Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

DOI:

10.3791/58444

⸱

1 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój terapii opartych na informacyjnym RNA (mRNA) do leczenia różnych chorób staje się coraz ważniejszy ze względu na pozytywne właściwości mRNA transkrybowanego in vitro (IVT). Za pomocą mRNA IVT można indukować syntezę de novo pożądanego białka bez zmiany stanu fizjologicznego komórki docelowej. Co więcej, biosynteza białek może być precyzyjnie kontrolowana dzięki przejściowemu działaniu mRNA IVT.

Dla efektywnej transfekcji komórek, nanoliposomy (NLps) mogą stanowić bezpieczny i skuteczny nośnik terapeutycznego mRNA. W badaniu tym opisano protokół generowania bezpiecznych i wydajnych kationowych NLps składających się z DC-cholesterolu i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (DOPE) jako wektora dostarczania mRNA IVT. NLps o określonej wielkości, jednorodnym rozmieszczeniu i wysokiej zdolności kompleksowania i mogą być wytwarzane metodą suchej folii. Ponadto przedstawiamy różne systemy testowe do analizy ich skuteczności kompleksowania i transfekcji przy użyciu mRNA syntetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), a także ich wpływu na żywotność komórek. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony protokół zapewnia skuteczne i bezpieczne podejście do kompleksowania mRNA, które może przyspieszyć i usprawnić podawanie terapeutycznego mRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zmodyfikowanego mRNA do zastosowań terapeutycznych wykazało ogromny potencjał w ciągu ostatnich kilku lat. W chorobach sercowo-naczyniowych, zapalnych i monogenetycznych, a także w opracowywaniu szczepionek, mRNA jest obiecującym środkiem terapeutycznym1.

Terapia zastępcza białkami z wykorzystaniem mRNA oferuje kilka zalet w porównaniu z klasyczną terapią genową, która opiera się na transfekcji DNA do komórek docelowych2. Funkcja mRNA rozpoczyna się bezpośrednio w cytozolu. Chociaż plazmidowe DNA (pDNA), konstrukt dwuniciowego, kolistego DNA zawierającego region promotorowy i sekwencję genu kodującą białko terapeutyczne3, działa również w cytozolu, może być włączony tylko do komórek, które przechodzą mitozę w momencie transfekcji. Zmniejsza to liczbę transfekowanych komórek w tissue1,4. W szczególności transfekcja tkanek o słabej aktywności mitozy, takich jak komórki serca, jest trudna5. W przeciwieństwie do pDNA, transfekcja i translacja mRNA zachodzą w komórkach mitotycznych i niemitotycznych w klasie tissue1,6. Wirusowa integracja DNA z genomem gospodarza może mieć skutki mutagenne lub reakcje immunologiczne7,8, ale po transfekcji komórek z mRNA kodującym białko, synteza de novo pożądanego białka rozpoczyna się autonomicznie9,10. Co więcej, synteza białek może być precyzyjnie dostosowana do potrzeb pacjenta poprzez indywidualne dawki, bez ingerencji w genom i ryzyka skutków mutagennych11. Potencjał aktywacyjny układu immunologicznego syntetycznie generowanego mRNA można radykalnie obniżyć, stosując pseudo-urydynę i 5'-metylocytydynę zamiast urydyny i cytydyny12. Wykazano również, że mRNA modyfikowane pseudo-urydyną ma zwiększoną stabilność biologiczną i znacznie wyższą zdolność translacyjną13.

Aby móc korzystać z obiecujących właściwości terapii opartej na mRNA w zastosowaniach klinicznych, konieczne jest stworzenie odpowiedniego nośnika do transportu mRNA do komórki. Nośnik ten powinien mieć nietoksyczne właściwości in vitro i in vivo, chronić mRNA przed degradacją nukleazy i zapewniać wystarczający wychwyt komórkowy dla przedłużonej dostępności i translacji mRNA14.

