Artykuł metodologiczny

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

DOI:

10.3791/58461

⸱

11 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne i specyficzne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) w różnych komórkach i tkankach jest niezbędne do badania sygnalizacji regulowanej przez redoks w warunkach biologicznych. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jedyną bezpośrednią metodą jednoznacznej oceny wolnych rodników. Jego zaletą jest to, że wykrywa poziomy fizjologiczne określonych gatunków z dużą swoistością, ale wymaga specjalistycznej technologii, starannego przygotowania próbki i odpowiednich kontroli, aby zapewnić dokładną interpretację danych. Cykliczne sondy spinowe hydroksyloaminy reagują selektywnie z ponadtlenkiem lub innymi rodnikami, generując sygnał nitrooksydowy, który można określić ilościowo za pomocą spektroskopii EPR. Przepuszczające komórki sondy spinowe i sondy spinowe zaprojektowane do szybkiej akumulacji w mitochondriach pozwalają na określenie stężenia ponadtlenkowego w różnych przedziałach komórkowych.

W hodowanych komórkach, użycie przepuszczalnej dla komórek 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CMH) wraz z i bez niej, lub bez wstępnej obróbki dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), lub użycie przepuszczalnego dla komórek PEG-SOD, pozwala na odróżnienie zewnątrzkomórkowego od cytozolowego ponadtlenku. Mitochondrialny dichlorek 1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopiperydyny,1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido] piperydyniowego (mito-TEMPO-H) pozwala na pomiar mitochondrialnych ROS (z przewagą ponadtlenku).

Sondy spinowe i spektroskopia EPR mogą być również stosowane do modeli in vivo. Ponadtlenek można wykryć w płynach pozakomórkowych, takich jak krew i płyn pęcherzykowy zębodoł, a także w tkankach, takich jak tkanka płucna. Przedstawiono kilka metod przetwarzania i przechowywania tkanek do pomiarów EPR oraz dostarczania dożylnej sondy spinowej 1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CPH) in vivo. Podczas gdy pomiary można wykonywać w temperaturze pokojowej, próbki uzyskane z modeli in vitro i in vivo mogą być również przechowywane w temperaturze -80 °C i analizowane za pomocą EPR w temperaturze 77 K. Próbki mogą być przechowywane w specjalistycznych rurkach stabilnych w temperaturze -80 °C i pracujących w temperaturze 77 K, co umożliwia praktyczną, wydajną i powtarzalną metodę, która ułatwia przechowywanie i przenoszenie próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy pomiary stresu oksydacyjnego i reaktywnych form tlenu są ważne dla badania różnorodnych chorób we wszystkich układach narządów, wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) jest trudne ze względu na krótki okres półtrwania i wysoką reaktywność. Technika elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest najbardziej jednoznaczną metodą wykrywania wolnych rodników. Sondy wirowe mają przewagę nad częściej stosowanymi sondami fluorescencyjnymi. Chociaż sondy fluorescencyjne są stosunkowo niedrogie i łatwe w użyciu oraz zapewniają szybkie, czułe wykrywanie ROS, mają poważne ograniczenia ze względu na fałszywe sygnały, niemożność obliczenia stężeń ROS i ogólny brak specyficzności1.

Aby ułatwić korzystanie z EPR do badań biologicznych, zsyntetyzowano różne sondy spinowe, które mogą mierzyć szereg biologicznie istotnych gatunków wolnych rodników, a także pO2, pH i stany redoks2,3,4,5,6,7. Pułapki spinowe zostały również opracowane w celu wychwytywania krótkotrwałych rodników i tworzenia długotrwałych adduktów, co ułatwia wykrywanie przez EPR8. Obie klasy (sondy spinowe i pułapki spinowe) mają swoje zalety i ograniczenia. Jedną z powszechnie stosowanych klas sond spinowych są cykliczne hydroksyloaminy, które są ciche EPR i reagują z krótkotrwałymi rodnikami, tworząc stabilny nitroksyl. Cykliczne hydroksyloaminy reagują z ponadtlenkiem 100 razy szybciej niż pułapki spinowe, co pozwala im konkurować z przeciwutleniaczami komórkowymi, ale brakuje im swoistości i wymagają zastosowania odpowiednich kontroli i inhibitorów w celu identyfikacji rodnika lub źródła odpowiedzialnego za sygnał nitroksydowy. Podczas gdy pułapki spinowe wykazują specyficzność, z wyraźnymi wzorcami widmowymi w zależności od uwięzionych gatunków, mają powolną kinetykę pułapki spinowej ponadtlenkowej i są podatne na biodegradację adduktów rodnikowych. Zastosowania pułapek spinowych zostały dobrze udokumentowane w badaniach biomedycznych9,10,11,12,13.

