Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58431

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Leicester Cancer Research Centre and Ernest and Helen Scott Haematology Research Institute, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit, University of Leicester

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Streszczenie

Aktywność nieprawidłowych komórek T-pęcherzykowych (Tfh) jest wykrywalna w chorobach autoimmunologicznych, a ich obecność jest związana z wynikami klinicznymi, gdy analizowane jest mikrośrodowisko węzłów chłonnych w chłoniaku nieziarniczym komórek B. Podzbiory krążących komórek pomocniczych pęcherzyków T (cTfh), krążącego przedziału pamięci komórek Tfh we krwi, są również zaburzone w chorobie i dlatego stanowią potencjalne nowe biomarkery predykcyjne. Badania krwi obwodowej są korzystne, ponieważ są stosunkowo nieinwazyjne i umożliwiają proste monitorowanie seryjne. W artykule opisano metodę izolacji limfocytów T CD4+ z krwi ludzkiej oraz dalszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej w celu zliczenia komórek cTfh i proporcji ich różnych podzbiorów (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 i cTfh1/17). Poziom tych podgrup porównano następnie między osobami zdrowymi a pacjentami z chłoniakiem. Okazało się, że metoda była wystarczająco solidna, aby uzyskać wiarygodne wyniki z rutynowo pobieranego materiału pacjenta. Opisaną przez nas technikę analizy można łatwo dostosować do sortowania komórek i dalszych zastosowań, takich jak RT-PCR.

Wprowadzenie

T-pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) to podzbiór limfocytów T CD4+, który początkowo został scharakteryzowany w tkankach limfatycznych1. Komórki te wyrażają receptory powierzchniowe PD-1 i CXCR5, wydzielają IL-21 i IL-4 oraz wykazują ekspresję jądrową czynnika transkrypcyjnego, BCL-62,3. Jak sama nazwa wskazuje, znajdują się one w centrach rozrodczych i są niezbędne do produkcji przeciwciał o wysokim powinowactwie1.

Dysregulowane odpowiedzi Tfh są związane z patogenezą chorób, zwłaszcza z chorobami autoimmunologicznymi, gdzie sprzyjają ekspansji autoreaktywnych komórek B4. Odgrywają również rolę w mikrośrodowisku guza zarówno solid5,6, jak i nowotworów limfoidalnych7. I odwrotnie, defekty genetyczne białek powierzchniowych niezbędnych do funkcjonowania Tfh, takich jak indukowalny kostymulator limfocytów T (ICOS), powodują ludzkie zespoły niedoboru odporności8. Komórki CD4 + CXCR5 + w ludzkiej krwi obwodowej są określane jako krążące komórki pomocnicze T-pęcherzyków (cTfh) i uważa się, że są przedziałem pamięci komórek Tfh w tkankach9. Celem opisanej tutaj metody jest analiza podzbiorów cTfh po izolacji komórek CD4 + z próbek krwi obwodowej.

Zdefiniowano kilka podzbiorów cTfh, a efektywność, z jaką zapewniają one pomoc komórkom B, różni się w zależności od podzbioru9,10,11,12. Względne proporcje tych podzbiorów są zmienione w wielu chorobach, z których najbardziej widoczna jest choroba autoimmunologiczna, w której prawie zawsze występuje względny wzrost bardziej funkcjonalnych podzbiorów PD-1+/hi i/lub cTfh2 lub cTfh17 w porównaniu z mniej funkcjonalnymi podzbiorami PD-1 i/lub cTfh112. Zakres tych zmian często wiąże się z parametrami klinicznymi, w tym aktywnością choroby i mianami autoprzeciwciał, co wskazuje na potencjalną rolę dystrybucji podzbioru cTfh jako biomarkera prognostycznego w chorobie, który może odzwierciedlać aktywność Tfh w tkankach limfatycznych9,12,13,14. Ponadto pobieranie próbek krwi od uczestników jest szybkie, bezpieczne i akceptowalne, a więc umożliwia seryjne monitorowanie w celu analizy postępu choroby lub odpowiedzi na terapię.

