Method Article

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

DOI:

10.3791/58421

⸱

November 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, 2UNC/NC State Joint Department of Biomedical Engineering, UNC, 3Xona Microfluidics, LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofabrykowane metody podziału neuronów stały się niezbędnymi narzędziami dla wielu neurobiologów. Protokół ten opisuje użycie dostępnego na rynku, wstępnie zmontowanego plastikowego chipa do podziału hodowanych pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Te plastikowe chipy, zawarte w śladzie standardowego szkiełka mikroskopowego, są kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten pokazuje, jak wstecznie znakować neurony za pomocą izolowanych aksonów przy użyciu zmodyfikowanego wirusa wścieklizny kodującego białko fluorescencyjne, tworzyć izolowane mikrośrodowiska w jednym przedziale oraz wykonywać aksotomię i immunocytochemię na chipie. Neurony są hodowane przez >3 tygodnie w plastikowych chipach, co ilustruje kompatybilność tych chipów z długoterminowymi hodowlami neuronów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody hodowli neuronów skutkują losowym wzrostem aksonów i dendrytów, co uniemożliwia badanie neuronów w ich unikalnej spolaryzowanej morfologii. W ciągu ostatnich 10-15 lat mikrofabrykowane urządzenia wielokomorowe stały się dobrze znanymi i często wykorzystywanymi narzędziami badawczymi dla neurobiologów (odwołuje się do wybranych publikacji o wysokim znaczeniu1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17). Urządzenia te dzielą neurony na segmenty i zapewniają metodę fizycznego i chemicznego manipulowania subkomórkowymi regionami neuronów, w tym somatami, dendrytami, aksonami i synapsami18,19. Dostarczają również wielu paradygmatów eksperymentalnych, które nie są możliwe przy użyciu losowych kultur, w tym badań transportu aksonalnego, syntezy białek aksonalnych, uszkodzenia/regeneracji aksonów i sygnalizacji akson-soma. Podstawowa konfiguracja 2-komorowa składa się z dwóch równoległych kanałów mikroprzepływowych oddzielonych szeregiem mniejszych prostopadłych mikrorowków. Neurony pierwotne lub pochodzące z komórek macierzystych są umieszczane w jednym z kanałów mikroprzepływowych, osiadają i przyczepiają się do dolnej powierzchni urządzenia i rozszerzają neuryty w ciągu kilku dni. Wiele stożków wzrostu znajduje drogę do mikrorowków, które są na tyle małe, że uniemożliwiają przedostawanie się ciał komórkowych. Ponieważ stożki wzrostu są fizycznie ograniczone i nie są w stanie obracać się w mikrorowkach, rosną prosto do sąsiedniego przedziału (przedziału aksonalnego), gdzie są izolowane.

Historycznie, te urządzenia były formowane przy użyciu poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) z fotolitograficznie wzorzystej formy wzorcowej i są albo produkowane we własnym zakresie w laboratoriach śledczych, albo kupowane komercyjnie. Jedną z głównych wad korzystania z PDMS jest jego hydrofobowość20. PDMS może być tymczasowo hydrofilowy, ale potem szybko staje się hydrofobowy w ciągu kilku godzin w środowisku niewodnym20. Z tego powodu urządzenia muszą być przymocowane do szklanego szkiełka nakrywkowego lub innego odpowiedniego podłoża w momencie użytkowania. Wstępnie zmontowane wielokomorowe chipy z tworzywa sztucznego są teraz dostępne na rynku (np. XonaChips) w postaci tworzywa sztucznego formowanego wtryskowo. Chipy te są trwale hydrofilowe, co upraszcza zwilżanie urządzenia i umożliwia wstępny montaż chipa z cienką warstwą cyklicznego kopolimeru olefin (COC) otaczającą kanały mikroprzepływowe na dnie. Chipy te są wykonane z optycznie przezroczystego tworzywa sztucznego, odpowiedniego do obrazowania fluorescencyjnego w wysokiej rozdzielczości.

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie użycia wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do wielu paradygmatów eksperymentalnych przeprowadzanych przy użyciu mysich neuronów hipokampa lub kory mózgowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wstecznie oznaczać neurony za pomocą zmodyfikowanego wirusa wścieklizny w chipie. Opisano również aksotomię do badań nad uszkodzeniem i regeneracją aksonów. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić barwienie immunologiczne fluorescencyjne za pomocą urządzenia.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schemat plastikowego wielokomorowego układu scalonego jest pokazany w Rysunek 1A, B. Chip ma rozmiar standardowego szkiełka mikroskopowego (75 mm × 25 mm). Cechy chipa, w tym główne kanały lub komory, studzienki i mikrorowki, są oznaczone i udostępniane do wykorzystania w przyszłości. Rysunek 1C to zdjęcie układu scalonego demonstrujące płynną izolację komór.