Celem tego projektu jest zademonstrowanie praktycznych metod EPR do projektowania eksperymentów i przygotowywania próbek do wykrywania ponadtlenku za pomocą sond spinowych w różnych przedziałach komórkowych in vitro i w różnych przedziałach tkankowych in vivo. W kilku manuskryptach opublikowano protokoły związane z tymi celami, wykorzystujące przepuszczalne dla komórek, nieprzepuszczalne dla komórek i mitochondrialne sondy spinowe do celowania w różne przedziały komórkowe in vitro i przetwarzanie tkanki do analizy w modelach mysich14,15. Opieramy się na tej literaturze, walidując podejście do pomiaru ponadtlenku za pomocą sondy spinowej 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CMH) w różnych przedziałach komórkowych in vitro, aby zapewnić dokładne pomiary, podkreślając potencjalne problemy techniczne, które mogą zniekształcić wyniki. Udostępniamy również metody do wykonywania pomiarów EPR we krwi, płynie z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych oraz tkance płucnej za pomocą sondy spinowej CMH. W badaniach tych porównano różne metody przetwarzania tkanek, a także przedstawiono metodę wstrzykiwania myszom innej sondy spinowej, CPH, przed pobraniem tkanki. Na koniec opracowujemy praktyczną metodę przechowywania próbek w rurkach z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby umożliwić przechowywanie i przenoszenie próbek przed pomiarami EPR w temperaturze 77 K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado w Denver.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Zapas kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA) (150 mM)
    1. Dodaj 2,95 g DTPA (393,35 g/mol) do 10 ml wody dejonizowanej.
    2. Aby rozpuścić DTPA, dodaj kroplami 1 M NaOH i doprowadź do pH 7,0.
    3. Doprowadzić objętość do 50 ml wodą, aby uzyskać końcowe stężenie DTPA 150 mM i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Bufor fosforanowy solany (PBS) (50 mM, pH 7,4)
    1. Przygotować 5 M chlorku sodu (NaCl) (58,44 g/mol; 29,22 g/100 ml).
    2. Przygotować 1 M dwuzasadowego fosforanu potasu HK2PO4 (174,18 g/mol; 17,42 g/100 ml)
    3. Przygotować 1 M jednozasadowego fosforanu potasu KH2PO4 (136,1 g/mol; 13,61 g/100 ml). Zmieszać 3 ml 5 M NaCl z 4,24 ml 1 M dwuzasadowego fosforanu potasu i 0,760 ml 1 M fosforanu potasu jednozasadowego. Sprawdź pH.
    4. Doprowadzić objętość do 100 ml wodą dejonizowaną.
    5. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez krótki okres (dni) i w temperaturze 4 °C przez długi czas (tygodnie).
  3. Bufor Krebsa-Henseleita (KHB) zawierający 100 μM DTPA
    1. Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 33,3 μl 150 mM roztworu podstawowego DTPA.
    2. Doprowadzić do objętości 50 ml za pomocą buforu Krebs-Henseleit (KHB).
    3. Codziennie przygotowuj świeży bufor z DTPA i utrzymuj go w temperaturze RT.
  4. Bufor tris-EDTA zawierający sacharozę
    1. Przygotować 0,5 M bulionu Tris: rozpuścić 15,14 g zasady Tris (121,14 g/mol) w 150 ml wody dejonizowanej. Za pomocą HCl dostosuj pH do 7,8 i doprowadź do końcowej objętości 250 ml.