Użycie izolowanych limfocytów T CD4+ zamiast tradycyjnych zawiesin komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) umożliwia eksperymenty z cytometrią przepływową o wyższej przepustowości, skracając czas potrzebny do pozyskania znacznej liczby komórek cTfh do analizy. Jest to szczególnie przydatne podczas sortowania komórek z rzadkich podzbiorów cTfh przy użyciu sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS). Aby zwiększyć wydajność, zawiesiny te mogą być kriokonserwowane, aby umożliwić "grupowanie" próbek do wykorzystania w eksperymencie cytometrii przepływowej. Podczas testów czystość CD4+ nie została zmniejszona przez krioprezerwację.

Podczas gdy różne laboratoria używały różnych markerów do kategoryzacji komórek cTfh we wczesnych stadiach ich odkrycia, metoda przedstawiona tutaj wykorzystuje ujednolicony schemat dwóch grup markerów powierzchni komórek, jak zaproponowali Schmidt et al.12,15, aby umożliwić jednoczesną identyfikację cTfh i ich dziewięciu rozpoznanych podzbiorów w jednym eksperymencie cytometrii przepływowej.

Ponieważ używane są tylko markery powierzchni komórek, komórki nie wymagają utrwalenia ani przepuszczalności, a zatem mogą pozostać żywe do dalszych badań funkcjonalnych. Można to ułatwić poprzez sortowanie komórek za pomocą FACS z tym samym panelem przeciwciał. Panel ten można rozszerzyć o inne markery, co pozwala na ograniczenie stosowania cytometru przepływowego.

Analiza eksperymentów z wielokolorową cytometrią przepływową może być trudna ze względu na z natury subiektywną naturę bramkowania na dwuwymiarowych wykresach punktowych, zwłaszcza gdy populacje komórek nie mają wyraźnego rozkładu dwumodalnego we fluorescencji markerów, jak to ma miejsce w przypadku komórek cTfh i ich podzbiorów. Z tego powodu konieczne jest ustanowienie skutecznych kontroli w celu zmniejszenia liczby artefaktów, aby umożliwić lepszą rozdzielczość populacji i pewne ustalanie strategii bramkowania. W związku z tym projekt panelu przeciwciał i konfiguracja podstawowych kontroli dla eksperymentu cytometrii przepływowej, tj. przy użyciu kompensacji i kontroli FMO, są przedstawione odpowiednio w kroku 3.4.2 i 3.4.3.

Wszystkie komórki cTfh są zdefiniowane jako CD4+ CXCR5+ CD45RA-. Następnie można określić poziom ekspresji charakterystycznego markera aktywacji Tfh PD-1 w celu identyfikacji podzbiorów komórek PD-1-, PD-1+ lub PD-1hi cTfh. Następnie, wykorzystując kombinację receptorów chemokiny CXCR3 i CCR6, które są różnie wyrażane przez tradycyjne komórki Th1,2 lub 17, cTfh można scharakteryzować jako cTfh1,2 lub 17-podobne przez profil CXCR3 + CCR6-, CXCR3- CCR6- i CXCR3- CCR6+, odpowiednio.

Panel przeciwciał używany przez nasze laboratorium jest wyświetlany w Tabeli 1. Użytkownik może być zmuszony do dostosowania wyboru fluoroforu, aby uwzględnić konfigurację lasera i filtra światła dostępną w lokalnym cytometrze przepływowym.

Następujące względy wpływają na wybór fluoroforów. Tam, gdzie to możliwe, używaj jasnych fluoroforów. W szczególności używaj najjaśniejszych dostępnych fluoroforów na najciemniejszych (mniej wyrazistych) markerach. Markery ściemniacza obejmują PD-1, CXCR3 i CCR6 oraz, w mniejszym stopniu, CXCR5. W szczególności wykorzystaliśmy nowsze fluorofory BB, BV i BUV, które zapewniają doskonałą jasność, a tym samym umożliwiają łatwiejszą rozdzielczość różnych populacji komórek.