1. Przygotowanie i powlekanie wielokomorowych wiórów

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść chip na szalce Petriego lub innym odpowiednim sterylnym pojemniku.
  2. Dodać 100 μl roztworu do powlekania wstępnego do lewego górnego dołka wióra i pozwolić mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki.
    UWAGA: Roztwór do wstępnego powlekania służy do wstępnego powlekania kanałów mikroprzepływowych w celu wyeliminowania możliwości uwięzienia pęcherzyków powietrza w chipie.
  3. Wypełnij lewą dolną studzienkę 100 μl roztworu do wstępnego powlekania. Odczekaj 5 minut, aby roztwór przepłynął przez mikrorowki.
  4. Dodaj 100 μl roztworu do powlekania wstępnego do prawego górnego dołka i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki. Napełnij prawą dolną studzienkę 100 μl roztworu do wstępnego powlekania.
  5. Odessać roztwór z każdej studzienki. Odessać z głównych kanałów, aby uniknąć usuwania płynu z głównych kanałów (Rysunek 2A). Natychmiast dodaj 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do lewego górnego dołka. Czekamy 1.5 min.
    UWAGA: Nie zasysaj całej cieczy z zamkniętych kanałów głównych.
  6. Dodaj 150 μl PBS do lewego dolnego dołka. Odczekaj 5 minut, aby płyny mogły przepłynąć przez mikrorowki. Dodaj 150 μl PBS do prawego górnego dołka. Dodaj 150 μl PBS do prawego dolnego dołka. Odczekaj 10 min.
  7. Powtórz kroki 1.5-1.6 dla drugiego prania PBS.
  8. Sprawdź chip pod mikroskopem hodowli tkankowej pod kątem pęcherzyków w głównych kanałach. Jeśli obecne są bąbelki, wykonaj poniższe procedury. Jeśli nie ma żadnych pęcherzyków, przejdź do kroku 1.9.
    1. Zassać PBS ze studzienek, odchylając końcówkę pipety od otworu kanału (Rysunek 2A).
    2. Dozować 100 μl roztworu do wstępnego powlekania do górnej studzienki, ustawiając końcówkę pipety pod kątem w pobliżu otworu kanału (Rysunek 2B). Bąbelki powinny przemieszczać się przez kanał do dolnej studzienki. Odczekaj 1.5 min.
    3. Powtórz kroki 1.3-1.8.
  9. Zassać PBS ze studzienek, odchylając końcówkę pipety od otworu kanału (Rysunek 2A).
  10. Dodaj 100 μl 0,5 mg/ml poli-d-lizyny (PDL) do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Napełnij lewą dolną studzienkę 100 μl PDL.
  11. Dodaj 100 μl PDL do prawego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Dodaj 100 μl do prawego dolnego dołka.
  12. Zamknąć szalkę Petriego i umieścić chip w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  13. Powtórz kroki mycia PBS 1.5-1.6 dwa razy, aby usunąć nadmiar PDL.
  14. Odessać PBS z urządzenia.
  15. Natychmiast dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Dodaj multimedia w lewym dolnym rogu. Dodaj multimedia w prawym górnym rogu. Odczekaj 1.5 min. Dodaj 100 μl pożywki do prawego dolnego dołka chipa.
  16. Umieść chip w inkubatorze w temperaturze 37°C, aż będzie gotowy do płytki komórek.

