Artykuł metodologiczny

Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58453

⸱

30 października 2018

 ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2MedEngine Oy, 3Department of Pediatrics, Tampere University Hospital, 4Department of Children and Adolescents, Oulu University Hospital, 5PEDEGO Research Unit, Medical Research Center, University of Oulu

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół immunizacji dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) szczepionką opartą na DNA i pokazujemy walidację udanego szczepienia. Metoda ta jest odpowiednia do przedklinicznych badań przesiewowych kandydatów na szczepionki w różnych modelach infekcji.

Streszczenie

Zainteresowanie szczepieniami opartymi na DNA wzrosło w ciągu ostatnich dwóch dekad. Szczepienie DNA opiera się na klonowaniu sekwencji wybranego antygenu lub kombinacji antygenów w plazmid, co umożliwia wykonanie dostosowanego do potrzeb i bezpiecznego projektu. Podawanie szczepionek DNA do komórek gospodarza prowadzi do ekspresji antygenów, które stymulują zarówno humoralną, jak i komórkową odpowiedź immunologiczną. W niniejszym raporcie opisano protokół klonowania sekwencji antygenowych do plazmidu pCMV-EGFP, immunizacji dorosłych danio pręgowanego kandydatami na szczepionki za pomocą mikroiniekcji domięśniowej, a następnie elektroporacji w celu poprawy spożycia. Antygeny szczepionkowe są wyrażane jako białka fuzyjne zielonej fluorescencji (GFP), co pozwala na potwierdzenie ekspresji antygenu w świetle UV od żywych ryb oraz ilościowe określenie poziomów ekspresji białka fuzyjnego za pomocą testu ELISA, a także ich wykrycie za pomocą analizy western blot. Działanie ochronne potencjalnych szczepionek bada się poprzez zakażenie ryb Mycobacterium marinum pięć tygodni po szczepieniu, a następnie oznaczanie ilościowe bakterii za pomocą qPCR cztery tygodnie później. W porównaniu z przedklinicznymi modelami przesiewowymi ssaków, metoda ta stanowi opłacalną metodę wstępnych badań przesiewowych nowych kandydatów na szczepionki oparte na DNA przeciwko zakażeniu prątkami. Metoda ta może być dalej stosowana do badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA przeciwko różnym chorobom bakteryjnym i wirusowym.

Wprowadzenie

Pierwsze badania nad szczepionką DNA przeprowadzono w latach 90. 1, a od tego czasu szczepionki DNA były testowane przeciwko różnym chorobom zakaźnym, nowotworom, autoimmunizacji i alergiom2. U ssaków szczepionka DNA przeciwko wirusowi Zachodniego Nilu u koni oraz terapeutyczna szczepionka przeciwnowotworowa przeciwko czerniakowi jamy ustnej u psów zostały zarejestrowane, ale nie są one obecnie w użyciu klinicznym2. Oprócz zainteresowania, jakie wzbudziły badania na ssakach, szczepienie DNA okazało się wygodnym sposobem uodparniania ryb hodowlanych na choroby wirusowe. Szczepionka przeciwko zakaźnemu wirusowi martwicy układu krwiotwórczego ryb (IHNV) jest w użyciu komercyjnym od 2005 roku, a szczepionka przeciwko zakaźnemu wirusowi martwicy trzustki (IPNV) została niedawno licencjonowana3. Ponadto opracowywanych jest kilka szczepionek DNA przeciwko patogenom ryb.

Ponieważ tradycyjne szczepionki często zawierają inaktywowane lub żywe atenuowane patogeny, stwarzają one potencjalne ryzyko przeniesienia choroby2. Szczepionki DNA z kolei zapobiegają temu ryzyku, ponieważ opierają się na podawaniu plazmidu kodującego antygeny bakteryjne lub wirusowe, a nie na samym patogenie2,4. Szczepionki DNA są produkowane przy użyciu technik rekombinacji DNA, co pozwala na precyzyjne projektowanie antygenów szczepionkowych i elastyczne formułowanie kombinacji antygenów i adiuwantów w jednym konstrukcie szczepionki5. Co więcej, produkcja szczepionek DNA jest szybsza, łatwiejsza i bardziej opłacalna niż w przypadku szczepionek rekombinowanych na bazie białek, co jest główną zaletą dla celów badań przesiewowych kandydatów na szczepionki, ale także, na przykład, w przypadku wybuchów pandemii2.

U ryb najczęstszymi drogami podawania szczepionek DNA są dootrzewnowe, domięśniowe i doustne3,6,7, podczas gdy u ssaków dodatkowe opcje to drogi podskórne i śródskórne2. Po wstrzyknięciu domięśniowym podane plazmidy DNA dostają się do komórek w miejscu podania (np. głównie miocytów, ale także rezydentnych komórek prezentujących antygen [APC]). Proporcja transfekowanych komórek może być znacznie zwiększona przez elektroporację2,8. Po wejściu do komórki część plazmidowego DNA dostaje się do jądra, gdzie geny kodowane przez plazmid są transkrybowane2. W tym protokole wykorzystujemy plazmid pCMV-EGFP, który ma silny wszechobecny promotor zoptymalizowany pod kątem ekspresji eukariotycznej9. W tym konstrukcie antygeny są tłumaczone jako białko fuzyjne z GFP. Dobra praktyka rolna umożliwia potwierdzenie udanego szczepienia i prawidłowego produktu antygenowego poprzez prostą wizualizację ekspresji antygenu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego u żywych ryb.

U ssaków wykazano, że szczepionki DNA stymulują różne typy odpowiedzi immunologicznej w zależności od typów transfekowanych komórek2,5. Transfekowane miocyty wydzielają antygeny do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub uwalniają je po śmierci komórki, a antygeny pochłonięte przez APC są następnie prezentowane na głównych cząsteczkach kompleksu zgodności tkankowej II2. To wyzwala odpowiedzi limfocytów T CD4 i CD8, zwłaszcza oprócz odpowiedzi limfocytów B2,5,10. U ryb zidentyfikowano limfocyty T i B, a także komórki dendrytyczne (DC), jednak ich podział pracy w prezentacji antygenu jest mniej zrozumiały11. Wykazano jednak, że dane dane użytkowe drobnej mają zachowane cechy fenotypowe i funkcjonalne ze swoimi ssaczymi odpowiednikami12. Ponadto wykazano, że szczepienie DNA wywołuje podobne odpowiedzi immunologiczne u ryb i ssaków, w tym odpowiedzi komórek T i B6,13,14,15,16.