Rozłóż wybór fluoroforów na widmach emisyjnych tak bardzo, jak to możliwe, aby zminimalizować nakładanie się widm, a tym samym wymagany poziom kompensacji. Bezpłatne narzędzie online, które można wykorzystać do pomocy w projektowaniu panelu cytometrii przepływowej, można znaleźć tutaj: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Aby zaoszczędzić miejsce w widmie emisyjnym, zastosowaliśmy "kanał zrzutu" poprzez użycie barwnika żywotności o długości fali emisyjnej, która pokrywa się z długością fali APC-H7 (sprzężonej z CD45RA), aby umożliwić wykrycie (i wykluczenie) zarówno martwego, jak i / lub CD45RA+ za pomocą jednego detektora.

Tutaj przedstawiono protokół izolacji limfocytów T CD4+ krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji różnych i ostatnio opisanych krążących podzbiorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki krwi pobrano od osób zdrowych (NS) (n = 12), jak również od pacjentów z chłoniakiem strefy brzeżnej (MZL) (n = 7) i innymi typami chłoniaka nieziarniczego z komórek B (BNHL) (6 pacjentów z FL, 2 pacjentów z chłoniakiem limfoplazmatycznym i 1 pacjent z chłoniakiem nieziarniczym z komórek B o niskim stopniu złośliwości). Pacjenci zostali zrekrutowani z klinik hematologicznych w Leicester Royal Infirmary po wyrażeniu świadomej, pisemnej zgody na wszystkie badania, z obowiązującą etyczną zgodą. Aprobata etyczna została uzyskana przez Komitet Etyki Badań Naukowych Leicestershire, Northamptonshire i Rutland 1, numer referencyjny 06/Q2501/122 dla próbek od pacjentów oraz Komitet ds. Badań nad Zdrowiem (HRA) NRES East Midlands-Derby, numer referencyjny 14/EM/1176 dla osób zdrowych.

1. Izolacja limfocytów T CD4+ z całej krwi obwodowej

  1. Pobrać świeżą krew obwodową (od 2 do 15 ml) do probówek K2EDTA za pomocą standardowego nakłucia dożylnego i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby utrzymać maksymalną żywotność.
    nuta: Stosować standardowe laboratoryjne środki ochrony osobistej (fartuch, rękawice, okulary) i wykonywać prace w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego II klasy.
  2. Przynieś krew i wszystkie niezbędne odczynniki (koktajl wzbogacający CD4 +, 2% płodowa surowica bydlęca/sól fizjologiczna buforowana fosforanem (FBS / PBS), pożywka o gradiencie gęstości i pożywka do zamrażania w przypadku kriokonserwacji komórek) do temperatury pokojowej.
  3. Wymieszaj krew z dostępnym na rynku koktajlem przeciwciał w celu wzbogacenia ludzkich limfocytów T CD4 +. Użyj 50 μl odczynnika na każdy 1 ml krwi. Użyj stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml na 5 do 15 ml krwi.
    nuta: Jeśli używasz od 2 do 4 ml krwi, wykonaj ten krok w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml.
  4. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  5. Rozcieńczyć mieszaninę równą objętością 2% FBS/PBS
  6. Tę rozcieńczoną mieszaninę należy powoli nakładać na podłoże o gradiencie gęstości, aby uniknąć zakłócenia granicy faz i natychmiast przystąpić do wirowania, aby uniknąć dyfuzji krwi do pożywki o gradiencie gęstości.
    1. W przypadku 2 do 3 ml krwi należy użyć 3 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml, ale w przypadku 4 ml krwi należy użyć 4 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml, a w przypadku 5 do 15 ml krwi należy użyć 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  7. Odwirować warstwową mieszaninę przez 20 minut przy 1 200 x g z wyłączonym hamulcem w temperaturze 20 °C.
    nuta: Temperatura poniżej otoczenia może spowodować zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami i granulocytami. Niższa prędkość spowoduje, że proces izolacji CD4+ zakończy się niepowodzeniem. Pozostawienie włączonej przerwy zmniejszy wydajność komórek. Użyj wirówki stołowej z wirnikami, które można zamknąć, aby uniknąć aerozoli.
  8. Usuń wzbogaconą warstwę komórek CD4+ z interfejsu za pomocą pipety Pasteura.
    nuta: Wzbogacona warstwa komórkowa będzie przypominać standardową "kożuchową powłokę" białych, mętnych komórek, ale ponieważ obecne są tylko komórki CD4 +, będzie ona naturalnie mniejsza i trudniejsza do zobaczenia.
  9. Dodaj 2% FBS/PBS do komórek CD4+ do całkowitej objętości 10 ml, a następnie przemyj dwukrotnie 2% FBS/PBS, wirując przez 10 minut przy 400 x g podczas każdego prania.
  10. Zawiesić osad w 2% FBS/PBS i policzyć komórki zabarwione życiodajnym barwnikiem (błękitem trypanowym) w celu określenia liczby komórek i żywotności.
  11. Opcjonalny krok: ponowne zawieszenie 5 x 105 do 1 x 106 komórek w pożywce zamrażającej (10% dimetylosulfotlenku w FBS) w 1 ml podwielokrotności.
    nuta: Poziomy niektórych markerów powierzchniowych mogą ulec zmianie w wyniku kriokonserwacji i rozmrażania. Dlatego bardzo ważne jest, aby wszystkie próbki były przetwarzane w sposób konsekwentny. W celu zminimalizowania różnic w zmiennych analitycznych, próbki zostały zakonserwowane kriogenicznie i zgrupowane do analizy w tym badaniu.