2. Umieszczanie neuronów w układach wielokomorowych

  1. Przygotuj zawiesinę komórkową zdysocjowanych neuronów hipokampa szczura zgodnie z ustalonymi protokołami21,22, aby uzyskać gęstość ~12 × 106 komórek/mL.
    UWAGA: Możliwe jest stosowanie gęstości zawiesiny komórek od 3 do 12 × 106 komórek/ml. Jeśli stosowana jest mniejsza gęstość, objętość zawiesiny komórek, która ma zostać dodana do chipa, może zostać zwiększona (patrz poniżej). Opisana poniżej procedura ma zastosowanie do mysich zdysocjowanych neuronów korowych lub hipokampa. Optymalna gęstość komórek dla innych typów neuronów może się różnić.
  2. Usuń większość pożywki z każdej studzienki chipa, pozostawiając około 5 μl w każdym dołku. Zasysaj z głównych kanałów, aby uniknąć usuwania cieczy z głównych kanałów (Rysunek 2A).
    UWAGA: Nie zasysaj cieczy z zamkniętych kanałów głównych. Pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione w chipie, jeśli płyn zostanie zasysany z głównych kanałów.
  3. Załaduj 5 μl zawiesiny komórek do prawego górnego dołka i kolejne 5 μl zawiesiny komórek do prawego dolnego dołka (łącznie ~120 000 komórek). Załaduj komórki, dozując je blisko głównego kanału (Rysunek 2B). Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że neurony znajdują się w głównym kanale. Odczekaj 5 minut, aby umożliwić przyłączenie się komórek.
    UWAGA: Neurony można załadować do dowolnej komory. Dla celów wyjaśnienia, przedział somatyczny jest głównym kanałem po prawej stronie, ale każdy przedział może być używany jako przedział somatyczny. Możliwe jest zastosowanie mniejszej gęstości komórek do 60 000 komórek na chip. Do każdej studzienki kompartmentu somatycznego można dodać do 10 μl zawiesiny komórkowej w połączeniu z zawiesiną komórkową zawierającą mniej komórek niż opisano powyżej.
  4. Dodaj około 150 μl pożywki do hodowli neuronów do każdej z górnych i dolnych prawych studzienek, a następnie dodaj 150 μl pożywki do każdej z górnych i dolnych lewych studzienek. Umieść wióry na nawilżonej tacy w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 37 °C.
  5. Po 24 godzinach należy dokonać wymiany pożywki, usuwając pożywkę z dołków. Upewnij się, że główny kanał pozostaje wypełniony. Dodaj 150 μl pożywki do każdej górnej studzienki, a następnie napełnij dolne studzienki.
  6. Umieść chip z powrotem w inkubatorze na żądaną liczbę dni.
    UWAGA: Monitoruj nośnik co kilka dni, aby upewnić się, że pozostaje jasnoróżowy. Jeśli podłoże jest żółtawe, zastąp 50% go świeżym podłożem. Jeśli poziom płynu jest niski, upewnij się, że jest odpowiednia wilgotność i odpowiednie wtórne zabezpieczenie wiórów, aby zapobiec parowaniu. Zminimalizowanie, a nawet wyeliminowanie zmian w pożywkach jest możliwe dzięki wtórnemu zabezpieczeniu i/lub pokryciu naczynia zawierającego wiór folią z politetrafluoroetylenu (PTFE)-FEP.

3. Wsteczne etykietowanie neuronów w chipie

UWAGA: Etykietowanie wsteczne może być wykonywane przy użyciu wielu technik, w tym przy użyciu zmodyfikowanej toksyny i wirusa wścieklizny. Poniżej znajdują się instrukcje dotyczące znakowania neuronów za pomocą wirusa Rabies-mCherry lub -eGFP z delecją G. Z potencjalnie zakaźnymi materiałami należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi lokalnej organizacji. Może być wymagane dodatkowe szkolenie.

  1. Podgrzej świeże pożywki do hodowli neuronów do 37 °C. Oszacuj ~400 μL pożywki na chip.
  2. Rozcieńczyć 100 000 jednostek wirusa zmodyfikowanego wirusa wścieklizny w sumie 50 μl, używając pożywki pobranej z dowolnej studzienki przedziału aksonalnego.
    UWAGA: Końcówki i rurki mające kontakt z wirusem należy utylizować zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez organizację.
  3. Delikatnie odpipetować pozostałe media z dołków komory aksonalnej i przechowywać w probówce wirówkowej w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 150 μl świeżej, ciepłej pożywki i 50 μl rozcieńczonego wirusa do komory aksonalnej. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. Usuń nośnik zawierający wirusa i zutylizuj go w odpowiedni sposób.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione w chipie, jeśli płyn zostanie zasysany z głównych kanałów.
  6. Delikatnie dodaj 75 μl świeżej pożywki do jednej studzienki aksonowej i pozwól jej spłynąć do drugiej studzienki aksonowej.
  7. Usunąć przepływ z drugiego dołka aksonu i odpowiednio zutylizować.
  8. Powtórz kroki 3.6 i 3.7 jeden raz.
  9. Dodaj z powrotem zapisane nośniki do komory aksonalnej. W razie potrzeby dodać około 50 μl świeżej pożywki, aby utrzymać odpowiednią objętość i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.
    UWAGA: Ekspresja białka fluorescencyjnego jest widoczna po 48 godzinach i utrzymuje się do 8 dni. Neurony można obrazować do 30 minut w temperaturze pokojowej w pożywce do hodowli neuronów. Pożywki hodowlane można również zastąpić ogrzewaną, niezależną od CO2 hibernacją E z B27 i obrazować przez dłuższy czas. Neurony można również obrazować w dobrze nawilżonej komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W tym przypadku nawilżanie ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania strat parowania w chipach, które są pogarszane przez ogrzewanie i mogą zagrozić zdrowiu neuronów.

