Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58437

⸱

12 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Streszczenie

Tłumaczenie nowych odkryć na choroby ludzkie jest ograniczone przez dostępność modeli chorób opartych na ludzkich tkankach. Precyzyjnie wycięte plastry płuc (PCLS) stosowane jako hodowle tkanki płucnej 3D (3D-LTC) reprezentują elegancki i biologicznie bardzo istotny model hodowli komórkowej 3D, który bardzo przypomina tkankę in situ ze względu na swoją złożoność, biomechanikę i skład molekularny. Krojenie tkanek jest szeroko stosowane w różnych modelach zwierzęcych. 3D-LTC pochodzące z ludzkich PCLS mogą być wykorzystywane do analizy odpowiedzi na nowe leki, co może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów i efektów funkcjonalnych leków w tkance ludzkiej. Przygotowanie PCLS z chirurgicznie wyciętych próbek tkanki płucnej pacjentów, którzy przeszli lobektomię płuc, zwiększa dostępność chorej i okołonowotworowej tkanki. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkiego PCLS z chirurgicznie wyciętej miękko-elastycznej tkanki płucnej pacjenta. Agaroza została wprowadzona do przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowej resektów, zachowując w ten sposób strukturę płuc i zwiększając sztywność tkanki, co ma kluczowe znaczenie dla późniejszego krojenia. Plastry o grubości 500 μm przygotowano z bloku tkankowego za pomocą wibratomu. Stemple biopsyjne pobrane z PCLS zapewniają porównywalne rozmiary próbek tkanek i dodatkowo zwiększają ilość próbek tkanek. Uzyskane hodowle tkanki płucnej mogą być wykorzystane w różnych badaniach biologii płuc człowieka, w tym nad patofizjologią i mechanizmami różnych chorób, takimi jak procesy zwłóknieniowe w najlepszym wydaniu na poziomie (sub)komórkowym. Największą zaletą modelu ex vivo 3D-LTC jest jego ścisłe odwzorowanie ludzkiego płuca in situ pod względem architektury tkanek 3D, różnorodności typów komórek i anatomii płuc, a także potencjału oceny tkanek od poszczególnych pacjentów, co jest istotne dla dalszego rozwoju nowych strategii medycyny precyzyjnej.

Wprowadzenie

Przewlekłe i ostre choroby płuc są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Dla pacjentów z przewlekłymi chorobami płuc, takimi jak obturacyjna choroba płuc (POChP)2, ciężka astma3, rak płuc4 i rozlane choroby miąższowe płuc5, terapie lecznicze nie są obecnie dostępne. Chociaż badania na modelach zwierzęcych chorób płuc pogłębiły zrozumienie patomechanizmów choroby6 i doprowadziły do zidentyfikowania potencjalnych nowych celów terapeutycznych7,8,9, modele te wykazują istotne różnice biologiczne i fizjologiczne w porównaniu z ludźmi10. Aby przezwyciężyć te rozbieżności między biologią i anatomią myszy i człowieka, systemy hodowli ludzkiej tkanki płucnej ex vivo w 3D (3D-LTC) są stosowane w różnych obszarach badań biomedycznych. Te systemy hodowli 3D-LTC są oparte na precyzyjnie wyciętych wycinkach płuc (PCLS). Generacja PCLS ex vivo pozwala na analizę trzeciej wymiarowości przestrzennej, co pozwala na badanie relacji przestrzennych i funkcjonalnych komórek w całych pęcherzykach płucnych i drogach oddechowych11, a także śródmiąższu, układu naczyniowego i międzybłonia. Warto zauważyć, że modele PCLS ex vivo są wielokomórkowe, co oznacza, że zawierają większość funkcjonalnych komórek płuc in situ, dzięki czemu ściśle reprezentują natywne środowisko biologiczne komórek, a tym samym przezwyciężają ograniczoną interakcję komórka-komórka i komórka-macierz w większości podejść do hodowli komórkowych 2D. Do tej pory mysie PCLS ex vivo były używane do modelowania chorób płuc, takich jak POChP12, zwłóknienie płuc13, rak płuc14, infekcja wirusowa15,16, dysplazja oskrzelowo-płucna17 i astma18. Jednak znaczna część nowatorskich terapii lekowych w chorobach płuc u ludzi, które były badane w badaniach klinicznych, nie przekłada się na praktykę kliniczną ze względu na ich brak skuteczności lub bezpieczeństwa, przypuszczalnie z powodu jeszcze znacznych różnic między biologią i chorobą człowieka i myszy19,20,21.