2. Cytometria przepływowa

  1. Kriokonserwowane komórki CD4+ szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i raz umyć w podgrzanym podłożu (RPMI 1640 + L-glutamina uzupełniona 10% FBS i 1x penicylina-streptomycyna).
  2. Dodać komórki do 9 ml pożywki, odwirować przez 5 minut przy 400 x g i usunąć supernatant.
  3. Zawiesić komórki w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (50 μl), tak aby każdy badany stan wykorzystywał od 5 x 105 do 1 x 106 komórek.
  4. Wymieszaj komórki z buforem barwiącym (50 μl).
    UWAGA: Brilliant Stain Buffer zapobiega różnym artefaktom barwienia, które mogą zakłócać analizę danych, gdy dwie lub więcej plam BV lub BUV jest używanych jednocześnie ze względu na nieodłączne właściwości chemiczne tych barwników. W warunkach jednobarwnych lub niebarwionych 50 μl brylantowego buforu do barwienia można zastąpić 50 μl 1% BSA/PBS.
  5. Dodać przeciwciała do komórek (zgodnie z kolumną "wykorzystana objętość" w tabeli 1) i inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut.
  6. Umyj komórki dwukrotnie w 1% BSA/PBS, odwirowując przez 3 minuty przy 600 x g podczas każdego mycia.
  7. Zawiesić w 1% BSA/PBS (400 μl) i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej.
  8. Delikatnie zwiruj komórki przed uzyskaniem danych na cytometrze przepływowym:

