Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

DOI:

10.3791/58416

⸱

13 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlak sygnałowy hipopotama jest konserwatywnym regulatorem wielkości narządu i odgrywa ważną rolę w rozwoju i biologii raka. Ze względu na wyzwania techniczne trudno jest ocenić aktywność tego szlaku sygnałowego i zinterpretować go w kontekście biologicznym. Istniejąca literatura na temat supresorów dużych nowotworów (LATS) opiera się na metodach, które są jakościowe i nie można ich łatwo zwiększyć do badań przesiewowych. Niedawno opracowaliśmy bioczujnik oparty na bioluminescencji do monitorowania aktywności kinazy LATS - kluczowego składnika kaskady kinazy hipopotej. W tym miejscu opisujemy procedury, w jaki sposób ten bioczujnik LATS (LATS-BS) może być wykorzystany do scharakteryzowania regulatorów szlaku Hippo. Po pierwsze, przedstawiamy szczegółowy protokół badania wpływu kandydata na białko z nadekspresją (np. VEGFR2) na aktywność LATS za pomocą LATS-BS. Następnie pokazujemy, w jaki sposób LATS-BS można wykorzystać do badania przesiewowego inhibitorów kinaz na małą skalę. Protokół ten można z powodzeniem rozszerzyć w celu przeprowadzenia większych badań przesiewowych, które niewątpliwie pozwolą zidentyfikować nowe regulatory szlaku Hippo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlak sygnałowy hipopotama został po raz pierwszy zidentyfikowany u Drosophila jako nowy regulator wzrostu komórek i wielkości zwierząt1,2. Od czasu pierwszego odkrycia, coraz więcej dowodów przekonująco wykazało, że szlak hipopotama odgrywa kluczową rolę w rozwoju (np. wczesny rozwój embrionalny, kontrola wielkości narządów i trójwymiarowa morfologia [3D])), nowotworzeniu (np. rozwój guza, przerzuty, angiogeneza, unikanie odporności, niestabilność genomu, reakcja na stres i oporność na leki) oraz homeostazie tkanek (np., odnowa i różnicowanie komórek macierzystych oraz regeneracja tkanek po urazie)3,4,5,6,7,8,9,10. Sygnalizacja hipopotama jest często rozregulowana w różnych nowotworach7,8,9,10,11,12. Dlatego wyjaśnienie funkcji szlaku hipopotama w biologii i terapii nowotworów oraz medycynie regeneracyjnej stało się jednym z najgorętszych obszarów badań biomedycznych.

W skrócie, w szlaku Hippo, po aktywacji przez wcześniejsze regulatory (np. kontakt komórka-komórka, stres odżywczy i macierz zewnątrzkomórkowa [ECM]), MST1/2 (MST; ssacze homologi Drosophila Hippo) seryna/treonina (S/T) fosforylują/aktywują białka adaptorowe hMOB1 i WW45, a także kinazy LATS1/2 (LATS), które następnie fosforylują koaktywator transkrypcji YAP i jego paralog TAZ przy konserwatywnym HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histydyna; R, arginina; K, lizyna; S, seryna; T, treonina; X, dowolne aminokwasy), w tym YAP-S127 i TAZ-S8911,12. Fosforylowany S127 YAP (YAP-pS127) i fosforylowany S89 TAZ (TAZ-pS89) są degradowane przez ubikwitynację lub wiążą się z białkiem cytoplazmatycznym 14-3-3 i nie mogą wchodzić w interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi TEAD1-4 w jądrze w celu transaktywacji genów biorących udział w proliferacji i apoptozie komórek (Rysunek 1). Pomimo ogromnego zainteresowania szlakiem Hippo, istnieje niewiele narzędzi do pomiaru sygnalizacji Hippo, a te, które istnieją, były historycznie ograniczone do reporterów wyjścia transkrypcyjnego YAP / TAZ / TEAD. Rzeczywiście, do niedawna nie było narzędzi do pomiaru dynamiki i aktywności komponentów sygnalizacyjnych Hippo w sposób ilościowy, w czasie rzeczywistym, wysokoprzepustowy i nieinwazyjny, zarówno in vitro, jak i in vivo.