Przez kilka lat, ludzkie PCLS były głównie wykorzystywane do oceny toksyczności płuc substancji chemicznych i leków. Dopiero od niedawna ludzka tkanka płucna została wykorzystana od pacjentów z POChP22,23, asthma24 i lung fibrosis25, do prowadzenia badań patofizjologicznych i farmakologicznych. Korzystając z wyciętego materiału narządu pacjenta i generując jego PCLS, można podsumować główne cechy charakterystyczne choroby w złożonym środowisku tkankowym 3D22 reprezentującym i utrzymującym większość natywnej różnorodności komórkowej narządu. Co więcej, wykazano, że chora tkanka zastosowana w różnych konfiguracjach eksperymentalnych naśladuje podobne do choroby zmiany w wątrobie, jelitach i nerkach26,27,28,29.

Jednak przetwarzanie tkanki płucnej pozostaje wyzwaniem z kilku powodów. W przeciwieństwie do tkanki stałej, natywny miąższ płuc ma tendencję do zapadania się bez wentylacji i wykazuje mniejszą sztywność tkanek. Właściwości te utrudniają krojenie tkanki. W ten sposób wypełnienie dróg oddechowych i przestrzeni pęcherzykowej agarozą o niskiej temperaturze topnienia zachowuje natywną strukturę płuc i zapewnia sztywność potrzebną do precyzyjnego krojenia płuc mysich i ludzkich30. Resekcje płuc ludzkich oddawane do celów badawczych są ze swej natury anatomicznie, genetycznie i fizjologicznie bardzo zróżnicowane, przez co często wykazują dużą zmienność między pacjentami podczas wykonywania eksperymentów25. W przeciwieństwie do wysiewów całego płata lub całych płuc, próbki płuc wycięte za pomocą chirurgii klatki piersiowej niekoniecznie podążają za segmentami anatomicznymi i dlatego wymagają specjalnego przygotowania. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy i zoptymalizowany protokół generowania ludzkich PCLS z wyciętej tkanki płucnej oraz ich późniejszej hodowli i eksperymentalnego wykorzystania do modelowania choroby płuc.

Protokół

Użycie ludzkiej tkanki zostało zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu Ludwika i Maksymiliana [Monachium, Niemcy (numer projektu 455-12)]. Wolne od guza resekcje płuc u ludzi zostały wykonane przez Biobank Chorób Płuc Asklepios (Gauting, Niemcy, numer projektu 333-10).

UWAGA: Wszystkie procedury produkcji PCLS u ludzi (Rysunek 1) są wykonywane pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym.

1. Przygotowanie instrumentów i materiałów

  1. Przygotuj wszystkie materiały do napompowania tkanki płucnej agarozą, jak opisano poniżej.
    1. Przygotuj podłoże uprawowe: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12 uzupełnione L-glutaminą, HEPES, 10 000 IE penicyliny, 10 000 IE Streptomycyną i 0,1% (v/v) płodową surowicą bydlęcą.
      UWAGA: Pożywkę stosuje się w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj sterylną metalową tacę pokrytą bibułą. Umieść na tacy sterylne naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm.
    3. Napełnij naczynie do hodowli komórkowych 15 ml podłoża hodowlanego.
    4. Przygotować 3% (w/v) roztwór agarozy, rozpuszczając odpowiednią ilość agarozy o niskiej temperaturze topnienia w co najmniej 30 ml podłoża uprawowego.
    5. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej do wrzenia. Schłodzić roztwór agarozy do temperatury 42 °C w łaźni wodnej. Płynny roztwór agarozy należy przechowywać w łaźni wodnej.
    6. Przygotuj kilka stożkowych probówek o pojemności 50 ml wypełnionych ciekłą agarozą.

2. Wycięta tkanka płucna

  1. Świeżą, wolną od guza tkankę płucną po resekcji lobektomii należy przechowywać natychmiast po resekcji w pożywce DMEM F-12 w temperaturze 4 °C do etapu 3.
  2. Nie należy przekraczać czasu zimnego niedokrwienia wynoszącego 4-8 godzin przed obróbką.

3. Kontrola i selekcja wyciętej tkanki przed wypełnieniem agarozą

  1. Wyjmij tkankę z podłoża za pomocą pęsety. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, zwłaszcza opłucnej, należy dotykać tkanki pęsetą tylko w drogach oddechowych.
  2. Ocenić jakość tkanek za pomocą kryteriów punktacji wypełnienia agarozy płucnej zdefiniowanej w tabeli 1.
  3. Przejdź do kroku 4, jeśli jakość tkanki jest wyższa lub równa 72. Jeśli jakość tkanki jest niższa niż 60, nie należy kontynuować wypełniania agarozą.
    UWAGA: Jeśli wynik tkanki wynosi od 60 do 68, wypełnienie agarozą i krojenie tkanek nadal może przynieść rozsądne wyniki, a ostateczna decyzja o przedłużeniu eksperymentu musi być podjęta indywidualnie dla każdego przypadku. Jednak tkanka płucna, która nie spełniała wyżej wymienionych wymagań, w większości przypadków nie radzi sobie z wypełnieniem agarozowym.

