przejdź do kroku 6 lub 7.
6. Masowo równoległe sekwencjonowanie snRNA: Platforma akademicka7
- Wykonaj metodę masowo równoległego sekwencjonowania snRNA (np. Drop-Seq) zgodnie z wcześniejszym opisem7 z następującymi modyfikacjami:4
- Doprowadzić jądra do końcowego stężenia 225 jąder na μl.
- Przygotuj kulki z kodami kreskowymi w stężeniu 250 kulek na μl.
- Przygotować bufor do lizy z 0,7% sarkozylu.
- Dostosuj natężenie przepływu do 35 μl na minutę dla kulek, 35 μl na minutę dla jąder i 200 μl na minutę dla oleju.
7. Masowo równoległe sekwencjonowanie snRNA: Platforma komercyjna26
- Wykonaj masowo równoległe sekwencjonowanie snRNA przy użyciu produktów platformy komercyjnej (np. Chromium Single Cell Gene Expression Solution) zgodnie z instrukcjami producenta26 z następującą modyfikacją:
- Po odwrotnej transkrypcji dodaj dodatkowy cykl PCR do obliczonej liczby cykli amplifikacji cDNA w oparciu o docelowe odzyskiwanie komórki, aby skompensować zmniejszenie cDNA z jąder w porównaniu z komórkami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy przeprowadzono izolację jąder komórkowych z rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym dorosłej myszy w celu dalszego masowego równoległego sekwencjonowania RNA. Protokół składał się z trzech głównych etapów: rozbicia tkanki i lizy komórkowej, homogenizacji oraz wirowania w gradiencie gęstości sacharozy (Rysunek 1). W ciągu kilku sekund liza detergentowo-mechaniczna pozwoliła na uzyskanie surowego preparatu jąder z dużą liczbą jąder, ale także ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ostatecznym celem tego protokołu jest wyizolowanie jąder zawierających wysokiej jakości RNA do dalszej analizy transkrypcyjnej. Dostosowaliśmy metody snRNA-Seq w celu profilowania wszystkich typów komórek w rdzeniu kręgowym. Początkowo stwierdziliśmy, że typowe metody dysocjacji komórek były nieskuteczne w sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki, ponieważ neurony rdzenia kręgowego są szczególnie podatne na śmierć komórki. Co więcej, metody dysocjacji komórek indukują ekspresję różnych genów odpowiedzi na aktywność i str...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez program stacjonarny NINDS (1 ZIA NS003153 02) i NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Dziękujemy L. Li i C.I. Dobrott za ich wsparcie techniczne i pomocne dyskusje, a także C. Kathe za zrecenzowanie manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sacharoza | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8,0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0,5 M EDTA (pH = 8,0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Dodaj DTT tuż przed użyciem |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Woda bez nukleaz | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/ μ L Inhibitor RNAzy | Lucigen | 30281-1 | |
| Probówka wirówkowa Oak Ridge | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego z bawełnianą zatyczką | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Szklana chusteczka higieniczna (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Szklany tłuczek o dużym prześwicie | Kimble | 885301-0002 | |
| Szklany mały tłuczek do prześwitu | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizator | IKA | 3737001 | |
| Narzędzie dyspergujące (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ m sitko komórkowe | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Rurki stożkowe | Denville Scientific | 1000799 | |
| Wirówka Sorvall Legend XTR | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Rotor o stałym kącie | nachylenia Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Pipety sterologiczne: 5 mL, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometr | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Koraliki Barcodingowe | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacji | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Probówka z nasadką sitka komórkowego (35 μ m) | Sortownik | ||
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | B25982 | |
| Zestaw multipleksów Chromium i7, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3' Biblioteka i zestaw kulek żelowych v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Naczynie do hodowli tkankowych (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
Bibliografia
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022(2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