4. Izolacja płynowa komory aksonalnej w chipie

  1. Usunąć 20 μl z lewej dolnej studzienki komory aksonalnej i umieścić w prawej górnej studzience komory somatycznej. Odczekaj 2 minuty, aż przepływ w każdym kanale się zrównoważy.
  2. Usunąć 50 μl pożywki z komory aksonalnej. Dodać 0,3 μl 1 mM hydrazydu Alexa Fluor 488 do tego podłoża, wymieszać za pomocą pipety i wrócić z powrotem do komory aksonalnej. Chip jest gotowy do obrazowania.
    UWAGA: Można dodać inne interesujące go związki. Zaleca się dodanie barwnika fluorescencyjnego o podobnej masie cząsteczkowej jak związek będący przedmiotem zainteresowania w celu monitorowania izolacji płynów w czasie.

5. Wykonywanie aksotomii w chipie

  1. Wyjmij pożywkę z komory aksonalnej, trzymając końcówkę pipety z dala od wejścia do głównego kanału (Rysunek 2A) i przechowuj ją w probówce wirówkowej.
  2. Całkowicie zassać komorę aksonalną, umieszczając pipetę aspiracyjną w pobliżu dowolnego wejścia głównego kanału komory aksonalnej (Rysunek 2B). Kontynuuj aspirację przez 1-2 minuty. Upewnij się, że roztwór został całkowicie wyjęty z komory.
    UWAGA: Podciśnienie do aspiracji musi wynosić co najmniej 18 cali-Hg, aby procedura aksotomii działała prawidłowo.
  3. Zastąp komorę aksonalną przechowywanym nośnikiem i potwierdź, że aksony są odcięte, patrząc na chip pod mikroskopem.
    UWAGA: Jeśli podczas wymiany podłoża w komorze aksonalnej tworzą się pęcherzyki, powtórz kroki 5.1-5.2.
  4. Włóż chip z powrotem do inkubatora.

6. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne w chipie

  1. Przygotować 4% roztwór utrwalający formaldehyd w PBS (4% formaldehydu, 1 μM MgCl2, 0,1 μm CaCl2, 120 mM sacharozy)
  2. Usuń większość nośnika z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór).
  3. Natychmiast dodać 100 μl roztworu utrwalającego do górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.
  4. Po 1 minutach dodać 100 μl roztworu utrwalającego do studzienek dennych. Utrwal na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń większość roztworu z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór). Natychmiast dodać 150 μl PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 2 minuty, aż PBS spłynie do studzienek dennych.
  6. Powtórz krok 6.5 dwa razy.
  7. Usuń większość PBS z dołków chipa. Natychmiast dodaj 150 μl PBS z 0,25% TritonX-100 do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 15 min.
  8. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 150 μl roztworu blokującego (10% normalnej koziej surowicy w PBS) do każdego z górnych dołków przedziałów aksonalnych i somatycznych. Poczekaj 15 min.
    UWAGA: Skuteczne roztwory blokujące powinny być specyficzne dla przeciwciała drugorzędowego, np. w przypadku przeciwciała drugorzędowego przeciwko owcom należy użyć surowicy osła w roztworze blokującym.
  9. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała (lub przeciwciał) w 1% normalnej surowicy koziej w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj, aby zminimalizować parowanie i odczekaj 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.
  10. Usuń większość roztworu z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór). Natychmiast dodać 150 μl PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 5 minut, aż PBS spłynie do studzienek dennych.
  11. Powtórz krok 6.10 dwa razy.
  12. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 100 μl przeciwciała wtórnego (lub przeciwciał) w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj, aby zminimalizować parowanie i odczekaj 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat zalecanego rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych.
  13. Powtórz kroki 6.10-6.11.
  14. W przypadku obrazowania w ciągu 1 dnia od barwienia immunologicznego należy przechowywać chip wypełniony PBS. Jeśli chip będzie przechowywany dłużej niż 1 dzień przed obrazowaniem, owiń naczynie zawierające chip w folię parafinową, aby zapobiec parowaniu i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do obrazowania.
  15. Do długotrwałego przechowywania próbek można stosować media montażowe (np. Fluoromount-G).
    1. Usuń większość płynu z dołków chipa. Użyj jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 1 ml, aby dodać 2 krople pożywki montażowej do każdej z górnych studzienek komór aksonalnych i somatycznych.
    2. Przechyl chip, aby ułatwić przepływ mediów montażowych przez kanały. Po 5 minutach dodaj 2 krople do studzienek dennych. Odczekaj 1 godzinę przed obrazowaniem.
      UWAGA: Po użyciu nośnika montażowego nie będzie możliwe ponowne sondowanie w poszukiwaniu innych celów.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po około 5-7 dniach wzrostu neuronów w chipie, wzrost aksonów jest widoczny. Chipy są kompatybilne z obrazowaniem z kontrastem fazowym, jak pokazano na rysunku Rysunek 3, który pokazuje wzrost neuronów po 24 dniach. Chipy są również kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym ( Rysunek 4, < silna klasa = "xfig" > Rysunek 5, Rysunek 6 i Rysunek 7). Trzy dni po zakażeniu wirusem wścieklizny przez przedział aksonalny, neurony mCherry-dodatnie z aksonami rozciągającymi się do przedziału aksonalnego zostały zobrazowane w chipie (Ryc. 4). Aby zademonstrować zdolność do płynnego izolowania przedziałów, do przedziału aksonalnego dodano barwnik fluorescencyjny o niskiej masie cząsteczkowej (hydrazyd Alexa Fluor 488). Wyniki te są porównywalne z opartym na PDMS chamber17 i pokazują przydatność plastikowego chipa do obrazowania z kontrastem fazowym i fluorescencji.

Aby zilustrować wzrost neuronów za pomocą plastikowych chipów i urządzeń PDMS, wyhodowaliśmy neurony na obu platformach i monitorowaliśmy ich wzrost w czasie. Rysunek 5 pokazuje wzrost neuronów od 3 do 22 dni w hodowli; Wyniki te są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Wzrost neuronów jest porównywalny w obrębie obu platform do 15 dni w hodowli, ale przy dłuższym wieku hodowli (>21 dni) izolowane aksony w plastikowym chipie wydają się zdrowsze z mniejszą ilością koralików (Ryc. 5A). Aby dokładniej uwidocznić aksony w przedziałach aksonalnych, przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne pod kątem β-tubuliny III, która wykazuje zdrowy wzrost aksonów w plastikowych chipach po 22 dniach w hodowli (Figura 5B).

Badania nad urazami i regeneracją aksonów są powszechne przy użyciu urządzeń z mikroprzepływowymi przedziałami. Aby zademonstrować przydatność tych badań z użyciem chipów, neurony znakowane wstecznie zostały zobrazowane przed i 24 godziny po aksotomii (Ryc. 6). Zarówno bańka retrakcyjna, jak i regenerujący akson są widoczne po aksotomii. Te wyniki są równoważne opublikowanym danym przy użyciu urządzeń opartych na PDMS14,17.

Immunocytochemia jest powszechną techniką wykonywaną w urządzeniach wielokompartmentowych do wizualizacji lokalizacji białek. Po 24 dniach w hodowli neurony w chipach zostały utrwalone i wybarwione zarówno pod kątem pobudzających, jak i hamujących markerów synaptycznych, odpowiednio vGlut1 i vGat (Ryc. 7). Zobrazowano również neurony mCherry oznaczone wstecznie (Ryc. 7C). Obrazowanie przeprowadzono przy użyciu konfokalnego dysku wirującego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem silikonowym o średnicy 60×, co wykazało zdolność do wykonywania obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Co ważne, kolce dendrytyczne były widoczne w powiększonym obszarze, co pokazuje, że neurony hodowane w chipach tworzyły dojrzałe synapsy.