4. Powiększanie tkanki płucnej przez wypełnienie agarozą

  1. Wyjmij tkankę z podłoża i odcedź nadmiar pożywki z tkanki. Przenieść tkankę płucną do 15-centymetrowego naczynia hodowlanego przygotowanego w 1.1.2.
  2. Napełnić strzykawkę o pojemności 30 ml agarozą o niskiej temperaturze topnienia z ppkt 1.1.3.
  3. Przygotować cewnik do żył obwodowych, usuwając zasłonę i podłączając ją do strzykawki o pojemności 30 ml
  4. Zidentyfikuj oskrzela (o średnicy 0,5-3 mm) w tkance, która wentyluje nienaruszony fragment tkanki (patrz Rysunek 2).
  5. Wprowadź kaniulę do wybranego oskrzela (średnica 0,5-3 mm).
  6. Delikatnie popchnij kaniulę delikatnie do przodu tak daleko, jak to możliwe.
  7. Uszczelnij oskrzela wokół kaniuli, uciskając ścianę oskrzeli wokół kaniuli za pomocą kleszczy, najlepiej zaciskając jednocześnie sąsiednią tętnicę płucną.
  8. Za pomocą zacisku chirurgicznego należy zatkać inne dodatkowe drogi oddechowe, aby zapobiec przeciekaniu agarozy przez te drogi oddechowe.
  9. Podnieś tkankę kleszczami z naczynia hodowlanego.
  10. Ręcznie wlewaj agarozę strzykawką nie szybciej niż 0,3 ml/s. Szybkość napełniania agarozą może wahać się od około 0,05 do 0,3 ml/s ze względu na niejednorodny opór dróg oddechowych i/lub niedodmę.
  11. Jeśli zaobserwuje się wysoki opór podczas wypełniania lub wyciek agarozy z tkanki, spróbuj ponownie wykonać całą procedurę z innym oskrzelem z kroku 4.4. Wykonaj rozwiązywanie problemów zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Stopień wypełnienia agarozy jest w dużym stopniu zależny od położenia cewnika w tkance, a głęboka penetracja cewnika powoduje wypełnienie agarozą małych obszarów przypominających stożki (*) tkanki płucnej (Rysunek 2C).
    1. W przypadku dużego oporu spróbuj ustawić cewnik tak, aby doprowadzić do prawidłowego wypełnienia większości obszarów tkanki (#) (Rysunek 2D).
    2. Ponieważ czopy wcześnie zestalonej agarozy w proksymalnych oskrzelach lub inne przeszkody w drogach oddechowych (strzałka) mogą prowadzić do niepełnego wypełnienia tkanki (Rysunek 2E), nie należy wymuszać wypełniania agarozą, ponieważ może to prowadzić do wad w wypełnionym obszarze, ale nie w wypełnieniu niedrożnych części tkanki.
    3. Jeśli drzewo oddechowe pochodzące z kaniulowanego oskrzela zostanie uszkodzone podczas resekcji, a wypełnienie agarozowe powoduje ciągły wyciek płynnej agarozy (strzałka w Rysunek 2F), wprowadź cewnik do bardziej obwodowej części układu dróg oddechowych, aby wypełnić przynajmniej niewielką część tkanki (*) (Rysunek 2G). Dodatkowo uszczelnij uszkodzone obwodowe drogi oddechowe zaciskiem chirurgicznym (strzałka) (Rysunek 2H).
  12. Arozę należy nakładać, aż tkanka płucna zostanie całkowicie wypełniona. Nie należy nadmiernie napompowywać tkanki, ponieważ może to spowodować nieodwracalne uszkodzenie struktury tkanki i jej komórek.
  13. Natychmiast zacisnąć oskrzela, które zostało użyte do wypełnienia. Wyjmij kaniulę przed zaciśnięciem.
  14. Inkubować tkankę w pożywce w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby zapewnić zestalenie agarozy.
  15. Jeśli wycięta tkanka ma wiele wejść oskrzelowych, powtarzaj kroki od 4.2 do 4.13, aż wszystkie części tkanki zostaną wypełnione agarozą.
  16. Skrawki tkanki płucnej wypełnione agarozą przechowywać w zimnym podłożu o temperaturze 4 °C do czasu pokrojenia.