Zarówno larwy, jak i dorosłe rybki danio pręgowane są powszechnie używane do modelowania różnych chorób zakaźnych, takich jak model infekcji gruźlicy M. marinum używany w tym protokole17,18,19,20,21,22. W porównaniu z modelowymi organizmami ssaków, zaletami danio pręgowanego są ich niewielkie rozmiary, szybka odtwarzalność i niskie koszty utrzymania23. Te aspekty sprawiają, że danio pręgowany jest idealnym modelem zwierzęcym do przedklinicznych badań przesiewowych na dużą skalę dla nowych szczepionek i związków farmaceutycznych23,24,25.

W tym protokole opisujemy, jak nowe kandydatki na antygen szczepionkowy przeciwko mykobakteriozie mogą być oceniane przez szczepienie oparte na DNA dorosłego danio pręgowanego. Najpierw opisujemy, w jaki sposób antygeny są klonowane do plazmidu ekspresyjnego pCMV-EGFP, a następnie szczegółowy protokół domięśniowego wstrzykiwania plazmidów szczepionkowych i późniejszej elektroporacji do mięśni. Ekspresję każdego antygenu potwierdza się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej tydzień po szczepieniu. Skuteczność kandydatów na antygen jest następnie testowana poprzez eksperymentalne zakażenie zaszczepionych ryb M. marinum.

Protokół

Eksperymenty z udziałem dorosłych ryb pręgowanych wymagają pozwolenia na eksperymenty na zwierzętach, zarówno dla szczepienia, jak i późniejszych badań z modelem infekcji. Wszystkie opisane tutaj metody i eksperymenty są zatwierdzone przez Fińską Radę ds. Doświadczeń na Zwierzętach (ESAVI), a badania są przeprowadzane zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE.

1. Klonowanie antygenów szczepionki DNA

  1. Wybierz plazmid ekspresyjny zoptymalizowany pod kątem eukariotycznej ekspresji antygenu (antygenów) będącego przedmiotem zainteresowania pod silnym, konstytutywnym promotorem, takim jak wirus cytomegalii (CMV) bezpośrednio wczesnym promotorem. Aby umożliwić weryfikację in vivo ekspresji antygenu, należy wybrać plazmid szczepionkowy, który koduje znacznik fluorescencyjny, taki jak plazmid pCMV-EGFP 9 używany w tym protokole.
  2. Użyj odpowiednich narzędzi internetowych i bioinformatycznych, aby wybrać potencjalnie immunologiczną sekwencję antygenu (lub kilka sekwencji) o długości około 90–600 NT (30–200 aa)26 z genów będących przedmiotem zainteresowania patogenu, który zostanie wykorzystany w kolejnym modelu infekcji.
  3. Użyj dostępnego oprogramowania lub ręcznie zaprojektuj startery do amplifikacji genów antygenu z genomu patogenu i sklonowania sekwencji antygenu do miejsca wielokrotnego klonowania plazmidu ekspresyjnego. Upewnij się, że zachowałeś prawidłową ramkę odczytu podczas wybierania antygenu.
  4. Dołącz zarówno sekwencję Kozaka (CCACC)27, jak i kodon start (ATG) w starterze 5'. Aby zachować C-końcowy znacznik EGFP, należy unikać interweniujących kodonów stop (TAG, TAA, TGA) w sekwencji antygenu i starterze 3'. Upewnij się również, że znacznik GFP pozostaje w tej samej ramce odczytu co antygen będący przedmiotem zainteresowania.
  5. Użyj RNA lub DNA wyekstrahowanego z patogenu jako matrycy, aby wygenerować odpowiednią ilość produktu PCR ze starterami klonującymi. Najlepiej użyć korekty polimerazy DNA, aby zachować prawidłową sekwencję antygenu.
  6. Oczyść produkt PCR i sprawdź prawidłowy rozmiar produktu za pomocą elektroforezy żelowej. Trawić i podwiązywać produkt PCR z strawionym plazmidem szczepionkowym.
  7. Przekształć mieszaninę ligacyjną w kompetentne komórki bakteryjne zgodnie z odpowiednim protokołem. Stosować odpowiedni dobór antybiotyków w celu uzyskania dodatnich kolonii i produkcji plazmidu u E. coli; Na przykład plazmid pCMV-EGFP zawiera gen oporności na ampicylinę.
  8. Użyj sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić wstawienie prawidłowej sekwencji antygenu. Do sekwencjonowania antygenów w plazmidzie pCMV-EGFP można użyć następujących starterów: CMV forward 5'- CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' i EGFP-N reverse 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
  9. Wyprodukować i oczyścić wystarczającą ilość konstruktu szczepionki. Rozpuść lub wylucuj plazmid w sterylnej wodzie. Upewnij się, że wytworzone plazmidowe DNA jest wysokiej jakości, a jego stężenie wynosi co najmniej 0,72 μM lub 2 000 ng/μL.