    2. Rozpuścić 21,4 g sacharozy (342,29 g/mol; stężenie końcowe = 0,25 mM) w 150 ml wody dejonizowanej.
    3. Dodać 5 ml bulionu Tris do sacharozy, aby uzyskać końcowe stężenie Tris 10 mM.
    4. Dodać 0,5 ml 0,5 M bulionu EDTA do tris-sacharozy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
    5. Sprawdź pH i dostosuj je do 7,4.
    6. Doprowadzić do końcowej objętości 250 ml wodą dejonizowaną i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Bydlęca dysmutaza ponadtlenkowa Cu/Zn (SOD) (30 000 U/ml) bydła
    1. Rozpuść 30 000 j. SOD w 1 ml PBS (około 5,7 mg, w zależności od aktywności partii SOD).
    2. Dobrze wymieszać, podaszkować i przechowywać w temperaturze -20°C przez krótki okres (6-12 miesięcy) i w temperaturze -80°C przez długi czas.
  6. Roztwór roboczy SOD (1000 U/ml)
    1. Przenieść 30 μl podwielokrotności 30 000 U/ml bulionu SOD do 870 μl sterylnego PBS.
    2. Trzymaj roztwór na lodzie i używaj go świeżego.
  7. Kolba 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) (5 mM)
    1. Rozpuścić 1 mg PMA (616,83 g/mol) w 325 μl DMSO (stężenie końcowe = 5 mM).
    2. Porcjować roztwór PMA o stężeniu 5 mM i przechowywać go w temperaturze -20 °C.
  8. Roztwór roboczy PMA (125 μM)
    1. Rozcieńczyć 10 μl podwielokrotności 5 mM PMA w 390 μl sterylnego PBS.
    2. Trzymaj roztwór na lodzie i używaj go świeżego.
    3. Do kontroli pojazdu pod kątem PMA należy użyć 10 μl DMSO w 390 μl PBS.
  9. Chlorek difenyliodoniowy (DIP) (2,5 mM)
    1. Rozpuścić 3,2 mg DIP (316,57 g/mol) w 4 ml, aby uzyskać 2,5 mM zapasu.
    2. Przygotuj roztwór i użyj go na świeżo.
  10. Sól metylanu deferoksaminy (DFO) (20 mM)
    1. Rozpuścić 4,5 mg DFO (656,79 g/mol) w 340 μl, aby uzyskać 20 mM zapasu.
    2. Przygotuj roztwór i użyj go na świeżo.
  11. Przygotowanie zapasu antymycyny A (AA) (5 mM)
    1. Rozpuścić 5,4 mg AA (532 g/mol) w 2 ml etanolu (stężenie końcowe = 5 mM).
    2. Porcjować zapas do szklanych fiolek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  12. Przygotowanie sond wirowych
    1. Bufor fosforanowy 50 mM zawierający 100 μM DTPA z azotem przez 30 minut w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu z buforu.
    2. Wyjmij sondę wirowania z zamrażarki -20 °C i pozwól pojemnikowi dojść do temperatury rynkowej (10-15 min).
    3. Odważyć 2,4 mg 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny·HCl (CMH) (237,8 g/mol)
    4. Rozpuścić CMH w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 10 mM.
    5. Odważyć 5 mg dichlorku 1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopirydyny,1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido]piperidinium dichlorku (mito-TEMPO-H) (529,1 g/mol).
    6. Rozpuścić mito-TEMPO-H w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 9,5 mM.
    7. Odważyć 4,9 mg 1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny·HCl (CPH) (223,7 g/mol).
    8. Rozpuścić CPH w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 22 mM.
    9. Porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C (zamrażanie i rozmrażanie nie jest zalecane).