5. Precyzyjnie cięte krojenie płuc

  1. Zidentyfikuj obszary w tkance płucnej, które są solidnie wypełnione agarozą. Solidnie wypełnione obszary nie zapadną się, gdy zostaną delikatnie dociśnięte pęsetą do dna naczynia do hodowli komórkowej.
    1. Należy wyciąć 1-1,5cm3 blok obszarów opisanych w ppkt 5.1, podczas gdy jedna strona powinna być nadal pokryta opłucną.
  2. Przymocuj każdy pojedynczy blok tkanki stroną opłucnową stykającą się z uchwytem wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
    UWAGA: Opłucna jest lekko elastyczna i dlatego utrudnia cięcie ostrzem wibratomowym. Umieszczona na uchwycie na chusteczkę opłucna nie będzie przeszkadzać w nacięciu i co ważne, tworzy naturalną barierę pomiędzy klejem cyjanoakrylowym a miąższem tkanki, pozwalając na minimalną dyfuzję kleju.
  3. Pokrój tkankę płucną za pomocą wibratomu z następującymi ustawieniami: grubość: 500 μm, częstotliwość: 100 Hz, amplituda noża: 1,2 mm, prędkość posuwu ostrza 3-12 μm/s, która zależy od sztywności tkanki. Zmniejsz prędkość wysunięcia ostrza, jeśli plasterek nie zostanie prawidłowo przycięty lub jeśli sam blok tkanki zacznie wibrować.
  4. Delikatnie przenieś plasterek, podnosząc go kleszczami z tacki na wibratomy do studzienki na 12-dołkowej płytce wypełnionej podłożem uprawowym. Na koniec inkubuj wycinki płuc w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej.
  5. Przerwij krojenie, gdy 2-3 mm bloku tkanki pozostaną niepokrojone, ponieważ klej cyjanoakrylowy mógł zagrozić integralności tkanki tego obszaru.

6. Generacja stempli PCLS

  1. Przenieś plastry płuc z jednego dołka do pustego naczynia o średnicy 10 cm.
  2. Umieść dziurkacz do biopsji o średnicy 4 mm prostopadle do górnej powierzchni PCLS i zacznij przesuwać dziurkacz w prawo i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
  3. Wlać pożywkę do hodowli komórkowych do dołków 96-dołkowej płytki. Podnieś stemple do tkanek za pomocą kleszczy i przenieś stemple do dołków 96-dołkowej płytki. Na koniec inkubować ciosy płucne zanurzone w pożywce przygotowanej w ppkt 1.1.1. w inkubatorze do hodowli komórkowych w warunkach standardowych (21% (v/v) tlenu, 5% (v/v) dwutlenku węgla i 95% wilgotności, w temperaturze 37 °C).

7. Hodowla tkankowa i pobieranie próbek

  1. Hodować PCLS i stempel przez noc w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej.
  2. Hodowla PCLS i stemplowanie w określonych warunkach przez maksymalnie 120 godzin po ich wytworzeniu w celu zapewnienia żywotności i funkcji komórek.
  3. W celu zebrania białka i RNA należy trzykrotnie przepłukać PCLS i stemple w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), przenieść je do kriowiali i zamrozić w ciekłym azocie.
  4. Próbka supernatantu z hodowanych stempli PCLS do analizy wydzielanych białek.
    1. Do analiz histologicznych przemyć PCLS i stemple trzykrotnie PBS i utrwalić je 4% paraformaldehydem w inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Na koniec należy przechowywać PCLS w PBS w temperaturze 4 °C w celu dalszego barwienia.

Wyniki

Generowanie PCLS
Proces generowania PCLS można podzielić na cztery podstawowe etapy: chirurgiczną resekcję tkanki płucnej, wypełnianie agarozą, generowanie PCLS za pomocą wibratomu oraz hodowlę PCLS. Wycięta tkanka płucna jest wypełniana agarozą o niskiej temperaturze topnienia, co nadaje tkance płucnej sztywność niezbędną do krojenia oraz pozwala zachować naturalną strukturę i architekturę płuc. Należy zauważyć, że generowanie PCLS jest procesem bardzo czasochłonnym, dlatego jako dodatkowy etap często stosuje się przechowywanie wypełnionej tkanki płucnej przez noc w pożywce DMEM F-12, a generowanie PCLS rozpoczyna się następnego dnia. W zależności od późniejszego układu eksperymentalnego, wygenerowane PCLS mogą być inkubowane przez noc w standardowej pożywce do hodowli komórkowej zawierającej 0,1% (w/v) płodowej surowicy bydlęcej przed zastosowaniem warunków eksperymentalnych. 3D-LTC pozostawały żywe i wykazywały funkcjonalność komórkową (taką jak sekrecja białek surfaktantu) do 120 h22 w warunkach hodowli opisanych w niniejszym protokole (Rysunek 1) i mogą zostać zoptymalizowane w wyniku dalszych ulepszeń.