figure-results-1
Rysunek 1: Wstępnie zmontowany, plastikowy, dwukomorowy układ mikroprzepływowy do podziału neuronów. (A) Schematyczne przedstawienie wielokomorowego chipa pokazujące lokalizację górnej i dolnej studzienki. (B) Powiększony schemat chipa przedstawiający główne kanały (lub przedziały) i mikrorowki łączące komory. Główne kanały mają wymiary około 1,5 mm × 7 × 0,060 mm (szer. × dł. × wys.). Szerokość i wysokość mikrorowków wynoszą odpowiednio około 0,01 mm × 0,005 mm. Długość mikrorowków różni się w zależności od konfiguracji, od 0,15 mm do 0,9 mm. (C) Fotografia reprezentatywnego wielokomorowego chipa zawierającego barwnik spożywczy w każdym głównym kanale lub komorze wykazującej zdolność do płynnego izolowania każdego kanału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Techniki pipetowania potrzebne przy użyciu plastikowych wielokomorowych chipów. (A) Podczas dodawania i zasysania pożywki do płukania, końcówka pipety powinna być odchylona od wejścia do głównego kanału, jak pokazano. (B) Podczas ładowania neuronów lub wykonywania aksotomii, końcówka pipety powinna być ustawiona pod kątem w kierunku wejścia do głównego kanału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mikrografia z kontrastem fazowym pokazująca typowy wzrost neuronów w chipie po 24 dniach hodowli. Embrionalne neurony hipokampa zostały umieszczone w prawym przedziale somatycznym. Wzrost aksonów jest widoczny w przedziale aksonalnym począwszy od 5-7 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Neurony znakowane wstecznie wyrażają fluorescencyjne białko mCherry i rozszerzają aksony do płynnie izolowanego przedziału aksonalnego. (A) Scalony mikrogram fluorescencyjny pokazujący żywe neurony znakowane wstecznie zakażone zmodyfikowanym wirusem wścieklizny mCherry na krótko nałożonym na przedział aksonalny. Neurony obrazowano 3 dni po zakażeniu po 21 dniach w hodowli. Tworzenie izolowanego mikrośrodowiska w przedziale aksonalnym wykazano poprzez zastosowanie barwnika o niskiej masie cząsteczkowej, hydrazydu Alexa Fluor 488. (B) Scalony obraz (A) zawierający obraz różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w celu wizualizacji obszaru mikrorowków chipa. Obrazy uzyskano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego przy użyciu soczewki obiektywowej 30×/1,05 N.A. z olejem silikonowym (ne = 1,406). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Porównanie wzrostu neuronów w wielokompartmentowych urządzeniach PDMS i plastikowych chipach. (A) Mikrofotografie z kontrastem fazowym obu platform wykonane w 3, 7, 15 i 22 dniu w hodowli. Na dole znajduje się obszar o większym powiększeniu wykonany ze zdjęć po 22 dniach, aby zilustrować wzrost aksonów w tym wieku na obu platformach. Aksony w chipie są bardziej ciągłe i wydają się zdrowsze niż w urządzeniu PDMS w tym wieku. (B) Odwrócony mikrofluorescencyjny mikrograf aksonów barwionych β-tubuliną III w przedziale aksonalnym zarówno urządzenia PDMS, jak i plastikowego chipa po 22 dniach hodowli. Obrazy uzyskano za pomocą systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem przy użyciu soczewki obiektywowej 20x/0,45 N.A. Wszystkie paski skali mają rozmiar 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Aksotomia i regeneracja neuronów hipokampa w plastikowym chipie wielokomorowym. (Góra) Neurony znakowano wstecznie za pomocą zmodyfikowanego wirusa wścieklizny mCherry, a następnie obrazowano przed aksotomią po 24 dniach w hodowli. Obrazy zostały pseudopokolorowane przy użyciu tabeli wyszukiwania kolorów "Ogień". (Na dole) Ten sam neuron, który został zobrazowany w górnym panelu, został zobrazowany 24 godziny po aksotomii. Białe przerywane linie pokazują krawędzie bariery z mikrorowkami. Aksotomia nastąpiła w miejscu lewej linii przerywanej. Biały grot strzałki pokazuje żarówkę chciągnącą. Biała strzałka oznacza regenerujący się akson. Obrazy uzyskano za pomocą systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem przy użyciu soczewki obiektywowej 20×/0,45 N.A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Synapsy tworzą się między neuronami hipokampa hodowanymi w plastikowych wielokomorowych chipach. Barwienie immunologiczne przeprowadzono po 24 dniach w hodowli i zobrazowano w przedziale somatycznym za pomocą soczewki zanurzeniowej z olejkiem silikonowym o mocy 60×. Neurony wyrażają (A) marker synaps pobudzających, vGlut1 (zielony) i (B) marker synaps hamujących, vGAT (niebieski). (C) Neurony mCherry znakowane wstecznie (na czerwono) zostały zakażone zmodyfikowanym wirusem wścieklizny nałożonym na przedział aksonalny. (D) Scalony mikrogram fluorescencyjny vGlut1, vGat i mCherry. (E) Powiększony obszar w (D) oznaczony białą ramką pokazuje kolce dendrytyczne, miejsca, które otrzymują sygnały synaptyczne od innych neuronów. Obrazy uzyskano za pomocą systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem przy użyciu soczewki obiektywowej 60×/1,3 N.A. z olejem silikonowym (ne = 1,406). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plastikowe wióry wielokomoroweUrządzenia wielokomorowe PDMS
Izolowanie aksonówIzolowanie aksonów
Tworzenie mikrośrodowiskTworzenie mikrośrodowisk
Aksotomizacja neuronówAksotomizacja neuronów
optycznie przezroczystyoptycznie przezroczysty
Kompatybilny z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczościKompatybilny z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości
kompatybilny z mikroskopią fluorescencyjnąkompatybilny z mikroskopią fluorescencyjną
W pełni zmontowanywymagany montaż do podłoża
Zdrowe aksony >21 dniZdrowe aksony >14 dni
hydrofilowa powierzchnia hodowlihydrofobowy
Nieprzepuszczalny dla gazówprzepuszcza gaz
zaokrąglone mikrorowki i kanałyMikrorowki proste
Mniej etapów przygotowawczychgóra jest zdejmowana do barwienia w mikrorowkach
Nie jest kompatybilny z ablacją laserowąabsorpcja małych cząsteczek i rozpuszczalników organicznych
Nie jest kompatybilny z olejkami immersyjnymi na bazie olejów mineralnych (oleje na bazie silikonu są w porządku)