2. Wyciąganie igieł do mikroiniekcji

  1. Przygotuj wcześniej igły do mikroiniekcji. Użyj 10-centymetrowych kapilar ze szkła glinokrzemianowego. Należy pamiętać, że naczynia włosowate ze szkła borokrzemianowego są zbyt kruche do wstrzykiwania dorosłych ryb.
  2. Pociągnij igły za pomocą urządzenia do produkcji igieł do mikropipet.
    UWAGA: Igły powinny wyglądać podobnie do tej przedstawionej na Rysunek 1. W przypadku urządzenia używanego w tym protokole (Tabela materiałów) następujące ustawienia dają pożądany rodzaj igieł:
    1. Umieść szklaną kapilarnę w rowku V w drążku ściągacza i lekko dokręć clamppokrętło.
    2. Przesuń uchwyt obok filamentu i delikatnie wepchnij kapilę przez filament do ściągacza po drugiej stronie filamentu. Unikaj dotykania filamentu kapilarą.
    3. Dokręcić clamppokrętła, odłożyć bezpieczną szybę i nacisnąć przycisk pociągania.
      UWAGA: Żarnik jest gorący.
  3. Umieść igły na kawałku kleju wielokrotnego użytku wewnątrz 15-centymetrowej płytki Petriego, aby chronić końcówki igieł. Trzymaj naczynie pod przykryciem, aby igły były czyste.

3. Napełnianie igieł do mikropipet

  1. Przygotuj mieszankę szczepionek. Stosować 0,5–12 μg plazmidu na dawkę. W przypadku łączenia kilku różnych plazmidów w jednej mieszance szczepionkowej należy użyć maksymalnego całkowitego stężenia DNA wynoszącego 12 μg na rybę.
  2. Obliczyć objętość szczepionki "głównej mieszanki" w zależności od liczby ryb w każdej grupie (patrz poniżej). Do każdej dawki wstrzyknięcia należy dodać 1 μl sterylnie przefiltrowanej czerwieni fenolowej, aby ułatwić zarówno napełnianie igieł kapilarnych, jak i obserwację wstrzyknięcia. Dodać sterylny 1x PBS do maksymalnej całkowitej objętości 5–7 μl w jednej dawce iniekcyjnej8.
    UWAGA: Objętości iniekcji większe niż 7 μl mogą powodować sporadyczne wycieki roztworu do wstrzykiwań i dlatego należy tego unikać.
  3. Umieść kawałek taśmy, klejoną stroną do góry, na odpowiednim uchwycie, na przykład z boku pustego pudełka na końcówki. Delikatnie przymocuj igły kapilarne do taśmy.
  4. Odpipetować maksymalnie 7 μl mieszanki szczepionek na kawałek folii laboratoryjnej. Za pomocą końcówki ładującej przenieść szczepionkę z folii do igły. Pipetować powoli i ostrożnie, unikając wtłaczania pęcherzyków powietrza do igły.
  5. Pozostaw igły na 15–30 minut, aby usunąć ewentualne pozostałe małe pęcherzyki powietrza.

4. Ustawianie mikrowtryskiwacza i elektroporatora do immunizacji

  1. Ustaw mikromanipulator i źródło światła we właściwej pozycji. Ustawić kurek ciśnienia powietrza w pozycji otwartej.
  2. Dostosuj parametry pompy pneumatycznej (patrz również Rysunek 2) w następujący sposób.
    1. Ustawić pokrętło odpowietrzające na porcie wysuwania w taki sposób, aby się przytrzymało, aby zapobiec zapełnieniu pipety przez działanie kapilarne. Ustawić rurkę z portu wysuwania na mikropipetę. Nie używaj portu Vacuum w tym protokole.
    2. Dostosuj długość impulsu: użyj trybu czasowego, w którym elektroniczny zegar kontroluje czas, przez jaki elektrozawór ciśnienia pozostaje otwarty. Sprawdź, czy zielona lampka obok manometru wyrzutu świeci się, gdy elektrozawór ciśnienia jest otwarty (pod napięciem).
    3. Ustaw zakres impulsów na 10 s; przy tym ustawieniu impulsy można dalej ustawiać od 100 ms do 10,1 s. Użyj 10-obrotowego pokrętła okresu, aby precyzyjnie dostroić długość impulsu - każdy obrót tarczy to 1,0 s. W razie potrzeby można to również dostosować podczas wstrzyknięcia.
    4. Użyj inicjatora impulsów ("przycisk start") na przednim panelu pompy pneumatycznej lub zdalnego przełącznika nożnego (zalecane). Jest on połączony z przednim panelem pompy pneumatycznej.
  3. Umieścić igłę na uchwycie mikropipety mikromanipulatora. Odetnij końcówkę igły pęsetą, aby płyn mógł zostać wypchnięty, i użyj mikroskopu, aby view prawidłowa pozycja. Naciśnij raz przełącznik nożny, aby zobaczyć, że impuls 1-s wypycha małą kropelkę z igły.
  4. Użyj następujących ustawień dla elektroporatora: napięcie = 40 V; długość impulsu = 50 ms, liczba impulsów = 6. Podłącz pęsetę do elektroporatora. Sprawdź, czy rzeczywista objętośćtage i długość impulsu pokazane na monitorze nie różnią się znacząco od ustawień.