2. Wykrywanie ponadtlenku in vitro

  1. Wykrywanie całkowitego, zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego ponadtlenku w stymulowanych PMA komórkach RAW 264.7 w RT
    1. Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, rozmrozić komórki RAW 264.7 i przejść je w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS (low endototoksyn-free) i 1% antygrzybikiem/ampicyliną w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
    2. Wysiewaj RAW 264,7 komórek w 1 x 106 komórek/studzienkę do płytek 6-dołkowych na jeden dzień przed zabiegiem.
    3. Delikatnie usuń pożywkę i umyj komórki raz 1 ml buforu KHB.
    4. Dodać KHB zawierający 100 μM DTPA do każdej studzienki i potraktować w całkowitej objętości 500 μl następującymi środkami:
    5. W przypadku studzienek wstępnie potraktowanych SOD dodać 15 μl/studzienkę roztworu roboczego SOD (1000 U/ml; końcowe stężenie SOD = 30 U/ml) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C przed dodaniem CMH i PMA.
    6. Dodać 12,5 μl / studzienkę 10 mM zapasu CMH (stężenie końcowe = 0,25 mM).
    7. Dodać 40 μl/basenik 125 μM roztworu roboczego PMA (stężenie końcowe = 10 μM) lub 40 μl nośnika (zapas 10 μl DMSO w 390 μl PBS).
    8. Inkubować przez 50 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
    9. Wyjąć płytki z inkubatora i natychmiast umieścić je na lodzie.
    10. Zebrać bufor z każdej studzienki w oddzielnych 1,5 ml, oznakowanych probówkach. Trzymaj się lodu przez cały czas.
    11. Dodać 100 μl świeżego buforu KHB zawierającego 100 μM DTPA, delikatnie zeskrobać komórki i ponownie zawiesić, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przechowywać na lodzie przez cały czas podwieszania komórek.
    12. Pobrać próbkę pobraną w krokach 2.1.10 i 2.1.11 (50 μl) do każdej z probówek kapilarnych. Uszczelnij oba końce i uruchom EPR.
      UWAGA: Zawsze testuj probówkę lub studzienkę (bez komórek) zawierającą sondę w buforze (to samo stężenie = 0,25 mM), traktowaną w tych samych warunkach, co komórki (ten sam czas inkubacji i temperatura) jako kontrola, ponieważ intensywność tła sondy jest zależna od temperatury i czasu.
    13. Ustaw parametry akwizycji EPR na następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3432 G; amplituda modulacji = 2,0 G; szerokość przemiatania = 80 G; moc mikrofal = 19,9 mW; całkowita liczba skanów = 10; czas przemiatania = 12,11 s; i stała czasowa = 20,48 ms.
  2. Wykrywanie mitochondrialnego ponadtlenku w komórkach RAW 264.7
    1. Wykonaj kroki 2.1.1 i 2.1.2, aby zasiać komórki RAW 264.7 na dzień przed eksperymentem.
    2. Usuń pożywkę i przemyj komórki raz 1 ml buforu KHB.
    3. Do każdego dołka dodać 200 μl KHB zawierającego 100 μM DTPA.
    4. Dodać 5,3 μl/studzienkę 9,5 mM mito-TEMPO-H (stężenie końcowe = 0,25 mM)
    5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać 1 μl/studzienkę antymycyny A (AA), 5 mM roztworu podstawowego w etanolu (stężenie końcowe = 25 μM).
    7. Inkubować przez 50 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
    8. Wyjąć płytki z inkubatora i natychmiast umieścić je na lodzie.
    9. Delikatnie zeskrobać komórki i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Trzymaj na lodzie.
    10. Załaduj próbkę do rurki kapilarnej. Uszczelnij oba końce.
    11. Patrz poprzednia sekcja, aby zapoznać się z ustawieniami EPR.
  3. Wykrywanie ponadtlenku w komórkach RAW 264,7 w temperaturze 77 K
    1. Umieść bufor zebrany w kroku 1.1.10 we wstępnie przygotowanych rurkach PTFE o długości 1-2 cali (3/16" OD x 1/8" ID). Upewnij się, że rurka PTFE jest prosta, aby można ją było łatwo wkładać i wyjmować z palca dewara. Za pomocą gumowego korka zamknąć jeden koniec rurki PTFE, odpipetować bufor lub zawiesinę komórek (100 do 150 μl) do rurki PTFE i uszczelnić rurkę drugim korkiem.
    2. Błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do oznakowanej probówki do krioprezerwacji w celu przechowywania w temperaturze -80 °C lub natychmiast uruchomić.
    3. Napełnij palec dewara ciekłym azotem i włóż rurkę PTFE zawierającą próbkę do palca dewara. Upewnij się, że próbka jest wyśrodkowana w przestrzeni czynnej rezonatora i uruchom EPR przy 77 K.
      UWAGA: Rozpocznij przepływ azotu gazowego do spektrometru 15-30 minut przed pomiarami i kontynuuj ten przepływ przez cały czas pomiarów, aby zapobiec kondensacji wody w rezonatorze.
    4. Ustaw parametry akwizycji EPR na następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3438 G; amplituda modulacji = 4,0 G; szerokość przemiatania = 150 G; moc mikrofal = 0,316 mW; całkowita liczba skanów = 10; czas przemiatania = 60 s; i stała czasowa = 1,28 ms.