Tabela 1: Porównanie platform wielokompartmentowych z tworzywa sztucznego i PDMS do hodowli neuronów.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plastikowe chipy wielokomorowe zapewniają łatwą w użyciu opcję podziału neuronów, zapewniając długoterminowe hodowle neuronów (>3 tygodnie). Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób hodować mysie neurony korowe i hipokampowe w tych chipach. Omówiono również tworzenie rozpuszczalnych mikrośrodowisk oraz sposoby wstecznego znakowania neuronów, wykonywania aksotomii i immunocytochemii. Co ważne, chipy te są kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, fluorescencji i na żywo.

Plastikowe chipy wielokomorowe zapewniają wiele takich samych funkcji, jak urządzenia z przedziałami opartymi na PDMS, ale mają zalety, wady i pewne cechy wyróżniające. Tabela 1 zawiera porównanie funkcji zarówno chipów z tworzywa sztucznego, jak i urządzeń opartych na PDMS. Przede wszystkim wióry są wstępnie zmontowane i trwale hydrofilowe, co ułatwia ich zwilżanie, dzięki czemu są łatwiejsze w użyciu. Plastik nie przepuszcza gazów, w przeciwieństwie do PDMS, więc jeśli w kanałach nieoczekiwanie utworzą się pęcherzyki, nie wydostaną się one łatwo i należy je usunąć. Roztwór do wstępnego powlekania zawierający głównie etanol i niektóre inne zastrzeżone środki eliminuje tworzenie się pęcherzyków.