Biorąc pod uwagę nasze nowe zrozumienie roli interakcji białko-białko w fizjologii i patologii, istnieje duże zainteresowanie rozwojem narzędzi, które mogą być wykorzystane do badania tych interakcji w sposób ilościowy i w czasie rzeczywistym13,14,15,16. Rzeczywiście, nastąpił znaczny postęp w rozwoju strategii bioanalitycznych, w tym testów dwuhybrydowych drożdży (Y2H)17, powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)18 oraz testów rezonansowego transferu energii rezonansu Förster (FRET)19, w celu oceny interakcji białko-białko. Podejścia te mają jednak to ograniczenie, że wymagają znacznej optymalizacji orientacji reportera, tak że wiele konstrukcji musi zostać przetestowanych, aby znaleźć wydajną. Co więcej, podejścia te mają również stosunkowo niski stosunek sygnału do szumu, tak że rozpoznanie prawdziwej pozytywnej sygnalizacji może być trudne.

Testy komplementacji białek zostały opracowane w celu przezwyciężenia tych ograniczeń. Pierwsza generacja testów komplementacji białek opierała się na podzielonych wielokolorowych białkach fluorescencyjnych i nie mogła rozwiązać wyżej wymienionych ograniczeń20. Wielokolorowe białka fluorescencyjne składają się tylko z jednej domeny, co utrudnia rozdzielenie ich na dwa oddzielne stabilne fragmenty o niskim powinowactwie i szumie tła21. Następnie lucyferazy świetlika zidentyfikowano jako nowego kandydata do wykorzystania w opracowywaniu testów komplementacji rozszczepionych białek. W tym podejściu lucyferazy świetlika jest dzielona na dwa fragmenty (lucyferazy N-końcowa i C-końcowa [NLuc i CLuc]), przy czym każdy fragment jest połączony z docelowym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Jeśli NLuc i CLuc zbliżą się do siebie w wyniku interakcji dwóch białek docelowych, aktywność lucyferazy zostanie odtworzona i światło bioluminescencyjne zostanie wygenerowane w obecności substratu lucyferyny i ATP22. W 2001 roku, przeprowadzając kombinatoryczne badanie przesiewowe przy użyciu biblioteki zawierającej fragmenty NLuc i CLuc wycięte w różnych miejscach i przyłączone do białek z różnymi łącznikami, Paulmurugan i Gambhir z Uniwersytetu Stanforda opracowali zoptymalizowany system komplementacji wspomagany fragmentami lucyferazy świetlika dla interakcji białko-białko23. W tym systemie lucyferazy świetlika jest cięta na aminokwas (aa) 398, tworząc NLuc i CLuc, które są przyłączone do dwóch interesujących białek za pomocą elastycznego łącznika ośmiu reszt glicyny i dwóch reszt seryny.

Korzystając z podobnego podejścia, niedawno opracowaliśmy nowy LATS-BS, łącząc NLuc z 15 aa YAP otaczającym miejsce fosforylacji LATS w S127 (YAP15) i CLuc z 14-3-3. Nie zastosowano białka YAP o pełnej długości, aby uniknąć zakłóceń sygnałów przez potranslacyjne modyfikacje YAP (np. fosforylacja w innych miejscach i ubikwitynacja) przez inne regulatory. Prezentowany tutaj LATS-BS może nieinwazyjnie monitorować aktywność sygnalizacyjną hipopotama zarówno in vitro w żywych komórkach, jak i in vivo u myszy20,24 (Rysunek 2). W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomiaru aktywności kinazy LATS in vitro za pomocą LATS-BS. Po pierwsze, pokazujemy, w jaki sposób LATS-BS można wykorzystać do zbadania wpływu nadekspresji białka na aktywność LATS. Następnie pokazujemy, w jaki sposób bioczujnik może być wykorzystany do monitorowania aktywności szlaku Hippo po leczeniu środkami regulującymi szlak Hippo. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji i scharakteryzowania szlaków sygnałowych lub bodźców regulujących aktywność kinazy LATS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Badanie domniemanego regulatora sygnalizacji hipopotama za pomocą LATS-BS