Spośród wszystkich możliwych typów nośników do dostarczania leków in vivo, takich jak nanorurki węglowe, kropki kwantowe i liposomy, te ostatnie były najczęściej badane15,16. Liposomy to pęcherzyki składające się z dwuwarstwy lipidowej10. Są amfifilowe z przekrojem hydrofobowym i hydrofilowym, a poprzez samoułożenie tych cząsteczek powstaje sferyczna podwójna warstwa17. Wewnątrz liposomów środki terapeutyczne lub leki mogą być zamknięte w kapsułkach, a tym samym chronione przed degradacją enzymatyczną18. Liposomy zawierające chlorek N-[1-(2,3-dioleyloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy chlorek (DOTMA)19, [1,2-bis(oleoiloksy)-3-(trimetyloamonio)propanu] (DOTAP)20 i dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS)21, lub DC-cholesterol22, są dobrze scharakteryzowane i często używane do transfekcji komórkowej za pomocą DNA lub RNA.

Liposomy kationowe składają się z dodatnio naładowanego lipidu i nienaładowanego fosfolipidu23. Transfekcja za pomocą liposomów kationowych jest jedną z najczęstszych metod transportu kwasów nukleinowych do komórek24,25. Kationowe cząsteczki lipidów tworzą kompleksy z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi w szkielecie cząsteczek kwasu nukleinowego26. Te tak zwane lipopleksy przyczepiają się do powierzchni błony komórkowej i dostają się do komórki poprzez endocytozę lub mechanizmy podobne do endocytozy27.

W 1989 roku, Malone et al. z powodzeniem opisali kationową transfekcję mRNA za pośrednictwem lipidów28. Jednak przy użyciu mieszaniny DOTMA i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (DOPE), grupa odkryła, że DOTMA wykazywała działanie cytotoksyczne28. Dodatkowo Zohra i wsp. wykazali, że DOTAP (chlorek 1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamoniowo-propanowy) może być stosowany jako odczynnik do transfekcji mRNA29. Jednak w celu efektywnej transfekcji komórek, DOTAP powinien być używany w połączeniu z innymi odczynnikami, takimi jak fibronectin29 lub DOPE30. Do tej pory DOTMA była pierwszym kationowym lipidem na rynku używanym do dostarczania genów31. Inne lipidy są używane jako nośniki terapeutyczne lub są testowane na różnych etapach badań klinicznych (np. EndoTAG-I, zawierający DOTAP jako nośnik lipidów), jest obecnie badany w badaniu klinicznym fazy II32.

Ta praca opisuje protokół generowania NLps zawierających DC-cholesterol i DOPE. Ta metoda jest łatwa do wykonania i pozwala na generowanie NLp o różnych rozmiarach. Ogólnym celem generowania NLp metodą suchego filmu jest stworzenie liposomów do kompleksowania mRNA, umożliwiając w ten sposób wydajną i biokompatybilną transfekcję komórek in vitro14,33.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie kationowych nanoliposomów (Rysunek 1)