Obrazowanie na żywo projekcji po transdukcji białek fluorescencyjnych przeprowadzono w obrębie chipów (ryc. 4) i nie stwierdzono wykrywalnej autofluorescencji tworzywa sztucznego. Zastrzeżenie polega na tym, że olejki immersyjne używane z chipem do obiektywów o dużej aperturze numerycznej muszą być na bazie oleju silikonowego, a nie na bazie oleju mineralnego. Olej mineralny może powodować niepożądane reakcje z cyklicznym kopolimerem olefiny. W przypadku obrazowania w jasnym polu ważne jest, aby pamiętać, że mikrorowki w chipie są zaokrąglone na końcach i następuje stopniowe zwężanie się kierunku z głównych kanałów w kierunku bariery mikrorowków, co powoduje pewne załamanie światła na obu końcach mikrorowków podczas obrazowania w jasnym polu (ryc. 3). Ponieważ chip jest wstępnie zmontowany, penetracja przeciwciał do mikrorowków o wielkości mikronów może być nierównomierna (jak w przypadku trwale połączonych urządzeń opartych na PDMS); W związku z tym należy przeprowadzić analizę ilościową po barwieniu immunologicznym w kanałach/kompartmentach. Barwienie immunologiczne projekcji neuronalnych w mikrorowkach można poprawić, tworząc różnicę objętości między przedziałami, aby wspomóc przepływ przeciwciał i fluoroforów do mikrorowków.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.M.T. jest wynalazcą komory/układu mikroprzepływowego (US 7419822 B2) i jest członkiem Xona Microfluidics, LLC. V.P. jest pracownikiem Xona Microfluidics, LLC. J.H. jest członkiem Xona Microfluidics, LLC. T.N. deklaruje brak konkurencyjnych interesów finansowych. Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie jest sponsorowana przez Xona Microfluidics.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za pomoc techniczną lub redakcyjną Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) i Brad Taylor (Xona). Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Xona Microfluidics, LLC i National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Obrazowanie było częściowo wspierane przez Confocal and Multiphoton Imaging Core Facility of NINDS Center Grant P30 NS045892 i NICHD Center Grant (U54 HD079124). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
XonaChipXona Microfluidics, LLCXC150150 & mikro; Bariera mikrorowkowa o długości m
Xona Microfluidics, LLCXC450 m długość bariery
mikrorowkowej Xona Microfluidics, LLCXC900900 µ Bariera z mikrorowkami o długości
m XC powłoka wstępna Xona Microfluidics, LLCXC Pre-Coatw zestawie z XonaChips
XonaPDL Xona Microfluidics, LLCXonaPDL
E17/E18 ciężarne szczury Sprague Dawley w ciążyCharles River24100564
pożywki do hodowli neuronów:
- Pożywka neuropodstawowaSuplement ThermoFisher Scientific
Plus (50x)ThermoFisher ScientificA3582801
- Suplement GlutaMAXThermoFisher Scientific
(100x)ThermoFisher Scientific 15240112
fluorowana folia etylenowo-propylenowaAmerykański Durafilm50Agrubości 0,5 milimetra
Salk Instytut Badań BiologicznychG-deleted Wścieklizna-eGFPWymagana umowa o transferze materiału
Salk Institute for Biological StudiesG-deleted Rabies-mCherryWymagana umowa transferu materiału
Alexa Fluor hydrazyd 488ThermoFisher ScientificA10436
Fluoromount GThermoFisher Scientific00-4958-02
Szklane pipety PasteuraSigma-AldrichCLS7095D5X SIGMA5,75 o długości
hibernate-E MediumThermoFisher ScientificA1247601
Pierce 16% formaldehydThermoFisher Scientific28906
PBS (10x)ThermoFisher ScientificQVC0508
normalna surowica koziaThermoFisher Scientific16210064
triton X-100ThermoFisher Scientific28314
NeuroMab75-066klon N28/9, 1:100
przeciwciało anty-vGATSynaptic Systems131 0031:1000
anti_beta-tubulina IIIAvesTUJ1:1000
Przeciwciała drugorzędowe Alexa FluorInkubator ThermoFisher Scientific1:1000
, 5% CO2 37 ° C
System obrazowania epifluorescencyjnegoEVOS System obrazowania fluorescencyjnegoAMF4300obiektywem 10x
System obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiemAndor TechnologyCSU-X1, iXon X3 EMCCD60x olej silikonowy i 20x
obiektywy Laserowy skaningowy system obrazowania konfokalnegoOlympusFV3000RS30x obiektyw z olejem silikonowym
450 µ 21103049-B-27 35050061-Antybiotyk-Przeciwgrzybicze Zmodyfikowany wirus wścieklizny o Przeciwciało anty-vGlut1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  2. Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
  3. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
  4. Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
  5. Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
  7. Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
  8. Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
  9. Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
  10. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  11. Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
  12. Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
  13. Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
  14. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
  15. Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
  16. Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611(2017).
  17. Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625(2017).
  18. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  19. Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
  20. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  21. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
  22. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipNeuron CompartmentalizationPrimary Rat NeuronsAxonal CompartmentSomatic CompartmentPoly D Lysine CoatingFluorescence ImmunostainingAxotomy ProcedureRetrograde LabelingLong Term Culture

Related Articles