3. Pomiary EPR w płynach

  1. Krew pełna
    1. Potraktuj myszy (w wieku 8-12 tygodni) pojedynczą dawką dotchawniczej bleomycyny (Bleo; 100 μL przy 1 U/ml) rozpuszczoną w PBS lub samym PBS, jak opisano wcześniej16,17.
    2. Eutanazja myszy polega na podawaniu wziewnego izofluranu (1,5-4%), a następnie wykrwawieniu i zwichnięciu szyjki macicy. Odessać krew przez prawą komorę do strzykawki pokrytej heparyną (1000 USP/ml) zawierającej 100 μM DTPA i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. W oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 15 μl PBS zawierającego 100 μM DTPA i 3 μl CMH (10 mM) do 132 μl krwi, uzyskując całkowitą objętość 150 μl i końcowe stężenie CMH 0,2 mM.
    4. Inkubować krew przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    5. Wyjmij rurki z łaźni wodnej.
    6. Pobrać podwielokrotność, ładując krew do rurki kapilarnej i uruchomić EPR w temperaturze pokojowej z następującymi parametrami akwizycji EPR: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3432 G; amplituda modulacji = 1,0 G; szerokość przemiatania = 80 G; moc mikrofal = 19,9 mW; całkowita liczba skanów = 3; czas przemiatania = 12,11 s; i stała czasowa = 20,48 ms. Alternatywnie, próbki można błyskawicznie zamrażać zgodnie z opisem w kroku 2.3 dla pomiarów w temperaturze 77 K. Parametry akwizycji EPR są następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3438 G; amplituda modulacji = 4,0 G; szerokość zamiatania = 150 G; moc mikrofal = 0,316 mW; łączna liczba skanów = 2; czas przemiatania = 60 s; i stała czasowa = 1,28 ms.
  2. Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)
    1. Po eutanazji (patrz krok 3.1.2) należy pobrać BALF, powoli wkraplając i pobierając 1 ml PBS zawierającego 100 μM DTPA trzykrotnie do strzykawki za pomocą kaniuli umieszczonej w tchawicy.
    2. W probówce o pojemności 1,5 ml potraktuj 200 μl BALF 4 μl CMH (10 mM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mM.
    3. Inkubować BALF przez 50 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    4. Wyjmij rurki z łaźni wodnej i umieść je na lodzie.
    5. Załadować BALF do rurki kapilarnej i uruchomić EPR w temperaturze pokojowej z tymi samymi ustawieniami EPR, jakie użyto w kroku 1.1.13, lub błyskawicznym zamrożeniem w ciekłym azocie, jak opisano w kroku 2.3.
  3. Pomiary EPR we krwi i BALF w 77 K
    1. Postępuj zgodnie z powyższym protokołem, aby pobrać krew (kroki 3.1.1 do 3.1.4) i BALF (kroki 3.2.1 do 3.2.4).
    2. Umieść 150 μl leczonej krwi lub BALF w rurkach PTFE (1-2 cale). Użyj gumowego korka, aby zamknąć jeden koniec rurki PTFE przed dodaniem próbki, a drugi korek, aby uszczelnić rurkę.
    3. Błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie.
    4. Patrz sekcja 2.3 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat uruchamiania EPR w zamrożonych próbkach w rurkach PTFE za pomocą palca dewara w temperaturze 77 K. Uruchom Frozen CMH traktowane próbki krwi w ciągu tygodnia.