  1. Rozpuścić lipidy DC-cholesterolu (chlorowodorek cholesterolu 3β-[N-(N′,N′-dimetyloaminoetanu)-karbamoilo]cholesterolu) i DOPE (dioleoilofosfatydyloetanoloamina), dostarczane w postaci proszku, w chloroformie, aby osiągnąć końcowe stężenie 25 mg/ml.
    Uwaga: Rozpuszczone lipidy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Pracować z roztworem podstawowym obu lipidów o stężeniu 25 mg/ml. Zmieszać 40 μl rozpuszczonego cholesterolu DC i 80 μl rozpuszczonego DOPE w szklanej kolbie.
    Uwaga: Całkowita ilość lipidów wynosi 3 mg. Aby uniknąć szybkiego odparowania chloroformu, podczas pipetowania należy umieścić lipidy na lodzie.
  3. Odparowywać chloroform przez 15 minut pod strumieniem argonu. Następnie napełnij eksykator żelem krzemionkowym, umieść w nim otwartą szklaną kolbę i zastosuj próżnię przez noc, aby upewnić się, że pozostały chloroform odparował, a wewnątrz szklanej kolby utworzy się film lipidowy.
    Uwaga: Pracuj szybko i unikaj niepotrzebnego kontaktu O2
    4. .
  4. Uformowany film lipidowy należy ponownie uwodnić 1 ml wody wolnej od nukleaz i wirować zawiesinę przez 15 minut (Rysunek 2A). Następnie umieść zawiesinę w kąpieli sonizacyjnej na 1 godzinę (Rysunek 2B).
    Uwaga: Zawieszenie będzie lekko mętne.
  5. Zmontuj mini ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij strzykawkę zawiesiną lipidową i umieść napełnioną strzykawkę i pustą strzykawkę po obu stronach ekstrudera. Przeciśnij zawiesinę lipidową przez membranę z jednej strzykawki do drugiej, 20x – 25x, aby wytłoczyć zawiesinę (Rysunek 2C).
    Uwaga: Rozmiar NLps zależy od wielkości porów zastosowanej membrany.
  6. Przechowywać NLps w szklanej kolbie w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
    Uwaga: Po dłuższym czasie przechowywania, NLps należy ponownie umieścić w łaźni sonizacyjnej na 15 minut przy 35 kHz, aby obejść tworzenie się kompleksu.

2. Transkrypcja in vitro syntetycznego mRNA

  1. Przygotuj mRNA kodujące eGFP zgodnie z opublikowanym wcześniej protokołem34.
  2. Amplifikuj sekwencję eGFP z plazmidu za pomocą 0,7 μM starterów do przodu (5'-TTG, GAC, CCT, CGT, ACA, GAA, GCT, AAT, ACG-3') i odwrotnie (5'-T,120 CTT, CTT, ACT, CAG, GCT, TTC, AAA, GAC, CA-3') oraz zestawu polimerazy z PCR.
    1. Wymieszaj 20 μl komercyjnego roztworu buforowego, który zmienia topnienie DNA (tabela materiałów), a także 20 μl 5-krotnej mieszanki z zestawu polimerazy. Dodać 7 μl każdego startera (do przodu i do tyłu).
    2. Dodać 25 ng plazmidu eGFP do mieszaniny i 2 μl polimerazy z zestawu do polimerazy.
      Uwaga: Utrzymuj polimerazę na lodzie przed pipetowaniem jej do roztworu.
    3. Do mieszaniny dodać H2O wolne od nukleaz do objętości 100 μl.
    4. Uruchom cykle PCR w termocyklerze zgodnie z protokołem w Tabeli 1.
  3. Oczyść sekwencję DNA kodującą eGFP za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    1. Dlatego roztwór PCR należy wymieszać z 500 μl buforu wiążącego z zestawu i użyć go do napełnienia kolumn oczyszczających.
    2. Odwirować kolumny z maksymalną prędkością przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.
    3. Dodać 750 μl buforu płuczącego I do kolumny, ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.
    4. Powtórz krok wirówki 1x, aby usunąć bufor z filtra kolumnowego.
    5. Przenieść kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