  1. Posiewanie i transfekcja komórek
    1. Przygotowanie hodowli komórkowej
      1. Ciepły 1x PBS, DMEM zawierający 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny oraz 0,25% trypsyny-EDTA do 37 °C w łaźni wodnej przez około 30 min.
      2. Dokładnie wyczyść szafę bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem.
      3. W razie potrzeby umieścić szalki do hodowli tkankowych, pipety Pasteura, pipety serologiczne i końcówki pipet w kapturze do hodowli tkankowych.
      4. Wyjmij 1x PBS, pożywkę i trypsynę-EDTA z łaźni wodnej, wyczyść je 70% etanolem i umieść w okapie.
    2. Konserwacja i powlekanie komórek do transfekcji
      1. Do eksperymentu należy wybrać linię komórkową o wysokiej wydajności transfekcji (np. HEK293). Sprawdź ekspresję składników szlaku Hippo w tej linii komórkowej za pomocą western blot, aby upewnić się, że sygnalizacja Hippo jest aktywna.
      2. Hodować komórki HEK293 w DMEM na 10 cm szalkach Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Codziennie monitoruj komórki pod mikroskopem. Przejdź przez komórki zgodnie z poniższym opisem, gdy obserwuje się 80–90% konfluencji.
      3. Umyj komórki, dodając 5 ml 1x PBS do płytki, delikatnie obracając płytkę i całkowicie zasysając pożywkę.
      4. Dodaj 1 ml trypsyny-EDTA do płytki. Zakręć płytką, aby upewnić się, że trypsyna równomiernie pokrywa komórki.
      5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 5 minut lub do momentu odłączenia wszystkich komórek.
      6. Dodać 4 ml pożywki (z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny) w celu zneutralizowania trypsyny, ponownie zawiesić komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, a następnie dozować jedną dziesiątą (0,5 ml) komórek do nowych płytek o średnicy 100 mm (dla stosunku przejścia 1:10) zawierających 9,5 ml kompletnej pożywki.
      7. W przypadku transfekcji LATS-BS należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i umieścić 2 x 105 komórek w każdym dołku 12-dołkowej płytki 24 godziny przed transfekcją.
        UWAGA: Użycie większej liczby komórek może zwiększyć sygnał bioluminescencyjny tła, ponieważ aktywność sygnalizacyjna hipopotama jest regulowana przez konfluencję komórek. Używanie mniejszej liczby komórek może zwiększyć wrażliwość komórek na odczynniki do transfekcji i zwiększyć śmierć komórki24.
    3. Transfekcja LATS-BS samodzielnie lub razem z genem kandydującym
      1. Miniprep plazmidy LATS-BS (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro i 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) świeże z płynnej hodowli bakterii DH5a (niezbędne do osiągnięcia optymalnej ekspresji LATS-BS).
      2. Na 1 godzinę przed transfekcją odessać pożywkę z płytki, dodać 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka z 12-dołkowych płytek i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora.
        UWAGA: Poniższy protokół opisuje metody transfekcji przy użyciu dostępnego na rynku odczynnika do transfekcji na bazie polimerów. Inne odczynniki do transfekcji mogą być również odpowiednie do transfekcji; Jednak jeszcze ich nie przetestowaliśmy.
      3. Przygotować roztwory A i B zgodnie z opisem w tabeli 1. W przypadku transfekcji N należy przygotować (N + 0,5) x roztwór B premiks.