5. Wstrzyknięcie szczepionki DNA i elektroporacja

  1. Do szczepień zgodnie z tym protokołem należy używać zdrowych, 6 do 12 miesięcznych dorosłych danio pręgowanego. Rybę należy przechowywać w systemie przepływowym z cyklem 14/10 godzin światła/ciemności, przy czym na 1 l wody przypada maksymalnie siedem ryb.
  2. Przygotuj 0,02% roztwór estru etylowego (trikainy) kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7) w wodzie w zbiorniku do znieczulenia ryb28. Użyj 10-centymetrowej szalki Petriego lub czegoś podobnego.
  3. Przygotować zbiornik odzysku, napełniając zlewkę o pojemności 5 l 3 litrami czystej wody z systemu.
  4. Przygotuj wyściółkę do szczepienia, aby utrzymać rybę w ustalonej pozycji podczas szczepienia. Weź 5 x 7 cm2 kawałki gąbki o grubości od 2 do 3 cm. Wytnij rowek w gąbce ostrzem skalpela lub ostrymi nożyczkami.
    UWAGA: Ta sama wyściółka do szczepienia może być używana w wielu eksperymentach. Zdezynfekuj gąbkę między eksperymentami, mocząc ją w 70% alkoholu etylowym i pozostaw do wyschnięcia.
  5. Dokładnie namocz gąbkę w wodzie systemowej i umieść gąbkę na szalce Petriego.
  6. Pościć rybę 24 godziny przed szczepieniami.
  7. Znieczul jednego danio pręgowanego, umieszczając go na szalce Petriego zawierającej 0,02% trikainy. Poczekaj, aż ryba nie zareaguje na stymulację dotykową i nie będzie ruchu skrzeli. Znieczulaj pojedynczą rybę na raz.
  8. Za pomocą plastikowej łyżki przenieś znieczulonego danio pręgowanego na mokrą gąbkę i umieść brzuszną stronę ryby w dół w rowku. W prawidłowej pozycji upewnij się, że głowa i większość ciała ryby znajdują się wewnątrz rowka, a płetwa grzbietowa i ogon wystają z rowka.
  9. Pod mikroskopem ostrożnie umieść igłę pod kątem około 45° w pobliżu mięśnia grzbietowego danio pręgowanego, używając pokręteł dostrajających osi x i y na mikromanipulatorze.
  10. Znajdź małe miejsce bez łusek przed płetwą grzbietową, w którym popychanie igły nie wymaga siły. Jeśli wyczuwalny jest opór, wypróbuj sąsiednie miejsce. Unikaj zranienia kręgosłupa, płetwy grzbietowej lub łusek.
    UWAGA: Jeśli igła wygina się podczas pchania, skróć igłę nieznacznie, przecinając ją.
  11. Za pomocą przełącznika nożnego należy stopniowo wstrzykiwać roztwór szczepionki do mięśnia. Obserwuj wstrzyknięcie przez mikroskop: czerwień fenolowa jest widoczna, gdy dostaje się do tkanki mięśniowej. W razie potrzeby dostosuj czas trwania impulsu.
    UWAGA: Alternatywnie do wtrysku należy użyć przycisku inicjatora impulsów na przednim panelu pompy pneumatycznej. Jednak zastosowanie zdalnego przełącznika nożnego pozwala na użycie drugiej ręki do regulacji długości impulsu za pomocą 10-obrotowego pokrętła. Należy unikać zbyt szybkiego wstrzykiwania roztworu, ponieważ może to spowodować nadmierne uszkodzenie tkanek. Należy pamiętać, aby nie wstrzykiwać powietrza.
  12. Rybę należy naelektryzować elektrycznie, natychmiast po wstrzyknięciu. Upewnij się, że ryba jest nadal pod narkozą. Trzymaj rybę na gąbce i umieść rybę między elektrodami typu pęseta, tak aby elektrody znajdowały się po obu stronach miejsca wstrzyknięcia. Nie dociskaj pęsety elektrod zbyt mocno, ale utrzymuj obie elektrody w kontakcie z rybą.
    1. Naciśnij przycisk start na elektroporatorze, aby wysłać sześć impulsów 40 V, 50 ms.
    2. Delikatnie przenieś rybę do zbiornika rekonwalescencyjnego.
    3. Wyczyść elektrody po każdej elektroporacji, przecierając je 70% etanolem.
      UWAGA: Uważnie monitoruj dobrostan ryb po szczepieniu. Poddaj eutanazji każdą rybę wykazującą oznaki dyskomfortu (powolny powrót do zdrowia po znieczuleniu, nieprawidłowe pływanie, sapanie) w 0,04% tricaine. Po wyzdrowieniu przenieś rybę do jednostki przepływowej i nakarm ją normalnie.

6. Wizualizacja i obrazowanie ekspresji antygenu

  1. Znieczulić rybę 0,02% tricainą 2–7 dni po immunizacji i użyć światła UV, aby zobaczyć ekspresję EGFP w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.
    UWAGA: Oględziny w świetle UV to łatwa i nieinwazyjna operacja, która nadaje się do rutynowej weryfikacji udanych szczepień, również w eksperymentach na dużą skalę. Jeśli nie są wymagane żadne obrazy ryb, ten krok można również wykonać w zwykłych akwariach bez konieczności znieczulania lub przenoszenia ryb.
  2. Aby uchwycić obrazy, użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobrazować ekspresję EGFP w miejscu wstrzyknięcia8. Użyj soczewki obiektywowej 2X i wybierz odpowiedni filtr, aby wyświetlić widoki fluorescencji lub światła widzialnego.
  3. Utrzymuj znieczuloną rybę nieruchomo, delikatnie naciskając płetwę brzuszną w kierunku dna szalki Petriego. Wykonaj zarówno zdjęcia tego samego obszaru za pomocą mikroskopu świetlnego, jak i fluorescencji.
  4. Połącz obrazy z mikroskopu świetlnego i fluorescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania29. Dodaj podziałkę liniową.

7. Kwantyfikacja poziomu ekspresji i wielkości antygenów

  1. Poddaj rybę eutanazji w 0,04% trikainie. Wypreparuj fluorescencyjną część mięśnia grzbietowego za pomocą skalpela i pęsety w świetle UV. Wyodrębnij białka z próbek8.
  2. Sprawdź poprawną wielkość białek wytworzonych in vivo za pomocą analizy western blot, używając przeciwciała GFP sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) (lub podobnego)8. Włączyć kontrolę ujemną (ryby nieuodpornione) w celu wykluczenia wszelkich sygnałów tła i niespecyficznego wiązania, wraz z kontrolą wyrażającą EGFP bez skondensowanego antygenu.
    UWAGA: W przypadku analizy western blot oczekiwaną wielkość (w kDa) białek fuzji antygenu można obliczyć, na przykład, za pomocą równania:
    Masa cząsteczkowa (MW) dsDNA = (liczba nukleotydów x 607.4) + 157.9; lub za pomocą narzędzi internetowych.
  3. Określ ilościowo ekspresję każdego antygenu za pomocą GFP-ELISA8 (opcjonalnie).