    6. Dodać 20 μl H2O wolnego od nukleaz do kolumny, inkubować przez 1 minutę i wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Powtórz ten krok.
    7. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą fotometru i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    8. Wykonaj analizy jakości DNA za pomocą elektroforezy żelowej. Dodać 0,5 g agarozy do buforu Tris-Borate-EDTA (TBE) i podgrzać w kuchence mikrofalowej na dużym ogniu, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
    9. Do ciekłej agarozy dodać 5 μl roztworu barwiącego żel, wlać roztwór do komory żelowej i poczekać, aż żel się spolimeryzuje.
    10. Wymieszać 200 ng DNA z 2 μl 6-krotnie obciążającego barwnika i napełnić go do końcowej objętości 12 μl. Odpipetować drabinkę DNA wraz z próbką DNA do studzienek żelowych i uruchomić elektroforezę przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.
    11. Przeanalizuj żel za pomocą stacji do analizy żelu w świetle UV.
  4. Uruchom transkrypcję in vitro, aby wygenerować mRNA z sekwencji DNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zawierającego polimerazę T7 i zastąp zmodyfikowane nukleotydy UTP i CTP Ψ-UTP i metylo-CTP.
    1. W przypadku transkrypcji in vitro należy wymieszać składniki zgodnie z tabelą 2.
      Uwaga: Zastąp 1,5 μl metylo-CTP 1:10 Cy3-CTP rozcieńczonym w wolnym od nukleazH2Opodczas transkrypcji in vitro mRNA eGFP, aby uzyskać znakowanie Cy3 mRNA.
    2. Inkubować mieszaninę reakcyjną IVT przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 1 μl DNazy I z zestawu do polimerazy T7 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu wytrawienia matrycy DNA.
  5. Aby oczyścić mRNA, użyj zestawu do czyszczenia RNA.
    1. Napełnić mieszaninę IVT do objętości 100 μl H2O bez nukleaz.
    2. Dodać 350 μl buforu do lizy i mieszać, pipetując w górę i w dół.
    3. Dodaj 250 μl 100% etanolu i ponownie wymieszaj. Odpipetować mieszaninę do kolumn czyszczących.
    4. Wirować przez 15 s przy 8 000 x g i wyrzucić filtrat.
    5. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny, ponownie odwirować przez 15 s przy 8 000 x g i usunąć filtrat.
    6. Przemyć kolumnę 1x 500 μl buforu płuczącego i odwirować przez 2 minuty przy 8 000 x g.
    7. Przenieść kolumnę do świeżej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Eluować mRNA 2x przez 1-minutową inkubację 20 μl wolnego od nukleazH2Ona membranie kolumny, a następnie 1-minutowe wirowanie z maksymalną prędkością.
  6. Usuń grupy fosforanowe z mRNA za pomocą zestawu do defosforylacji. Dodać 4,5 μl 10x buforu fosfatazy i 1 μl fosfatazy do mRNA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  7. Ponownie oczyść mRNA, wykonując kroki 2.5.1 - 2.5.7.
  8. Zmierz harmonijność mRNA za pomocą fotometru.
  9. Użyj elektroforezy żelowej, aby przeanalizować czystość i wielkość mRNA. Dlatego przygotuj żel agarozowy zgodnie z opisem w krokach 2.3.9 - 2.3.10.
    1. Wymieszaj 3,3 μl formamidu, 1 μl 37% formaldehydu, 1 μL 10x MEN i 1,7 μL 6x barwnika ładującego z 200 ng mRNA i wypełnij do 10 μl wolnym od nukleazH2Odla każdej próbki i markera RNA.
    2. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 65 °C w celu denaturacji mRNA. Załaduj dołki żelu markerem mRNA i RNA i uruchom żel przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.
    3. Przeanalizuj żel za pomocą żelowej stacji doc ze światłem UV.

