Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aktywność nieprawidłowych komórek T-pęcherzykowych (Tfh) jest wykrywalna w chorobach autoimmunologicznych, a ich obecność jest związana z wynikami klinicznymi, gdy analizowane jest mikrośrodowisko węzłów chłonnych w chłoniaku nieziarniczym komórek B. Podzbiory krążących komórek pomocniczych pęcherzyków T (cTfh), krążącego przedziału pamięci komórek Tfh we krwi, są również zaburzone w chorobie i dlatego stanowią potencjalne nowe biomarkery predykcyjne. Badania krwi obwodowej są korzystne, ponieważ są stosunkowo nieinwazyjne i umożliwiają proste monitorowanie seryjne. W artykule opisano metodę izolacji limfocytów T CD4+ z krwi ludzkiej oraz dalszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej w celu zliczenia komórek cTfh i proporcji ich różnych podzbiorów (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 i cTfh1/17). Poziom tych podgrup porównano następnie między osobami zdrowymi a pacjentami z chłoniakiem. Okazało się, że metoda była wystarczająco solidna, aby uzyskać wiarygodne wyniki z rutynowo pobieranego materiału pacjenta. Opisaną przez nas technikę analizy można łatwo dostosować do sortowania komórek i dalszych zastosowań, takich jak RT-PCR.
Wprowadzenie
T-pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) to podzbiór limfocytów T CD4+, który początkowo został scharakteryzowany w tkankach limfatycznych1. Komórki te wyrażają receptory powierzchniowe PD-1 i CXCR5, wydzielają IL-21 i IL-4 oraz wykazują ekspresję jądrową czynnika transkrypcyjnego, BCL-62,3. Jak sama nazwa wskazuje, znajdują się one w centrach rozrodczych i są niezbędne do produkcji przeciwciał o wysokim powinowactwie1.
Dysregulowane odpowiedzi Tfh są związane z patogenezą chorób, zwłaszcza z chorobami autoimmunologicznymi, g....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki krwi pobrano od osób zdrowych (NS) (n = 12), jak również od pacjentów z chłoniakiem strefy brzeżnej (MZL) (n = 7) i innymi typami chłoniaka nieziarniczego z komórek B (BNHL) (6 pacjentów z FL, 2 pacjentów z chłoniakiem limfoplazmatycznym i 1 pacjent z chłoniakiem nieziarniczym z komórek B o niskim stopniu złośliwości). Pacjenci zostali zrekrutowani z klinik hematologicznych w Leicester Royal Infirmary po wyrażeniu świadomej, pisemnej zgody na wszystkie badania, z obowiązującą etyczną zgodą. Aprobata etyczna została uzyskana przez Komitet Etyki Badań Naukowych Leicestershire, Northamptonshire i Rutland 1, numer referencyjny 06/Q2501/122 dla próbek od pacjentów o....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wysoką czystość CD4+ osiągnięto stosując protokół izolacji CD4+, który okazał się niezawodny dla wszystkich przebadanych przez nas próbek krwi (średnia: 96,6%, SD: 2,38, n=31) (Rycina 3).
Przedstawiono identyfikację komórek cTfh (CD4+ CXCR5+) u reprezentatywnej zdrowej osoby (Rysunek 4A). Odsetek całkowitych k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten stanowi prosty i skuteczny sposób analizy komórek cTfh krwi obwodowej, umożliwiając wykrycie wszystkich istotnych podzbiorów zidentyfikowanych do tej pory w literaturze. Próbki krwi można łatwo i sprawnie pozyskiwać w ramach standardowych przychodni, a próbki seryjne mogą być pobierane równolegle z danymi klinicznymi. To z kolei umożliwia badania prospektywne oceniające podzbiory cTfh jako biomarkery progresji choroby lub odpowiedzi na leczenie. Badania te byłyby szczególnie uzasadnione w chorobach, w któryc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca została wsparta grantem z Leukaemia UK dla ETB i MJA.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RosetteSep Ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD4+ | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Nauki przyrodnicze | 17144003 | |
| BUV395 Mysz anty-ludzka CD183 Klon 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mysz anty-ludzka CD196 (CCR6) Klon 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Szczur anty-ludzki CXCR5 (CD185) Klonowanie RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mysz anty-ludzka CD4 Klon RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mysz anty-ludzka CD279 Klon MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mysz anty-ludzka CD45RA Klon HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Zestaw do nawożenia Far Red Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nm | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Zestaw cząstek kompensujących kontrolę negatywną | BD CompBead | 552843 | |
| Cytometr przepływowy FACS Aria II | BD Nauki biologiczne | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Oprogramowanie do akwizycji cytometru przepływowego |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej Przeciwciało | |
| anty-CXCR3 | BD Horizon | ||
| Przeciwciało anty-CCR6 | BD Horizon | ||
| Przeciwciało anty-CXCR5 | BD Horizon | ||
| Przeciwciało anty-CD4 | BD Horizon | ||
| Przeciwciało anty-PD-1 | BD Pharmingen | ||
| Przeciwciało anty-CD45RA | BD Pharmingen | ||
| 560674 Marker żywotności | ThermoFisher Scientific | L34973 |
Bibliografia
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009). <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