8. Połączenie protokołu szczepień z modelem zakażenia M. marinum

  1. Określ wielkość grupy wymaganą do wiarygodnego określenia skuteczności nowego kandydata na szczepionkę w modelu zakażenia i zastosowanym teście (zob. na przykład Myllymaki et al.24 oraz Charan i Kantharia30). Przeprowadź odpowiednie obliczenia mocy podczas planowania eksperymentów.
  2. Aby ocenić skuteczność kandydatów na szczepionki, należy zainfekować ryby 5 tygodni po szczepieniu. Użyj infekcji wewnątrzotrzewnowej z około 30 jednostkami tworzącymi kolonie (jtk) M. marinum, co prowadzi do utajonej infekcji u większości ryb8,20,31.
    UWAGA: Podczas korzystania z M. marinum należy postępować zgodnie z protokołem bezpieczeństwa BSL2. Przygotowanie bakterii lub wirusa zależy od patogenu.
  3. Określ ilościowo liczbę patogenów w każdej rybie. Poddaj rybę eutanazji 4 tygodnie po zakażeniu i określ obciążenie bakteryjne każdej ryby z wyekstrahowanego DNA za pomocą qPCR przy użyciu starterów specyficznych dla M. marinum20,24.
    UWAGA: Należy pamiętać o uwzględnieniu odpowiedniej grupy kontrolnej i zastosowaniu właściwych metod statystycznych do analizy wyników. Ogólnie rzecz biorąc, grupa ryb uodporniona pustym plazmidem pCMV-EGFP jest odpowiednią kontrolą negatywną.
  4. Potwierdź pozytywne wyniki za pomocą antygenów bez znacznika GFP. Sklonuj antygeny zgodnie z opisem w kroku 1 i powtórz eksperyment ze szczepieniem.

Wyniki

Kroki zawarte w protokole szczepienia DNA dorosłych rybek danio są przedstawione w Rycina 3W pierwszej kolejności wybrane sekwencje antygenów klonuje się do plazmidu pCMV-EGFP, a następnie przeprowadza produkcję i oczyszczanie plazmidowego DNA.24 (Rycina 3Następnie kandydaty na szczepionki wstrzykuje się domięśniowo za pomocą mikroinjektora, a miejsce wstrzyknięcia poddaje się elektroporacji, aby zwiększyć pobranie plazmidu przez komórki (Rycina 3). Zastosowaną dawkę szczepionki zoptymalizowano poprzez wstrzykiwanie różnych ilości plazmidu pCMV-EGFP i pomiar ekspresji GFP metodą ELISA (Uzupełniające Rycina 1). Od dwóch do siedmiu dni po szczepieniu ekspresję białka fuzyjnego wykrywa się w świetle UV i wizualizuje za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3 i Rysunek 4). Poziomy ekspresji różnych antygenów mogą się różnić – od bardzo intensywnej (antygen 1) do słabej ekspresji (Rysunek 4). Ponadto ekspresję GFP można zaobserwować w obrębie mięśnia grzbietowego (antygen 1) lub w obszarze bardziej ograniczonym (antygen 2) (Rysunek 4). Jeśli jednak w ciągu 10 dni nie zostanie wykryta fluorescencja, zaleca się upewnienie, że nie popełniono błędów podczas klonowania antygenu lub projektowania starterów. Aby potwierdzić, że ekspresowane białko fuzyjne ma odpowiednią wielkość, można wyekstrahować białka z tkanki mięśniowej wokół miejsca wstrzyknięcia i wykorzystać je do analizy western blot.

Skuteczność kandydackich szczepionek ocenia się poprzez poddanie ryb ekspozycji na niską dawkę M. marinum poprzez wstrzyknięcie doszpikowe (Rycina 5). Od czterech do pięciu tygodni po zakażeniu oznaczono liczbę bakterii za pomocą qPCR i porównano ją z ładunkiem bakteryjnym w grupie kontrolnej (Rysunek 5). Ponadto skuteczność najbardziej obiecujących kandydatów na szczepionkę można przetestować poprzez monitorowanie przeżywalności po podaniu wysokiej dawki *M. marinum* infekcja(Rycina 5). Jednakże, poza dostarczeniem ilościowego wyniku dotyczącego postępu infekcji, a nie jedynie określeniem statusu przeżycia lub śmierci, kwantyfikacja jtk oparta na qPCR wymaga mniej czasu i mniejszych grup badawczych, co czyni tę metodę bardziej etycznym podejściem w ramach przesiewu pierwotnego. W ogólnym ujęciu protokół ten ułatwia ocenę skuteczności nowych antygenów szczepionkowych w ciągu 12 tygodni (Rycina 5).