3. Kompleksowanie syntetycznego mRNA

  1. Rozmrozić syntetyczne mRNA na lodzie, odwirować je i odwirować na krótko przed otwarciem probówki.
  2. Wymieszaj 10 μl syntetycznego mRNA (stężenie mRNA wynosi 100 ng/μL) z 1 μl, 2,5 μL, 5 μL, 10 μL lub 20 μL zawiesiny NLp (stężenie NLp wynosi 3 mg/ml). Krótko odwirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu wytworzenia nanolipoplex.
    Uwaga: Nie mieszać przez pipetowanie. Może to prowadzić do utraty objętości. Krótko zwirować, aby dokładnie wymieszać.
  3. Dodaj 1 ml zwykłej pożywki komórkowej do nanolipopleksów i wymieszaj je, pipetując w górę iw dół.

4. Analiza skuteczności enkapsulacji nanoliposomów

  1. Aby przeprowadzić eksperymenty z enkapsulacją, użyj zestawu do kwantyfikacji RNA.
  2. Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając barwnik fluorescencyjny w stosunku 1:200 dla testu wysokiego zakresu i 1:2 000 dla testu niskiego zakresu.
    Uwaga: Rozmrozić barwnik fluorescencyjny na lodzie. Roztwór roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przygotować krzywe wzorcowe wysokiego i niskiego zakresu, używając 1 ml roztworu podstawowego mRNA eGFP o stężeniu 2 μg/ml w wolnym od nukleazH2O.
    Uwaga: W przypadku krzywych wzorcowych należy użyć mRNA, które zostanie użyte w eksperymentach z enkapsulacją.
  4. Tabela 3 służy do przygotowania wzorca wysokiego zakresu (20 ng/ml - 1 μg/ml).
  5. W przypadku wzorca niskiego zakresu rozcieńczyć roztwór podstawowy mRNA eGFP w proporcji 2 μg/ml w stosunku 1:20, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/ml. Przygotować wzorzec niskiego zakresu (1 ng/ml - 50 ng/ml) zgodnie z opisem w tabeli 4.
  6. Połączyć 1 μg mRNA eGFP (10 μl) i 7,5 μg NLps (2,5 μl) i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT.
    Uwaga: Utrzymuj mRNA na lodzie, aby uniknąć degradacji.
  7. Dodać 1 ml H2Owolnego od nukleaz, aby utworzyć nanolipopleksy i mieszać, pipetując w górę iw dół.
  8. Dodać 1 ml roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego 1:200 lub 1:2,000 RNA do kapsułkowanych próbek i wzorców i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT w ciemności.
  9. Odpipetować wzorce i próbki w dwóch egzemplarzach do czarnej 96-dołkowej płytki i zmierzyć fluorescencję przy 530 nm na czytniku mikropłytek (Rysunek 3).

5. Przygotowanie komórek do transfekcji

  1. Płytka 1,5 x 105 komórek/basenik A549 na płytce 12-dołkowej 1 d przed transfekcją.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zwykłej pożywce komórkowej (DMEM/wysoka glukoza z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicylina/streptomycyna) przez 24 godziny przed transfekcją.

6. Transfekcja komórek

  1. Przygotowane komórki przemyć 1x 1 ml/studzienkę PBS (bez Ca2+/Mg2+).
  2. Dodać 1 ml przygotowanej mieszaniny nanolipoplex, zawierającej 1 μg mRNA eGFP zamkniętego w 1 μl, 2,5 μl, 5 μl, 10 μl lub 20 μl NLps, do jednego dołka przygotowanej płytki z komórkami A549.
  3. Dodaj zawiesinę nanolipoplex do komórek i inkubuj w regularnych warunkach przez 24 godziny w celu analizy skuteczności transfekcji lub przez 24 godziny i 72 godziny w celu analizy żywotności komórek po transfekcji.
    Uwaga: Transfekcja z NLps nie wymaga zmiany podłoża.

7. Analiza skuteczności transfekcji komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Usunąć supernatant i przemyć komórki 1 ml/basenik PBS (bez Ca2+/Mg2+) w celu usunięcia pozostałych NLps.
  2. Przygotuj komórki do cytometrii przepływowej.
    1. Trypsynizować komórki za pomocą 500 μl/studzienka trypsyna/EDTA (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zatrzymaj proces i dezaktywuj trypsynę, dodając taką samą ilość (500 μl / dołek) zwykłej pożywki zawierającej FBS.
    2. Odwirować komórki przez 5 minut przy 400 x g i ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania osadu komórkowego.
    3. Umyj komórki 1 ml PBS (bez Ca2+ / Mg2 +).
    4. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl 1x roztworu utrwalającego i przenieść komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
    5. Przeanalizuj komórki przy długości fali 488 nm w cytometrze przepływowym (Rysunek 4A).
      Uwaga: Wiruj komórki 1x bezpośrednio przed pomiarem.
  3. Przygotuj komórki do mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Utrwalić komórki 1 ml/studzienkę 100% metanolu, który był wcześniej przechowywany w temperaturze -20 °C.
    2. Dodać 500 μl/basenik 300 nM DAPI (4′,6-diamidyno-2-fenyloindol) rozpuszczony w PBS (bez Ca2+/Mg2+) i inkubować przez 5 minut w ciemności.
    3. Usunąć roztwór DAPI i ponownie umyć komórki 100% metanolem przechowywanym w temperaturze -20 °C.
    4. Przeanalizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 4B).
      Uwaga: Należy stosować następujące długości fal wzbudzenia/emisji: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm i Cy3 550/570 nm.