3. Kontrola i konfiguracja cytometrii przepływowej

  1. Używając niebarwionej próbki, ustaw napięcia fotodiody tak, aby limfocyty mogły zostać oddzielone od oczywistych szczątków i martwych komórek (zdarzenia z obszarem wysokiego rozproszenia bocznego (SSC) i obszarem niskiego rozproszenia przodu (FSC))16. Używając pojedynczych barwionych próbek, ustaw napięcia fotopowielacza (PMT) tak, aby można było odróżnić fluorescencję dodatnią od fluorescencji tła, upewniając się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w wykrywalnej skali.
    nuta: Ulepszeniem byłoby wykreślenie CV w stosunku do napięcia PMT dla każdego PMT za pomocą słabo fluorescencyjnych koralików w celu znalezienia minimalnego napięcia dla optymalnej rozdzielczości (metoda "Peak 2"19).
  2. Uwzględnij nakładanie się widma, generując matrycę kompensacyjną przy użyciu pojedynczych barwień z kulkami wychwytującymi. Dodaj dostępne w handlu kulki kompensacyjne (60 μL) i kulki kontroli ujemnej (60 μL) do 1% BSA/PBS (100 μL) i vortex.
    nuta: Użyte kulki wychwytujące muszą być zgodne z gatunkiem gospodarza i izotypem IgG stosowanego przeciwciała. Macierz kompensacji powinna zostać ponownie obliczona, jeżeli zmieni się numer partii jakichkolwiek barwników tandemowych, ponieważ mogą one wykazywać znaczną zmienność widm emisji między partiami.
  3. Dodać pojedyncze przeciwciało (20 μl) i wirować.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
  5. Wirować przy 200 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
  6. Zawiesić ponownie w 1% BSA/PBS (500 μL) i wirować.
  7. Pobrać próbkę za pomocą cytometru przepływowego za pomocą wyznaczonego generatora matrycy kompensacyjnej w oprogramowaniu do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Użyj kontrolek FMO, aby pokierować rozmieszczeniem bramek dla fluorescencji markera dodatniego, aby uwzględnić rozlanie barwnika, który jest głównym źródłem fluorescencji tła w eksperymentach z użyciem ≥4 kolorów16. Postępuj zgodnie z ogólnym protokołem barwienia powierzchni komórki, jak opisano w kroku 3, ale dla każdego warunku pomiń jeden z fluoroforów z etapu barwienia (gdzie CD45RA jest pominięty, pomiń również żywą/martwą plamę). Zdobądź 100 000 limfocytów dla każdego schorzenia.
  9. Ustaw dodatnią bramkę na ≤0,5% komórek. Zobacz Rysunek 2 ilustruje przykład kontrolek FMO.

4. Analiza danych

  1. Skorzystaj z oprogramowania do akwizycji cytometru przepływowego, aby ustawić próg 5,000 jednostek na parametrze FSC, aby wykluczyć bardzo małe zanieczyszczenia.
  2. Użyj bramki zatrzymującej, aby uzyskać 10 000 komórek cTfh (CD4+, CD45RA- CXCR5+).
    nuta: Indywidualny użytkownik może zebrać ponad 10 000 komórek. Liczba ta stanowiła kompromis między zebraniem wystarczającej liczby komórek, aby zapewnić miarodajne wyniki, a czasem potrzebnym na pobranie.
  3. Korzystając z wykresu punktowego obszaru FSC / obszaru SSC, narysuj elipsę lub bramkę wielokątną, aby wybrać populację limfocytów, wykluczając szczątki i jawnie martwe komórki (zdarzenia o wysokim obszarze SSC i niskim obszarze FSC).
  4. Korzystając z wykresu punktowego FSC-Area / FSC-Width, narysuj bramkę wielokątną, aby zaznaczyć pojedyncze komórki, wykluczając dublety (dublety mają zwiększony obszar, ale podobną szerokość jak pojedyncze komórki).
  5. Korzystając z obszaru FSC / CD45RA i wykresu punktowego znacznika żywotności, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać żywe komórki CD45RA- (komórki o niskiej fluorescencji dla tego markera).
  6. Korzystając z wykresu punktowego FSC-Area / CD4, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki CD4+ (komórki o wysokiej fluorescencji dla tego markera).
  7. Korzystając z wykresu punktowego CD4 / CXCR5, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki CXCR5+ (tj. cTfh) (komórki o wysokiej fluorescencji dla tego markera).
  8. Korzystając z wykresu punktowego CXCR3 / CCR6, umieść poczwórną bramkę, aby podzielić komórki cTfh na komórki cTfh1,2 i 17 (komórki, które są wysokie i niskie dla każdego markera).
    nuta: Komórki o fenotypie CD4+, CXCR5+, CXCR3+, CCR6+, są słabo scharakteryzowane. Odnosimy się do tych komórek jako cTfh1/1718, ponieważ konwencjonalne limfocyty T pomocnicze (CD4 + CXCR5-), które przechodzą między Th17 i Th1, wykazują ekspresję CXCR3 i CCR6 i zostały opisane jako cTfh1/1719.
  9. Korzystając z histogramu PD-1, użyj narzędzia zakresu, aby podzielić komórki cTfh (lub, jeśli wolisz, poszczególne podzbiory cTfh1,2,17 lub 1/17) na populacje PD-1-/+ lub hi.
    nuta: Rozróżnienie między PD-1+ a PD-1hi nie jest dobrze zdefiniowane w literaturze. Próg ustalono jako taką samą intensywność PD-1 wymaganą do wykrycia Tfh w dobrej wierze w zawiesinach limfocytów migdałków ludzkich przy użyciu cytometrii przepływowej z tym samym panelem przeciwciał. Alternatywnie do panelu przeciwciał można dodać marker ICOS, ponieważ tylko komórkihi PD1 są ICOS+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wysoką czystość CD4+ osiągnięto stosując protokół izolacji CD4+, który okazał się niezawodny dla wszystkich przebadanych przez nas próbek krwi (średnia: 96,6%, SD: 2,38, n=31) (Rycina 3).