Mikroskopia włókien z elektroprzędzenia, skala średnicy włókien, schemat badań nad materiałami.
Rycina 1: Zbliżenie (12X) igieł glinokrzemianowych stosowanych do wstrzyknięć domięśniowych u dorosłych danio pręgowanych. Końcówka poniżej została odcięta pęsetą i jest gotowa do użycia w mikroiniekcjach. Rycina została zaadaptowana z pracy Oksanena35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Konfiguracja pneumatycznej pompy PicoPump z mikroskopem i mikromanipulatorem do precyzyjnych procesów iniekcji.
Rycina 2: Sprzęt i konfiguracja do mikroiniekcji. Główne komponenty sprzętu niezbędnego do szczepienia DNA dorosłych danio przebrzmiałych zostały wyróżnione pogrubioną czcionką. Wskazano kluczowe ustawienia. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces otrzymywania plazmidu szczepionkowego: schemat klonowania, oczyszczania i mikroiniekcji; analiza białka fuzyjnego GFP.
Rysunek 3: Przygotowanie plazmidów szczepionki DNA oraz procedura immunizacji. (1) Wybrane antygeny są klonowane obok znacznika GFP w plazmidzie pCMV-EGFP. (2) Konstrukt szczepionkowy jest wytwarzany metodami mikrobiologicznymi, zagęszczany i oczyszczany. (3) 12 µg plazmidu jest wstrzykiwane do mięśnia grzbietowego znieczulonego dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroinjektora, a następnie miejsce wstrzyknięcia jest poddawane elektroporacji sześcioma impulsami o napięciu 40 V i czasie trwania 50 ms. (4) Od dwóch do siedmiu dni po szczepieniu ekspresja GFP białka fuzyjnego antygen-GFP jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. (5) Fluorescencyjna część mięśnia grzbietowego może zostać wycięta i wykorzystana do ekstrakcji białek. Wielkość białka fuzyjnego jest potwierdzana analizą western blot, a poziom ekspresji za pomocą testu GFP-ELISA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykrywanie antygenów u ryb danio prążkowanych za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej; porównanie obrazów mikroskopowych.
Rycina 4: Wizualizacja ekspresji białka fuzyjnego antygen-EGFP. Zznieczone dorosłe ryby danio prążkowane są szczepione 12 µg eksperymentalnych antygenów szczepionkowych (antygen 1–3), a miejsce wstrzyknięcia jest następnie poddane elektroporacji za pomocą sześciu impulsów o parametrach 40 V i 50 ms. Od dwóch do siedmiu dni po szczepieniu miejsce wstrzyknięcia jest obrazowane za pomocą mikroskopu. Najpierw ekspresję GFP wykrywa się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obszar jest sprawdzany przy użyciu obiektywu o powiększeniu 2X, a obraz jest zapisywany w formacie .tiff. Obraz z mikroskopu świetlnego tego samego obszaru jest łączony z obrazem fluorescencyjnym przy użyciu oprogramowania ImageJ. Ilość i lokalizacja ekspresji antygenu mogą różnić się w zależności od antygenu i poszczególnych ryb. Na przykład ekspresja antygenu 1 jest obserwowana w obrębie mięśnia grzbietowego, ekspresja antygenu 2 widoczna jest jako małe punkty, natomiast antygen 3 wykazuje silną ekspresję w bardziej ograniczonym obszarze. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces szczepienia DNA, zakażenie M. marinum u ryb, ilościowe oznaczenie qPCR, wykres analizy przeżywalności.
Rysunek 5: Testowanie skuteczności kandydatów na szczepionkę przeciwko zakażeniu prątkami.** (1) Dorosłe danio pręgowane są szczepione eksperymentalnymi szczepionkami DNA przeciwko mikobakteriozie. (2) Pięć tygodni po szczepieniu ryby są zakażane niską dawką Mycobacterium marinum (~30 cfu). (3) Cztery tygodnie później narządy wewnętrzne są wycinane i wykorzystywane do ekstrakcji DNA. (4) Liczba bakterii w każdej rybie jest oznaczana metodą qPCR przy użyciu starterów specyficznych dla M. marinum. Immunizacja antygenem 1 doprowadziła do istotnego zmniejszenia liczby bakterii (p < 0.01, dwuczynnikowa ANOVA), podczas gdy antygeny 2 i 3 nie wywołały żadnego efektu. (5) Efekt ochronny najbardziej obiecującego kandydata na szczepionkę (antygen 1) jest dalej oceniany w eksperymencie dotyczącym przeżywalności, w którym ryby są zakażane wysoką dawką (~10 000 cfu) bakterii, a ich przeżywalność jest monitorowana przez 12 tygodni. Zgodnie ze spadkiem obciążenia bakteryjnego zaobserwowanym w panelu 4, szczepienie antygenem 1 poprawiło również przeżywalność ryb po zakażeniu M. marinum (p <0.01), co sugeruje, że antygen ten może być obiecującym kandydatem na nową szczepionkę przeciwko gruźlicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający ekspresję GFP w zależności od ilości plazmidu; istotne różnice zaznaczone gwiazdkami.
Rycina uzupełniająca 1: Ilość DNA plazmidowego wpływa na ekspresję EGFP pochodzącej z plazmidu u dorosłych danio-ostrobramków. Grupy ryb (n = 5 w każdej grupie) otrzymały wstrzyknięte 0,5–20 μg pCMV-EGFP, a w celu zwiększenia transfekcji zastosowano elektroporację (sześć impulsów o napięciu 50 V). Ryby kontrolne (CTRL) otrzymały wstrzyknięte 2 μg pustego plazmidu pCMV nie zawierającego genu EGFP. 3 dni po wstrzyknięciu wykonano test GFP-ELISA, aby określić względną ekspresję EGFP w homogenatach tkanek ryb. Wartości p: *p <0,03, **p <0,004. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe. NS = brak istotności statystycznej. Rycina została zaadaptowana z pracy Oksanen35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Procedura uodparniania dorosłych ryb danio pręgowanego szczepionkami opartymi na DNA wymaga pewnej wiedzy technicznej. Nawet dla doświadczonego badacza zaszczepienie pojedynczej ryby zajmuje około 3 minut, nie licząc preparatów. W ten sposób w ciągu jednego dnia można zaszczepić maksymalnie około 100 ryb. Jeśli do eksperymentu potrzebnych jest więcej niż 100 ryb, szczepienia można podzielić na okres do 3 dni. Oprócz jakości eksperymentu, dla dobrostanu ryb niezbędne jest wystarczające przeszkolenie badacza (badaczy) w zakresie obchodzenia się z rybami i przeprowadzania immunizacji. Upewnij się, że przestrzegasz lokalnych przepisów i wytycznych dotyczących prawa i dobrostanu zwierząt, jeśli chodzi o trzymanie ryb, planowanie eksperymentów i kwalifikacje wymagane od personelu przeprowadzającego eksperymenty.

Podsumowując, istnieje kilka krytycznych kroków, aby uniknąć komplikacji w protokole szczepień. Aby immunizacja zakończyła się sukcesem, należy upewnić się, że 1) ryby, które mają być zaszczepione, są zdrowe oraz mają wystarczający wiek i wielkość (uodpornienie większej liczby młodych ryb może wymagać zmniejszenia objętości szczepionki i ustawień elektroporacji); 2) ryby są odpowiednio znieczulane estrem etylowym kwasu 3-aminobenzoesowego nie silniejszym niż 0,02% i pozostają znieczulone przez cały czas trwania zabiegu (znieczulenie powinno być jak najkrótsze, aby zapewnić powrót ryb do zdrowia); 3) podkładka z gąbki jest odpowiednio nasączona; 4) ciecz jest wtryskiwana w każdym impulsie z pompy pneumatycznej, a jeśli nie, długość impulsu jest regulowana (pomocne może być lekkie pociągnięcie igły do tyłu wzdłuż osi y); 5) w roztworze szczepionki nie ma pęcherzyków powietrza; 6) ustawienia elektroporacji oraz rzeczywiste napięcie i długość impulsu są prawidłowe; 7) Elektrody nie powodują uszkodzeń skóry w miejscu elektroporacji (podczas elektroporacji należy utrzymywać elektrody w delikatnym kontakcie z rybą i natychmiast wypuszczać rybę do zbiornika rekuperacyjnego po elektroporacji).