Wypełnianie agarozą
W celu wypełnienia tkanki agarozą, kaniulę cewnika do żył obwodowych o średnicy 1,3 mm, podłączoną do strzykawki z agarozą, wprowadzono do oskrzela na powierzchni przekroju tkanki (Rysunek 2A). Oskrzela często znajdują się w pobliżu tętnicy płucnej. Podczas gdy tętnice mają cieńsze ściany i mają tendencję do zapadania się, oskrzela charakteryzują się dobrze widocznym światłem. W zależności od stopnia integralności tkanki, cewnik można wprowadzić przez kilka generacji drzewa oddechowego w głąb obwodu płuca. Przebite oskrzele uszczelniono wokół kaniuli za pomocą pęsety (Rysunek 2B). Jednocześnie pęsetą można zacisnąć tętnicę płucną. Następnie tkankę unosi się i delikatnie wprowadza płynną agarozę do dróg oddechowych.

W zależności od położenia cewnika, większość tkanki może zostać wypełniona płynną agarozą (Ryc. 2D). Opcjonalnie, stożkowate fragmenty tkanki płucnej, odpowiadające miąższowi płuc wentylowanemu przez przeniknięty oskrzele, mogą zostać wypełnione agarozą (Ryc. 2C). W obu scenariuszach można zaobserwować charakterystyczny wzór solidnie wypełnionych obszarów tkanki: po pierwsze, główna część tkanki jest wypełniona w kształcie klinów (Ryc. 2D), lub po drugie, pojawiają się mniejsze, wystające, okrągłe obszary całkowicie wypełnionej tkanki (Ryc. 2C). Jeśli fragmenty dróg oddechowych zostaną zablokowane przez skrzepy agarozy lub z innych przyczyn, części tkanki mogą nie zostać prawidłowo wypełnione agarozą. W takim przypadku tylko fragmenty tkanki mogą nadawać się do krojenia. W przypadku wycieków podczas procedury wypełniania agarozą, części wypełnionego drzewa oddechowego mogą zostać perforowane, a wypełnienie tkanki płucnej staje się niemal niemożliwe. Jednak możliwym rozwiązaniem jest wypełnienie poprzez bardziej obwodowe oskrzele, głębsze wprowadzenie kaniuli do dystalnych dróg oddechowych (Ryc. 2G) lub potencjalne zaklemowanie miejsca wycieku (Ryc. 2H).

Precyzyjne krojenie płatów płuc
Bloki tkanki o długości i szerokości 1-1,5 cm wycięto z obszarów tkanki, które zostały całkowicie wypełnione zestalonem agarozą (Rycina 3A-3B). Następnie poszczególne bloki tkanki przyklejono do uchwytu na tkankę w wibratomie (Rycina 3C). Przygotowano PCLS o grubości 500 µm, podczas gdy blok tkanki w wibratomie posuwał się do przodu z prędkością od 3-12 µm/s (Rycina 3D-3F). Na koniec PCLS zanurzono w pożywce do hodowli komórkowej zawierającej 0,1% (w/v) płodowej surowicy bydlęcej i inkubowano w standardowych warunkach hodowli komórkowej, zgodnie z opisem w kroku 7.

Wyniki eksperymentalne ludzkich 3D-LTC po 48 h hodowli
Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne, opisane wcześniej przez Alsafadi i wsp.25, przedstawiono na rysunku 4A-4C. Immunoznakowanie fibronektyny (czerwony) oraz jąder komórkowych (DAPI, niebieski) umożliwiło obrazowanie zachowanej struktury pęcherzyków płucnych w ludzkich 3D-LTC ex vivo. Traktowanie wycinków ludzkich PCLS koktajlem cytokin profibrotycznych (zawierającym TGF-β1, PDGF-AB, kwas lipofosfatydowy oraz TNF-α) przez 48 h doprowadziło do zmian o charakterze włóknistym w ludzkich 3D-LTC. Za pomocą qPCR zaobserwowano istotną indukcję genów komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej związanych z włóknieniem – kolagenu typu 1 oraz fibronektyny – w wycinkach 3D-LTC po traktowaniu koktajlem profibrotycznym (rysunek 4D). Dodatkowo, u 3 z 4 pacjentów stwierdzono zwiększenie poziomu białka marker mesenchymalnego – wimentyny – po traktowaniu wycinków 3D-LTC (rysunek 4E).