Przedstawiono identyfikację komórek cTfh (CD4+ CXCR5+) u reprezentatywnej zdrowej osoby (Rysunek 4A). Odsetek całkowitych k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten stanowi prosty i skuteczny sposób analizy komórek cTfh krwi obwodowej, umożliwiając wykrycie wszystkich istotnych podzbiorów zidentyfikowanych do tej pory w literaturze. Próbki krwi można łatwo i sprawnie pozyskiwać w ramach standardowych przychodni, a próbki seryjne mogą być pobierane równolegle z danymi klinicznymi. To z kolei umożliwia badania prospektywne oceniające podzbiory cTfh jako biomarkery progresji choroby lub odpowiedzi na leczenie. Badania te byłyby szczególnie uzasadnione w chorobach, w któryc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca została wsparta grantem z Leukaemia UK dla ETB i MJA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RosetteSep Ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD4+STEMCELL TECHNOLOGIES15062
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Nauki przyrodnicze17144003
BUV395 Mysz anty-ludzka CD183  Klon 1C6/CXCR3BD Horizon565223
BV711 Mysz anty-ludzka CD196 (CCR6)  Klon 11A9BD Horizon563923
BV421 Szczur anty-ludzki CXCR5 (CD185)  Klonowanie  RF8B2BD Horizon562747
BB515 Mysz anty-ludzka CD4  Klon   RPA-T4BD Horizon564419
PE Mysz anty-ludzka CD279  Klon MIH4BD Pharmingen557946
APC-H7 Mysz anty-ludzka CD45RA Klon  HI100BD Pharmingen560674
LIVE/DEAD Zestaw do nawożenia Far Red Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nmThermoFisher ScientificL34973
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794
Anti-Mouse Ig, κ/Zestaw cząstek kompensujących kontrolę negatywnąBD CompBead552843
Cytometr przepływowy FACS Aria IIBD Nauki biologiczne644832
FACSDiva 6.1.3BD Biosciences643629Oprogramowanie do akwizycji cytometru przepływowego
FlowJo 10.2Treestar Inc.Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej Przeciwciało
anty-CXCR3BD Horizon 
Przeciwciało anty-CCR6BD Horizon 
Przeciwciało anty-CXCR5BD Horizon 
Przeciwciało anty-CD4BD Horizon 
Przeciwciało anty-PD-1BD Pharmingen 
Przeciwciało anty-CD45RABD Pharmingen 
560674 Marker żywotnościThermoFisher Scientific L34973
565223563923562747564419557946

Bibliografia

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458(2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468(2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja limfocyt w T CD4kr ce kom rki Tfhanaliza cytometrycznasubpopulacje kom rek Tfhanaliza krwi obwodowejwyliczanie subpopulacji cTfhanaliza biomarker w ch oniakaprzygotowanie do sortowania kom rekzastosowania w p niejszych analizach RT PCR
Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.