Ważne jest, aby monitorować ryby po elektroporacji w zbiorniku rekonwalescencji i poddać eutanazji każdą rybę wykazującą oznaki dyskomfortu. Ponadto konieczne jest przećwiczenie procedury przed rozpoczęciem eksperymentu na dużą skalę, aby zapewnić płynny przebieg pracy. Jeśli to możliwe, poproś odpowiednio przeszkolonego kolegę o pomoc w napełnianiu igieł i elektroporacji.

Metoda szczepienia DNA umożliwia projektowanie antygenów szczepionkowych dostosowanych do indywidualnych potrzeb. Możliwe jest sklonowanie całego antygenu lub, najlepiej, wybranych części antygenu na podstawie lokalizacji komórkowej i immunogenności24. Ponadto metoda umożliwia połączenie kilku antygenów lub adiuwantów w jeden konstrukt szczepionki lub wstrzyknięcie kilku oddzielnych plazmidów w tym samym czasie2. Poprzez włączenie kodonu stop po sekwencji antygenu lub poprzez wycięcie genu EGFP z plazmidu, możliwe jest wykorzystanie tego samego wektora plazmidowego również do ekspresji antygenu bez kolejnego N-końcowego znacznika GFP. Może to być uzasadnione dla potwierdzenia pozytywnych wyników badań przesiewowych, ponieważ stosunkowo duży rozmiar GFP może wpływać na fałdowanie antygenu, a tym samym ograniczać reakcje humoralne potencjalnie wywołane przez szczepienie.

Wyższa ekspresja antygenu została powiązana z immunogennością szczepionki DNA2. Elektroporacja po wstrzyknięciu została zatem uwzględniona w tym protokole, ponieważ wykazano, że zwiększa ekspresję antygenów lub genów reporterowych od czterokrotnie do dziesięciu razy u danio pręgowanego32. Co więcej, elektroporacja jako technika powoduje umiarkowane uszkodzenie tkanek, wywołując w ten sposób miejscowy stan zapalny, który dodatkowo sprzyja odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką2. Z drugiej strony, elektroporacja jest na ogół dobrze tolerowana. Dzięki zastosowanemu tutaj sprzętowi praktycznie 100% dorosłych ryb danio pręgowanych dobrze zregeneruje się po sześciu impulsach 40 V zastosowanych w tym protokole35.

Oprócz stosowania elektroporacji w celu zwiększenia wnikania plazmidu szczepionkowego do komórek, używamy silnego, wszechobecnego promotora w plazmidzie szczepionkowym i ogona poliA na końcu 3' antygenu, aby poprawić ekspresję antygenu w transfekowanych komórkach ryb. W niektórych przypadkach, jeśli użycie kodonu przez patogen docelowy znacznie różni się od gatunku szczepionego, optymalizacja kodonów okazała się przydatna w dalszym zwiększaniu ekspresji genu docelowego2. Jednak w tym modelu danio pręgowanego-M. marinum optymalizacja kodonów nie miała znaczącego wpływu na poziomy ekspresji dwóch genów modelu mykobakteryjnego, ESAT-6 i CFP-10, a zatem została uznana za niepotrzebną w tym modelu35.

Profile ekspresji genów docelowych wykazują pewne różnice czasowe między antygenami, w zależności na przykład od wielkości i struktury danych antygenów. Jednak ekspresja antygenu jest zwykle podobna w grupie ryb uodpornionych tą samą szczepionką. Zazwyczaj najjaśniejszą ekspresję EGFP obserwuje się od czterech dni do tygodnia po szczepieniu, ale możliwa jest skala od 2 do 10 dni. Zaleca się walidację ekspresji każdego białka fuzyjnego antygenu-EGFP w małej grupie ryb (2-3) przed włączeniem antygenu do eksperymentu na dużą skalę. Jeśli w którymkolwiek momencie po szczepieniu nie zaobserwuje się ekspresji GFP, upewnij się, że 1) protokół szczepień był dokładnie przestrzegany. Zawsze należy zaszczepić grupę ryb pustym plazmidem pCMV-EGFP jako kontrolą pozytywną i upewnić się, że 2) projekt antygenu i klonowanie molekularne zostały przeprowadzone prawidłowo (odpowiedni projekt startera; antygen i znacznik EGFP znajdują się w tej samej ramce odczytu i nie są uwzględnione żadne pośrednie kodony stop). W niektórych przypadkach, pomimo prawidłowego projektu antygenu, GFP nie może zostać wykryte. Może to być spowodowane nieprawidłowym fałdowaniem lub szybkim rozpadem białka fuzyjnego. W takich okolicznościach może być konieczne przeprojektowanie antygenu.