      4. Natychmiast dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji na bazie polimeru (roztwór B) do DNA (roztwór A). Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać.
      5. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcji.
      6. Dodać kroplami całkowitą objętość (76 μl) kompleksów transfekcyjnych do każdego dołka płytki 12-dołkowej, delikatnie obracając.
      7. Inkubować komórki przez noc (18–24 h) w temperaturze 37 °C.
        Uwaga: W przypadku komórek, które są wrażliwe na odczynniki do transfekcji na bazie polimerów, czas inkubacji można skrócić do 5 godzin.
      8. Nazajutrz po transfekcji usunąć pożywkę zawierającą kompleks transfekcji i zastąpić ją świeżą, kompletną pożywką. Hodować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejny dzień w celu przeprowadzenia testu lucyferazy.
  2. Test lucyferazy
    UWAGA: System testów reporterowych lucyferazy wykrywający świetlika i Renillę razem w jednym teście jest używany do testów lucyferazy. Jeśli Renilla nie była używana jako kontrola wewnętrzna, należy przeprowadzić jednoetapowy test lucyferazy, dodając LARII bez dodawania odczynnika do wykrywania Renilla.
    1. Przygotowanie lizatów komórkowych
      1. Rozcieńczyć 5x pasywny bufor do lizy (PLB) wodą destylowaną w następujący sposób:
      2. Wymagana całkowita objętość 1x PLB = N x (50 μL z 5x PLB + 200 μL dH2O) = N x 250 μL 1x PLB na studzienkę płytek 12-dołkowych (N = liczba próbek).
      3. Całkowicie zassać pożywkę. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej studzienki. Delikatnie obracaj płytką, aby usunąć oderwane komórki i resztki pożywki wzrostowej. Całkowicie zassać 1x PBS. Upewnij się, że przed dodaniem 1x PLB nie pozostały żadne resztki 1x PBS.
      4. Dodać 250 μL 1x PLB/studzienkę.
      5. Umieść płytki hodowlane na platformie bujanej z delikatnym kołysaniem, aby zapewnić całkowite i równomierne pokrycie monowarstwy komórek 1x PLB. Kołysz płytki hodowlane w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić lizie komórek.
      6. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Pomiar sygnału bioluminescencyjnego
      1. Wyjąć LARII (20 μl/próbkę) z temperatury -80 °C i zrównoważyć ją do temperatury pokojowej.
      2. Przygotować odczynnik do wykrywania Renilla do testów N: dodać (N + 1) x 0,4 μl 50x substratu do (N + 1) x 19,6 μl jego buforu.
      3. Wstępnie dozuj 10 μl lizatu komórkowego do probówek o pojemności 1,5 ml.
      4. Zaprogramuj luminometr tak, aby wykonywał 2-sekundowe opóźnienie pomiaru wstępnego, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru dla każdego podwójnego testu lucyferazy.
        UWAGA: Pierwszy i drugi pomiar będą odpowiadać odpowiednio sygnałowi LATS-BS i wewnętrznemu sygnałowi sterującemu Renilla. Można użyć dowolnego luminometru kompatybilnego z pojedynczą lub podwójną lucyferazy.
      5. Ostrożnie przenieś 20 μl odczynnika LARII do jednej probówki i szybko pipetuj w górę i w dół 3x, aby go wymieszać.
      6. Natychmiast umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
      7. Wyjąć probówkę z próbką z luminometru, natychmiast dodać 20 μl odczynnika Renilla i mieszać pipetując w górę i w dół 3x. Wprowadzić próbkę do luminometru i rozpocząć następny odczyt. Zapisz pomiary.
      8. Wyrzucić probówkę reakcyjną i przejść do następnej próbki.