8. Test żywotności komórek

  1. Rozpuścić 5 mg MTT (bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu) w 1 ml RPMI (bez czerwieni fenolowej).
    Uwaga: Przed użyciem rozpuszczony MTT należy dodatkowo rozcieńczyć w stosunku 1:10 (końcowe stężenie: 0,5 mg/ml) w RPMI.
  2. Przemyć transfekowane komórki 3x 1 ml/studzienkę PBS (bez Ca2 + / Mg2).
    Uwaga: Resztki zwykłej pożywki komórkowej należy całkowicie usunąć.
  3. Dodać 500 μl/basenik rozcieńczonego roztworu MTT w stosunku 1:10 do komórek i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć roztwór MTT z komórek po inkubacji i dodać 500 μl/dołek DMSO (dimetylosulfotlenek). Inkubować ponownie przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Odpipetować roztwór DMSO w trójkach do 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem i zmierzyć adsorpcję przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  6. Ustaw żywotność nieleczonej komórki na 100% i oblicz żywotność komórek innych grup w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego protokołu, NLps składające się z lipidów DC-cholesterolu i DOPE zostały przygotowane przy użyciu metody suchej warstwy (Rysunek 1). Podczas przygotowania roztwór nanoliposomu wykazuje różne etapy zmętnienia (Rysunek 2).

Skuteczność enkapsulacji NLps może być następnie analizowana po enkapsulacji 1 μg mRNA kodującego eGFP, analizując wolną ilość mRN...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje wytwarzanie NLps o wysokiej skuteczności enkapsulacji dla syntetycznie modyfikowanego mRNA, a także niezawodną transfekcję komórek in vitro. Co więcej, NLps gwarantują uwalnianie mRNA, które z kolei jest tłumaczone na funkcjonalne białko wewnątrz komórek. Dodatkowo, transfekcje za pomocą NLps mogą być wykonywane w zwykłej pożywce komórkowej, co skutkuje wysoką żywotnością komórek podczas transfekcji i trwa do trzech dni po transfekcji.

Aby używać mRNA jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(bromek (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT)AppliChem, Darmstadt, NiemcyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]chlorowodorek cholesterolu (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4  ′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, NiemcySystem D1306
BD FACScan BDBiosciences, Heidelberg, Niemcy
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Niemcy102445
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Niemcy20385.02
Dioleoilophosphatidyloetanoloamina (DOPE)Avanti, Alabama, Stany Zjednoczone850725
Mikroskop fluorescencyjnyZeiss Axio, Oberkochen, Niemcy
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy11668019
Mini ekstruderAvanti, Alabama, USA
Woda wolna od nukleazQiagen, Hilden, Niemcy129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy11058021
bufor PBS (bez Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy70011044
zestaw odczynników Quant-iT Ribo Green RNAThermo Fisher Scientific, Darmstadt, NiemcyQ33140
RPMI (bez czerwieni fenolowej)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy11835030
Żel krzemionkowyCarl Roth, Karlsruhe, NiemcyP077
Trypsyna/EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Niemcy202602
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen, Hilden, Niemcy28104

Pseudourydyno-5'-trifosforan (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-metylocytydyno-5'-trifosforan (metylo-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
3-ctp cyjaninyPerkinElmer, Baesweiler, Niemcy
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Niemcy74104
Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, NiemcyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Fosfataza antarktycznaNowość Anglia Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pensylwania, USA25-2040
Invitrogen 0,5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Gö teborg,
Szwecja		11528766
NEL580001EA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cationic NanoliposomesmRNA DeliveryDry Film MethodExtrusion TechniqueFlow CytometryFluorescence MicroscopyDC CholesterolDOPEeGFP mRNACell Viability

Powiązane artykuły