Procedura przygotowania PCLS z wycinkiem tkanki, wypełnieniem agarozą i schematem harmonogramu hodowli.
Rysunek 1: Schemat generowania PCLS. Obszary resekcji płuc wolne od nowotworu są dokładnie sprawdzane pod kątem integralności tkanki. Jeśli tkanka zostanie oceniona jako odpowiednia do dalszego wykorzystania (ocena jest szczegółowo omówiona w sekcji materiały i metody), zostaje następnie wypełniona płynną agarozą. Bloki tkankowe wypełnione zestaloną agarozą są następnie krojone za pomocą wibratomu. Zanurzone w pożywce hodowlanej, 3D-LTC są hodowane do 120 h po ich wygenerowaniu. Dalsze analizy 3D-LTC obejmują ekspresję białek lub RNA, fluorescencyjne obrazowanie żywej tkanki, a także barwienie immunofluorescencyjne po utrwaleniu tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu sekcji płuc pokazujący wtryskiwanie strzykawką do tętnicy i oskrzela w celu analizy.
Rycina 2: Wypełnianie tkanki płucnej agarozą o niskiej temperaturze topnienia. W tkance płucnej umieszczono kaniulę w postaci obwodowego cewnika żylnego wprowadzonego do oskrzela sąsiadującego z tętnicą płucną (Rycina 2A). Pęsetą unieruchamia się kaniulę w oskrzelu i zaklampowuje tętnicę płucną, aby zapobiec wyciekowi ciekłej agarozy. Ciekłą agarozę w temperaturze 42 °C wlewa się do tkanki płucnej za pomocą strzykawki 30 mL (Rycina 2B). Dystalne umieszczenie kaniuli podczas wypełniania spowoduje wypełnienie niewielkich obszarów tkanki (Rycina 2C), natomiast umieszczenie proksymalne zapewni wypełnienie większej objętości tkanki (Rycina 2D). Wszelkie niedrożności dróg oddechowych zmniejszą objętość tkanki, którą można wypełnić (Rycina 2E). W przypadku wycieku agarozy, dystalne ustawienie kaniuli i/lub zaklampowanie strony wycieku umożliwia prawidłowe wypełnienie tkanki płucnej agarozą (Rycina 2F-2H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krojenie tkanek: A-D przycinanie tkanki; E konfiguracja mikrotomu; F powstały plaster tkanki; przygotowanie histologiczne.
Rysunek 3: Precyzyjne krojenie płuc. Płuca wypełnione agarozą służą do wycięcia skalpelem fragmentu bloku tkankowego (1 cm x 1,5 cm x 1 cm) (Rysunek 3A). Następnie wycięty blok tkanki jest przyklejany do uchwytu na tkankę, pasek skali wskazuje 1 cm (Rysunek 3B). Preferowane jest przyklejenie tkanki powierzchnią opłucnej do powierzchni uchwytu, jak pokazano na Rysunku 3C. Plasterki o grubości 500 µm są wycinane za pomocą wibratomu z nożem szafirowym pod kątem 10°-15° w stosunku do tkanki (Rysunek 3D i 3E). Procedura cięcia pozwala na uzyskanie nienaruszonych plastrów płuc o objętości 2-3 cm3, pasek skali = 5 mm (Rysunek 3F). Dodatkowo, przy użyciu wycinaka do biopsji, można uzyskać powtarzalne wycinki o średnicy 4 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza ekspresji białek, efekt włóknienia, wykres porównawczy, Western blot.
Rysunek 4: Wyniki eksperymentalne ludzkich 3D-LTC po 48 h hodowli.Wycięty fragment ludzkiego 3D-LTC o średnicy 4 mm poddano immunobarwieniu na fibronektynę (na czerwono) i DAPI (na niebiesko) (Rysunek 4A-4C). Paski skali = 1,000 µm. Rysunek 4C przedstawia obraz złożony. Analiza RNA z PCLS metodą ilościowej RT-PCR wykazuje istotne zwiększenie ekspresji genów COL1A1 i FN1 pod wpływem koktajlu profibrotycznego25. Rysunek 4E przedstawia immunoblot lizatów białek całkowitych z PCLS, które były traktowane koktajlem włókniającym25. Detekcja wimentyny i β-aktyny wykazała zwiększoną ekspresję białkową markera mezenchymalnego (wimentyny) po traktowaniu czynnikami profibrotycznymi w próbkach pacjentów 1, 3 i 4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