2. Ekran do identyfikacji regulatorów szlaku hipopotama za pomocą LATS-BS

  1. Hodowla komórkowa i transfekcja
    1. Hodowla HEK293AD komórkach zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
      UWAGA: HEK293AD jest bardziej przylegający niż inne linie komórkowe HEK293, co czyni go dobrą linią komórkową do stosowania w badaniach przesiewowych.
    2. Odłączyć ogniwa zgodnie z opisem w sekcji 1.1.2. Policz i płytuj 2 x 106 komórek na płytkach 100 mm 24 godziny przed transfekcją.
    3. Na 1 godzinę przed transfekcją należy odessać pożywkę z płytki i zastąpić ją 5 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
    4. Przygotować roztwory A i B zgodnie z opisem w tabeli 2.
    5. Natychmiast dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji na bazie polimeru (roztwór B) do DNA (roztwór A). Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    6. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcji.
      1. Dodać całkowitą objętość (500 μl) kompleksów transfekcyjnych kroplami do komórek, delikatnie mieszając.
      2. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
      3. Następnego dnia trypsynizuj i policz komórki. Płytka 1 x 104 do 2 x 104 komórki do każdego dołka 96-dołkowej płytki w całkowitej objętości 100 μl pożywki na studzienkę. Wysiaduj przez kolejny dzień.
    7. Następnego dnia dodaj czynniki/małe cząsteczki regulujące szlak Hippo w końcowym stężeniu 10 μM do każdego dołka, 1-4 godziny przed wykonaniem testu lucyferazy.
      Uwaga: W przypadku większości małych cząsteczek/czynników 4-godzinna obróbka przy 10 μM nie wpływa na żywotność komórek. W przypadku zastosowania niższego stężenia leczenie może zostać przedłużone na dłuższy okres czasu.
  2. Test lucyferazy
    1. Test lucyferazy in vitro
      1. Całkowicie odessać pożywkę z komórek. Umyj komórki 100 μl 1x PBS w każdym dołku. Odessać całkowicie.
      2. Dodać 20 μl 1x PLB (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.1) do każdego dołka z 96-dołkowych płytek.
      3. Umieść płytki hodowlane na bujanej platformie z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej na 15 minut.
      4. Ostrożnie przenieś 20 μl odczynnika LARII do każdej studzienki i pipetuj 3x w górę iw dół, aby wymieszać.
      5. Natychmiast umieść płytkę w luminometrze do odczytu płytowego i rozpocznij odczyt.
    2. Test lucyferazy z żywych komórek
      1. Przygotuj 11x zapas D-lucyferyny w następujący sposób: rozpuść 1,5 mg proszku D-lucyferyny w 1 ml normalnej pożywki hodowlanej.
      2. Przenieś 10 μl 11x D-lucyferyny do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj ją z pożywką, która już znajduje się w studzience.
      3. Włóż komórki do inkubatora na 10 minut.
      4. Umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
        Uwaga: Jeśli intensywność sygnału nie jest wystarczająco silna przy tym stężeniu D-lucyferyny, do komórek można dodać kolejne 10 μl zapasu D-lucyferyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LATS-BS został połączony z różnymi genami, aby ocenić ich wpływ na aktywność LATS (Rysunek 3). W tym eksperymencie Renilla została użyta jako kontrola wewnętrzna. Przejściowa ekspresja YAP-5SA, konstytutywnej aktywnej formy YAP, powoduje wzrost poziomów celów transkrypcyjnych YAP, a następnie wzrost aktywności kinazy LATS poprzez ustalony szlak sprzężenia zwrotnego25. MST, aktywator LATS w szlaku Hippo (Rysunek 1), r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy szlak hipopotama odgrywa kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, a rozregulowanie szlaku hipopotama prowadzi do raka6, sposób, w jaki szlak hipopotama jest regulowany w odpowiedzi na różne bodźce, nie jest w pełni zrozumiały. Ponadto nie istniał żaden system ilościowy i działający w czasie rzeczywistym do oceny aktywności głównych komponentów Hippo. Niedawno opracowaliśmy i przeprowadziliśmy walidację nowego biosensora do pomiaru aktywności kinazy LATS w szlaku Hippo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR#119325, 148629) oraz Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (CBCF) dla XY. TA jest wspierana przez stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship oraz Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR jest wspierany przez stypendium Królowej Elżbiety II dla absolwentów w dziedzinie nauki i technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trypsyna-EDTA  Life Technologies25200560,25%
płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF1051
DMEMSigmaD6429-500mlDMEM o wysokiej zawartości glukozy 
Penicylina StreptomycynaLife Technologies15140122
PolyJet In Vitro Odczynnik do transfekcji DNA  SignagenSL100688,5
5x Pasywny bufor do lizyPromegaE194A30 ml
Dual-Glo® System testowy lucyferazyPromegaE2940100 ml zestaw
20/20 luminometrTurner Biosystems998-2036Luminometr jednorurkowy
GloMax® Nawigator z podwójnymi wtryskiwaczamiPromegaGM201096-dołkowy czytnik płytek luminometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94(2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715(2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061(2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test lucyferazowymonitorowanie aktywno ci kinazytransfekcja plazmidowakom rki HEK293przesiewanie ma ych cz steczekWestern blotilo ciowy PCRluminometr z czytnikiem p ytek

Powiązane artykuły