4. Pomiary EPR na tkance płucnej

  1. Błyskawiczne zamrożenie tkanki płucnej
    1. Po pobraniu BALF w kroku 3.2.1 klatka piersiowa jest otwierana, a płuca przepłukiwane 10 ml zimnego PBS przez prawą komorę w celu usunięcia krwi. Błyskawiczne zamrożenie tkanki płucnej w ciekłym azocie. Zamrożoną tkankę płucną można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, aż do wykorzystania do pomiarów EPR.
    2. Ustabilizuj tkankę płucną na suchym lodzie za pomocą pęsety i wytnij wiele małych kawałków (5-15 mg) tkanki płucnej za pomocą ostrza o jednym ostrzu.
    3. Zważ tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml, umieść probówkę na wadze i wytaruj wagę, a następnie dodaj kawałki tkanki i zapisz wagę.
    4. Do tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 196 μl KHB zawierającego DTPA i 4 μl CMH (0,2 mM), aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl.
    5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    6. Odwirować (przez kilka sekund) w mikrowirówce o sile 3 884 x g.
    7. Umieścić na lodzie i odpipetować 150 μl supernatantu do rurki PTFE i zamrozić w celu wykonania pomiarów 77 K, jak opisano w sekcji 2.3.
      UWAGA: W przypadku tej metody należy wziąć pod uwagę niejednorodność urazu. W przypadku uszkodzenia płuc wywołanego bleomycyną, biorąc pod uwagę, że jest to uraz wysoce niejednorodny, zaleca się wycięcie kilku kawałków tkanki z różnych części płuc od każdej myszy. Alternatywnie, większy fragment tkanki można homogenizować w buforze KHB zawierającym 100 μM DTPA w stosunku wagowym do objętościowym 1:6 (mg/μL), jak opisano poniżej.
  2. Świeża tkanka płucna zakonserwowana w buforze sacharozy
    1. Przepłukać płukane płuca zimnym PBS, aby usunąć krew, jak to zrobiono w kroku 3.1.2.
    2. Homogenizować świeżą tkankę płucną w buforze Tris-EDTA zawierającym 0,25 M sacharozy w stosunku 1:6 płuco/bufor (mg/μl) za pomocą młynka do tkanek Dounce ze szkłem lub tłuczkiem PTFE.
    3. Dodać 50 μl homogenatu płucnego do 450 μl KHB zawierającego 100 μM DTPA.
    4. W probówce o pojemności 1,5 ml (o całkowitej objętości 100 μl) do 98 μl homogenatu płucnego w KHB dodać 2 μl CMH o zawartości 10 mM, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mM.
    5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    6. Umieść próbki na lodzie i załaduj je do rurki kapilarnej. Uruchom EPR w RT (ustawienia używane w kroku 2.1.13).
    7. Aby przetestować udział określonych gatunków i źródeł przy użyciu różnych inhibitorów, należy wstępnie potraktować 88 μl homogenatu płucnego +/- inhibitora, dostosowując go za pomocą KHB, aby uzyskać końcową objętość 98 μl. W tym eksperymencie inhibitory zawierały 10 μl SOD (100 U/ml), 4 μl deferoksaminy (DFO; stężenie końcowe = 800 μM) lub 4 μl chlorku difenylodonium (DIP; stężenie końcowe = 100 μM). Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    8. Dodać 2 μl CMH i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wykonać pomiary EPR, jak opisano powyżej. Dołączyć jednorazowo dopasowaną próbkę ślepą z CMH KHB zawierającą bufor sacharozy. Alternatywnie, należy przechowywać podwielokrotności pozostałych homogenatów płuc (etap 3.1.2) w temperaturze -80 °C do przyszłych pomiarów.
      UWAGA: Całkowitą objętość można skalować w zależności od potrzeb.
  3. Pomiary EPR na tkance płucnej myszy, którym wstrzyknięto sondy spinowe in vivo (w RT z wykorzystaniem komórek tkankowych)
    1. Przygotować roztwór podstawowy CPH, rozpuszczając 4,9 mg CPH w 1 ml przefiltrowanego i odtlenionego 50 mM buforu fosforanowego.
    2. Znieczulaj myszy wziewnym izofluranem (1,5-4%) przez 20-30 sekund, aż przestaną reagować na szczypanie palców. Wstrzyknąć myszom drogą zadoczodołową 100 μl sondy spinowej CPH na masę ciała myszy 25 g (dawka końcowa = 20 mg/kg) i pozwolić sondzie krążyć przez 1 godzinę. Natychmiast po wstrzyknięciu zaoczodołowym dodaj jedną kroplę 0,5% proparakainy HCl na okolicę oczu, aby zapobiec bólowi i suchości oka. Monitoruj myszy przez 1 godzinę i przystąp do pobierania tkanek.
    3. Zbierz tkankę płucną zgodnie z powyższym opisem i błyskawicznie zamroź płuca.
    4. Pokrój 20-30 mg zamrożonej tkanki na suchym lodzie i zapisz dokładną wagę.
    5. Delikatnie przetrzyj chusteczkę chusteczkami czyszczącymi, aby wchłonąć wodę powierzchniową.
    6. Umieść tkankę w okienku komórki tkankowej (akcesorium umożliwia pomiary EPR dla próbek tkanek) i uruchom EPR w celu określenia całkowitych spinów. Dane można wyrazić jako całkowitą liczbę spinów na mg tkanki.