KryteriumPunkty
Próbka tkanki posiada nienaruszoną powierzchnię opłucnej.20
Próbka tkanki wydaje się makroskopowo nienaruszona, bez nacięć, zgnieceń, pęknięć i zniekształceń.20
Próbka tkanki zawiera co najmniej jeden oskrzele o średnicy >1 mm20
Próbka tkanki nie zawiera krwi lub zawiera jej niewielkie ilości.4
Próbka tkanki była przechowywana całkowicie w medium i nie wykazuje wyraźnych oznak niedodmy.4
Próbka tkanki została wycięta w ciągu ostatnich czterech godzin.4
Próbka tkanki ma średnicę przekraczającą 5 cm w swoim największym wymiarze.4
Suma punktów:

Tabela 1: Wynik wypełnienia agarozą płuc. Wynik wypełnienia agarozą płuc (LAFS) koreluje z efektywnością wypełniania wycinka tkanki agarozą w celu późniejszego przygotowania PCLS za pomocą wibratomu. Wynik stanowi sumę wszystkich punktów za kryteria spełnione przez tkankę. Wartość LAFS równa lub wyższa od 72 zwiastuje dobre właściwości wypełniania agarozą, natomiast wynik poniżej 60 wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia wypełnienia tkanki agarozą.

Dyskusja

Protokół opisany w tym manuskrypcie obejmuje wytwarzanie PCLS z ludzkiej tkanki płucnej poddawanej resekcji poprzez wypełnienie jej płynną agarozą, a następnie krojenie wibratomu. Wytwarzanie wycinków tkanek zostało zademonstrowane już wcześniej dla kilku narządów, takich jak wątroba i mózg, podczas gdy wrodzona sztywność tych narządów pozwalała na bezpośrednie cięcie bez żadnej modyfikacji tkanki. Warto zauważyć, że początkowe prawidłowe przygotowanie tkanki płucnej jest najważniejszym krokiem w wytwarzaniu PCLS. Wypełnienie płuc agarozą jest metodą z wyboru w celu ustabilizowania jego miękkiego i elastycznego charakteru oraz zapewnienia jednorodnego i powtarzalnego wytwarzania PCLS. Duże drogi oddechowe wyciętej tkanki płucnej są kaniulowane, aby zapewnić dostęp do małych dróg oddechowych, a także do nienaruszonego miąższu płuca. Brak nienaruszonej opłucnej, który sprawia, że wypełnienie agarozą jest prawie niemożliwe, jest głównym powodem, dla którego tkanka płucna w większości nie nadaje się do krojenia płuc. Prospektywnie, syntetyczna opłucna pierwotnie zaprojektowana do przeprowadzania eksperymentów funkcjonalnych na rusztowaniach zdecellularnych może być potencjalnie zastosowana w celu uzyskania udanego wypełnienia agarozowego eksplantatów, które nie mają nienaruszonej opłucnej31. Resekcje, w wyniku których powstaje fragment ludzkiej tkanki płucnej z nienaruszoną opłucną, są niezbędne do wytworzenia bloków tkankowych do krojenia. Wycięta tkanka jest bardziej dostępna dzięki tkance wolnej od guza z resekcji raka niż w pełni nienaruszone płaty lub eksplantaty całych płuc pacjentów, którzy przeszli przeszczep płuc.

Powszechnie do produkcji PCLS stosuje się dwa systemy: krajalnicę do tkanek Krumdiecka15 i mikrotomy wibracyjne (wibratomy). Krajalnice do tkanek generują plastry, przepuszczając blok tkanki przez metalowe naczynie, które przecina PCLS pod kątem 90° na końcu tego naczynia. Wibratory wytwarzają PCLS poprzez przesuwanie wibrującego noża poziomo po zakotwiczonym bloku tkanki, który jest zanurzony w schłodzonej kąpieli średniej, która w porównaniu z krajalnicą Krumdieck wywiera mniejszą siłę ścinającą na tkankę. Skutkuje to mniej ostrym traktowaniem tkanki przed uprawą. Z drugiej strony, cięcie wibratomem jest bardziej czasochłonne i pracochłonne. W naszych rękach krojenie wibratomem umożliwiło wyprodukowanie maksymalnie 100 stempli PCLS lub 500 PCLS w ciągu jednego dnia, co jest wystarczające dla większości badań eksperymentalnych. PCLS mogą być hodowane na różne sposoby: (a) przyłączone do Trans-wells, tworząc w ten sposób system interfejsu powietrze-ciecz (ALI), (b) jako dynamiczna hodowla narządów (DOC) lub (c) zanurzone w pożywce do hodowli komórkowej w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Szczegółowa uprawa PCLS została wcześniej opisana 22,23,25; Jednak nadal brakuje wspólnego standardu warunków uprawy między ich stosowaniem w różnych laboratoriach na całym świecie. W szczególności czas hodowli może być krytyczny: podobnie jak w mysim PCLS, utratę komórek pęcherzykowych typu 2 z dodatnim wynikiem SFTPC obserwuje się po 144 godzinach, ale nie po 120 godzinach22. Ponadto aktywność metaboliczna wydaje się pozostawać stabilna u mysich22 i ludzkich PCLS25 przez 120 godzin.