W szczepionkach stosowanych do uodparniania ryb hodowlanych stosowana dawka plazmidu wynosi zwykle 1 μg lub mniej 7,33,34. U danio pręgowanego ekspresję genu reporterowego można również wykryć po wstrzyknięciu plazmidu o wielkości co najmniej 0,5 μg po elektroporacji; jednak względna ekspresja genu docelowego znacznie wzrasta wraz z większą ilością plazmidu na rybę (rysunek uzupełniający 1). U ryb, którym wstrzyknięto plazmid reporterowy pCMV-EGFP, wstrzyknięcie 5-20 μg plazmidu spowodowało od czterech do ośmiu razy wyższe poziomy EGFP w porównaniu z rybami, którym wstrzyknięto 0,5 μg. Dlatego, aby zapewnić wystarczająco wysoką ekspresję genu docelowego, a jednocześnie mieć wystarczająco małe objętości wstrzyknięć (≤7 μl), aby zapobiec nadmiernemu uszkodzeniu tkanek lub wyciekowi szczepionki, zdecydowaliśmy się użyć od 5 do 12 μg na rybę do celów wstępnych badań przesiewowych. Oprócz immunogenności szczepionki, wymagana jest wystarczająco wysoka ekspresja genu docelowego, aby wykryć ekspresję genu reporterowego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i western blot, co jest niezbędne do celów przesiewowych w celu potwierdzenia prawidłowej translacji in vivo docelowego antygenu. Jednak niższe dawki plazmidu (0,5–1 μg) mogą być przydatne do innych rodzajów zastosowań eksperymentalnych.

Podsumowując, ten protokół immunizacji dorosłych ryb danio pręgowanego plazmidem DNA może być stosowany w testach przedklinicznych nowych kandydatów na szczepionki przeciwko różnym infekcjom bakteryjnym lub wirusowym. Ekspresja antygenu szczepionkowego jako białka fuzyjnego GFP pozwala na wizualizację udanego zdarzenia immunizacji i ekspresji antygenu. Stosujemy tę metodę do przedklinicznych badań przesiewowych nowych kandydatów na antygen szczepionkowy przeciwko gruźlicy. W tym celu zakażamy danio pręgowanego pięć tygodni po szczepieniu i określamy liczbę bakterii u każdej ryby za pomocą qPCR20,24.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni członkom grupy badawczej immunologii eksperymentalnej, a szczególnie Leenie Mäkinen i Hannaleenie Piippo, za całą pracę, którą wykonali w rozwoju i optymalizacji protokołu szczepień, oraz za ich pomoc w rzeczywistych eksperymentach z wykorzystaniem protokołu.

Ta praca była wspierana przez Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Fundacja Jane i Aatos Erkko; do M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Fundacja Sigrid Juselius; do M.R.), Konkurencyjne Finansowanie Badań Państwowych w obszarze Odpowiedzialności Ekspertów Szpitala Uniwersyteckiego w Tampere (do M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Fundacja Gruźlicy Tampere; do M.R., Jego Wysokość i M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fińska Fundacja Kultury; do Jej Wysokości), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (Fińska Fundacja Przeciwgruźlicza; do Jej Wysokości), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Fundacja Väinö i Laina Kivi; do M.N.) oraz Fundacja Naukowa Miasta Tampere (do M.N.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pCMV-GFP plazmidAddgene#11153
2-propanolSigma-Aldrich278475-2LEkstrakcja DNA
Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA0166-5G
ChloroformMerck1.02445.2500Ekstrakcja DNA
ECM Electro Square PoratorBTX Aparat HarvardBTX ECM 830
FastPrep-24 5GMP Biomedicals116005500homogenizator
Płonący/brązowy ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-97Wyciąganie igieł
Zestaw do oczyszczania GeneJet PCRThermoFischer ScientificK0701
GFP Zestaw ELISACell Biolabs, Inc.AKR-121
Tiocyjanian guanidyny (FW 118.2)Sigma-AldrichG9277-500GEkstrakcja DNA
ImageJ2imagej.net/Downloadsdarmo dostępne oprogramowanie
LB AgarSigmaL2897-1kg
LB Bulion (Miller)SigmaL3522-1kg
MikromanipulatorNarishigeMA-153
MikroskopNikonAZ100fluorescencyjny
MikroskopOlympusZS61
Nightsea Pełny system adapterów z głowicą świetlną Royal Blue ColorMikroskopia elektronowa SciencesSFA-RB
PBS tabletkiVWR ChemicalsE404-200TABL.
Czerwona sól sodowa fenolowaSigma-Aldrich114537-5G
PV830 Pompa Phneumatic Pico WPISYS-PV830
QIAGEN Plasmid Maxi kitIdentyfikator Qiagen: 12163ekstrakcja plazmidu
Cytrynian sodu (FW294.1)VWR Chemicals27833.294Ekstrakcja DNA
Tri ReagentMolecular Research Center, Inc.TR 118Ekstrakcja DNA
Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)SigmaA5040-100groztwór do anestezji i eutanazji
Tris (wolna zasada) (FW121.14)VWR Life Science0497-500GEkstrakcja DNA
Pęsety Elektrody (7 mm) ZestawyBTX Aparat HarvardBTX 450165pęseta elektrody typu pęseta
2,8 mm Koraliki ceramiczneOmni International19-646-3Ekstrakcja DNA
2 ml Wytrzymałe probówki z nakrętkamiOmni International19-649Ekstrakcja DNA
Naczynia włosowate glinokrzemianoweAparat Harvarda30-0108
Mikroładowarka 20 i mikro; Leppendorf5242956.003Wskazówki dotyczące ładowania
Petriego, 16 mmSarsted82.1473
Skalpele SwanMorton0501
Folia laboratoryjnaParafilmBemis
Szpilki
Plastikowa łyżka
Szpatułka
Gąbka
Styropian
Pęseta warsztatowa
mikroskop szalki

Bibliografia

  1. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
  2. Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
  4. Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
  5. Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
  6. Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340(2017).
  7. Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
  8. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
  10. Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
  11. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  12. Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
  13. Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
  14. Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
  15. Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
  16. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
  17. Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
  18. Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
  19. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  20. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944(2012).
  21. Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
  22. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196(2016).
  23. Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
  24. Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942(2017).
  25. Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
  26. Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
  27. Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
  28. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  31. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  32. Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H. Electroporation of adult zebrafish. Methods in Molecular Biology. 423, 289-298 (2008).
  33. McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
  34. Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
  35. Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wakcynacja DNAimmunizacja danio prze uchowcakonstrukcja plazmiduwstrzykiwanie domi nioweelektroporacjabia ka fuzyjne GFPdetekcja metod ELISAanaliza Western blotilo ciowe PCR qPCRMycobacterium marinum
Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.