5. Analiza danych

  1. Symuluj widma EPR za pomocą modułu SpinFit wbudowanego w oprogramowanie ksenonowe stacjonarnego spektrometru EMXnano EPR. Określ stężenie azotoksydu za pomocą modułu SpinCount. Alternatywnie można wykonać krzywą kalibracyjną stabilnego nitrolokdu, takiego jak 4-hydroksy-TEMPO lub TEMPOL, a stężenie można uzyskać, porównując intensywność sygnału z próbką i wzorcem.
  2. W przypadku danych zebranych w temperaturze 77 K należy użyć podwójnej integracji, a następnie funkcji SpinCount.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie ponadtlenków za pomocą CMH zostało zweryfikowane za pomocą systemu generowania ponadtlenków X/XO, aby wykazać, że sygnał nitroksydu (CM) był całkowicie hamowany przez SOD, podczas gdy katalaza nie miała żadnego wpływu (Rysunek 1A). Całkowity, zewnątrzkomórkowy ponadtlenek został następnie oceniony w komórkach RAW 264.7 poprzez inkubację komórek za pomocą przepuszczalnej dla komórek sondy spinowej CMH +/- SOD do wstępnej obróbki. Stężenie azotoksyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena produkcji wolnych rodników w warunkach biologicznych jest ważna dla zrozumienia sygnalizacji regulowanej redoks w zdrowiu i chorobie, ale pomiar tych gatunków jest bardzo trudny ze względu na krótki okres półtrwania gatunków wolnych rodników i ograniczenia techniczne przy powszechnie stosowanych metodach. EPR jest cennym i potężnym narzędziem w biologii redoks, ponieważ jest to jedyna jednoznaczna metoda wykrywania wolnych rodników. W tym projekcie demonstrujemy praktyczne metody EPR do projektowania eksperymentów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez University of Colorado School of Medicine's Dean's Strategic Research Infrastructure award, R01 HL086680-09 i 1R35HL139726-01, do nagrody stypendialnej E.N.G. i UCD CFReT fellowship award (HE). Autorzy dziękują dr Sandrze Eaton i dr Garethowi Eatonowi (University of Denver), dr Geraldowi Rosenowi i dr Josephowi P. Kao (University of Maryland) oraz dr Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) za pomocne dyskusje, a także Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie i Ivy McDermott (University of Colorado Denver) za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLifeTech10566-016pożywka do hodowli komórkowych
Kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
chlorek sodu (NaCl) Fisher Naukowy   BP358-212służy do przygotowania 50 mM buforu soli fosforanowej   wg Sigma aldrish   
fosforan potasu dwuzasadowy (HK2PO4 )Fisher Scientific   BP363-500służy do przygotowania 50 mM buforu soli fosforanowej   wg Sigma aldrish   
fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379służy do przygotowania 50 mM fosforanowego buforu solnego  według Sigma aldrish   
Bufor Krebsa-Henseleita (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Dysmutaza ponadtlenkowa erytrocytów bydła (SOD)Sigma Aldrich  S7571-30KU
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGRozpuszcza się w DMSO
Antymycyna A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGRozpuszcza się w etanolu i przechowuje w szklanych fiolkach (MW stosuje się uśrednioną masę cząsteczkową dla czterech partii)
1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna. HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopiperydyna, 1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido]dichlorek piperydyny ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
Chlorek 1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-4-ylotrimetyloamoniowy . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparyna Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Chlorek difenyliodoniowy Sigma Aldrich43088
Sól mezylanowa deferoksaminySigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
MARKA jednorazowe BLAUBRAND  Mikropipety intraMarkSigma Aldrich708733Kapilary
RURKI FLUOROPOLIMEROWE FRAKCYJNE PTFE
3/16" Średnica zewnętrzna x 1/8" Identyfikator		NORELL1598774A Rurkiteflonowe 
KORKI Z GUMY SILIKONOWEJ DO PROBÓWEK NMR  DO RUR CIENKOŚCIENNYCH O ŚREDNICY ZEWNĘTRZNEJ 4 mm-5 mm (ŚREDNICA WEWNĘTRZNA 3,2 mm DO 4,2 MM) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Stacjonarny spektrometr EPR Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

reaktywne formy tlenudetekcja nadtlenkusondy spinowespektroskopia EPRtemperatura pokojowa77 kelwin wprzechowywanie pr bektkanka p ucnahodowla kom rkowa

Powiązane artykuły