Istnieje kilka ograniczeń technicznych związanych z generowaniem PCLS: liczba i rozmiar resektu zmienia się w czasie; skuteczność wypełnienia agarozowego, która zależy od obecności nienaruszonej opłucnej w pobranej tkance, decyduje o końcowym sukcesie pokolenia PCLS; a zniszczenie tkanek spowodowane zmianami patologicznymi w obrębie uzyskanej (chorej) tkanki płucnej może zakłócać przygotowanie PCLS. Niedrożność dróg oddechowych i tkanka zwłóknieniowa pozbawiona nienaruszonej przestrzeni wyrostka zębodołowego utrudniają wypełnienie agarozą, a tym samym sprawiają, że krojenie tkanki zwłóknieniowej jest wymagającym zadaniem. Tkanki rozedmowe, takie jak choroby takie jak POChP lub niedobór alfa-1-antytrypsyny, mogą nie wytrzymać nacisku wypełnienia agarozowego i spowodować pęknięcie pęcherzyków płucnych i artefaktów architektonicznych. W takich przypadkach zastosowanie niskiego stężenia agarozy, np. 1 % (w/v), może być przydatne w celu zmniejszenia ciśnienia i prędkości podczas napełniania agarozą. Ogólnie rzecz biorąc, stan chorobowy tkanki może drastycznie ograniczyć wykorzystanie tkanki do wytwarzania PCLS. Wszystkie te parametry określają ilość PCLS, która może zostać wygenerowana z tkanki płucnej, a także czas potrzebny do wytworzenia PCLS. Kolejnymi ograniczeniami PCLS są niespójności między różnymi wycinkami płuc pod względem wielkości lub zawartości tkanki, co wymaga dalszych kroków normalizacji eksperymentów. Aby temu zaradzić, można wygenerować stemple biopsyjne podobnych obszarów tego samego wycinka. Procedura ta może zmniejszyć zmienność tkanek i, jako dodatkową korzyść, zwiększyć liczbę próbek PCLS, które można wykorzystać do eksperymentów.

Podsumowując, ludzkie hodowle 3D tkanki płucnej z PCLS wypełnionych agarozą stanowią złożony model ludzki do badania fizjologii i chorób płuc. Protokół zawiera szczegółowy opis przygotowania PCLS z wyciętej tkanki płucnej i ich hodowli, a ponadto odnosi się do wyzwań związanych z wypełnianiem agarozy resekcji płuc u ludzi oraz sposobami ich przezwyciężenia.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Marisie Neumann za fachową pomoc techniczną. Wszystkie tkanki płucne zostały udostępnione dzięki uprzejmości BioArchiwum CPC-M. Prace te były wspierane przez Niemieckie Centrum Badań nad Płucami (DZL), Stowarzyszenie Helmholtza i granty Szkoły Badawczej CPC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vibratome Hyrax V50Zeiss-Hyrax
CU 65Zeiss-Vasofix
Braunü le 18 GB. Braun Melsungen AG4268130B
30 mL NORM-INJECTHenke Sass Wolf4830001000
Strzeżone jednorazowe skalpele, sterylneSwann-Morton
Loctite 406HenkelLOCTITE 406
Syntetyczne monokryształowe szafirowenoże diamentowe Delaware-
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mix (szynka) + L-glutamina + 15mM HEPESGibco31330-038
Penicylina StreptomycynaGibco firmy Life Technologies15070-063
Specjalna procesowa płodowa surowica bydlęca (Sera Plus)Pan BiotechP30-3702
96 Well,/Przezroczysty, Płytka poddana kulturze tkankowej, płaskie dno z pokrywką, sterylnaFalcon / Corning353219
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigmaA9414-100G
Jednorazowy dziurkacz do biopsji pfm medical 48401

Bibliografia

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  2. Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
  3. Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
  4. Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
  5. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
  6. Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
  7. Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
  8. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
  9. Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
  10. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
  11. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  12. Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
  13. Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
  14. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73(2014).
  15. Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
  16. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  17. Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
  18. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
  19. Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  20. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  21. Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
  22. Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
  23. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
  24. Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
  25. Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
  26. Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
  27. Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
  28. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  29. Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
  30. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  31. Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzka tkanka p ucnaprecyzyjnie ci te plastry p uctr jwymiarowe hodowle tkanki p ucnejkrojenie w wibratomiewype nianie agarozwycinanie biopsjianaliza immunofluorescencyjnawestern blottinganaliza qRT PCRmodelowanie w knienia

Powiązane artykuły