Artykuł metodologiczny

Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu

25.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58471

⸱

26 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Division of Laboratory Animal Resources, University of Kentucky, 3River Hill Ranch

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę produkcji przeciwciał jednodomenowych od alpak, w tym immunizację, pobieranie krwi, izolację komórek B i selekcję.

Streszczenie

W tym manuskrypcie opisano i zademonstrowano metodę immunizacji alpaki oraz wykorzystanie metod biologii molekularnej do produkcji przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu. Wielbłądy, takie jak alpaki i lamy, stały się cennym zasobem dla badań biomedycznych, ponieważ wytwarzają nowy rodzaj przeciwciała opartego wyłącznie na łańcuchach ciężkich, które można wykorzystać do produkcji przeciwciał jednodomenowych. Ponieważ układ odpornościowy jest bardzo elastyczny, przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane przeciwko wielu różnym antygenom białkowym, a nawet różnym konformacjom antygenu, z bardzo wysokim stopniem swoistości. Te cechy, między innymi, sprawiają, że przeciwciała jednodomenowe są nieocenionym narzędziem w badaniach biomedycznych. Podano metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych z alpak. Opisano protokół szczepień, pobierania krwi i izolacji komórek B. Limfocyty B są wykorzystywane do budowy immunizowanej biblioteki, która jest wykorzystywana do selekcji specyficznych przeciwciał jednodomenowych poprzez panoramowanie. Przypuszczalnie specyficzne przeciwciała jednodomenowe uzyskane przez panoramowanie są potwierdzane za pomocą testów pull-down, ELISA lub gel-shift. Powstałe przeciwciała jednodomenowe mogą być następnie używane bezpośrednio lub jako część zmodyfikowanego odczynnika. Zastosowania przeciwciał jednodomenowych i regentów opartych na przeciwciałach jednodomenowych obejmują zastosowania strukturalne, biochemiczne, komórkowe, in vivo i terapeutyczne. Przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane w dużych ilościach jako białka rekombinowane w prokariotycznych systemach ekspresyjnych, oczyszczane i stosowane bezpośrednio lub mogą być modyfikowane tak, aby zawierały specyficzne markery lub znaczniki, które mogą być używane jako reportery w badaniach komórkowych lub w diagnostyce.

Wprowadzenie

Alpaki i inni członkowie rodziny wielbłądowatych stały się popularnym źródłem do generowania przeciwciał do badań biomedycznych1,2,3. Wielbłądowate mają unikalny układ odpornościowy, ponieważ wytwarzają zarówno normalne przeciwciała, jak i przeciwciała tylko łańcucha ciężkiego, które umożliwiają wytwarzanie znacznie mniejszych przeciwciał jednodomenowych, zachowując przy tym wysoką swoistość i wysokie powinowactwo. W ten sposób przeciwciała wielbłądowatych stanowią wszechstronny odczynnik przydatny do różnych celów. Opisano tutaj metodę immunizacji alpaki i wytwarzania jednodomenowych przeciwciał przeciwko różnym antygenom białkowym. Przeciwciała te mogą być wytwarzane u wielbłądowatych w stosunkowo prostym procesie, który wymaga jedynie immunizacji poprzez małe wstrzyknięcia docelowego białka (antygenu) i pobranie krwi4. Następnie, budowa biblioteki, wyświetlanie faga M13 5 i panoramowanie w stosunku do rekombinowanego antygenu6 służy do izolowania i wytwarzania przeciwciał jednodomenowych o pożądanych cechach. Ponieważ proces ten wykorzystuje moc technologii wyświetlania fagów, pięć lub więcej antygenów może być jednocześnie wykorzystywanych na zwierzę, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt i związane z tym koszty.

Typowe dla ssaków przeciwciała lub immunoglobuliny to duże cząsteczki składające się z dwóch typów łańcuchów (2 ciężkie łańcuchy i 2 lekkie łańcuchy), które są połączone ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Przeciwciała te są stosunkowo duże, wykazując masę cząsteczkową ~ 140-190 kDa dla liczniejszych gatunków IgG od ludzi, myszy, kóz i królików. Ze względu na ich wielocząsteczkową strukturę, wysoką masę cząsteczkową i wiązania dwusiarczkowe, immunoglobuliny mogą być dość trudne do wyprodukowania w dużych ilościach, co sprawia, że ich koszt jest wysoki. W latach dziewięćdziesiątych odkryto, że wielbłądowate, do których należą wielbłądy, lamy i alpaki, wytwarzają, oprócz typowej immunoglobuliny typu ssaków, nową formę immunoglobuliny, która jest prostsza w budowie, posiadając tylko ciężkie łańcuchy7. Te unikalne przeciwciała wielbłądowate mają taką samą zdolność do specyficznego wiązania obcych substancji o wysokim powinowactwie, ale składają się tylko z jednego łańcucha białkowego8. Co więcej, przeciwciała wielbłądowate mogą być eksperymentalnie skrócone do jeszcze mniejszej jednostki fragmentu VHH, zwanego również przeciwciałem jednodomenowym9. Ze względu na swój niewielki rozmiar, przeciwciała jednodomenowe są przydatne w szerokim zakresie zastosowań w badaniach biomedycznych i są dostępne w różnych źródłach akademickich i komercyjnych1,10. Wyjątkiem wydaje się być Western blot, ponieważ przeciwciała jednodomenowe są częściej skierowane przeciwko epitopom zależnym od konformacji, które zwykle są tracone w warunkach denaturacji stosowanych w zachodnich blotach.

Ponieważ składają się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego, specyficzne przeciwciała jednodomenowe mogą być łatwo wybierane i łatwo wytwarzane w dużych ilościach jako białka rekombinowane u bakterii. Przeciwciała jednodomenowe mogą być również genetycznie modyfikowane tak, aby zawierały określone markery lub znaczniki, które mogą być używane jako "grupy reporterowe" do diagnozowania chorób11. Ta łatwość manipulacji w połączeniu z elastycznością ich stosowania sprawia, że przeciwciała jednodomenowe są ważnym zasobem dla naukowców na uniwersytetach i w innych miejscach.

Jako część rdzenia wspieranego przez National Institutes of Health, istniejące metody zostały dostosowane do produkcji przeciwciał jednodomenowych z alpak3,4. Alpaki mają znaczące zalety zarówno pod względem łatwości obsługi w porównaniu z większymi członkami rodziny wielbłądowatych, jak i dostępności. Alpaki są powszechnie hodowane na włókno i mięso, dzięki czemu można je pozyskać regionalnie od lokalnych hodowców alpak, których można zidentyfikować za pośrednictwem ich stron internetowych lub stanowych stowarzyszeń hodowców. Dostępne są dwie rasy alpak, Suri i Huacaya. Huacaya są bardziej powszechne i były używane w tym protokole, ale protokół ma ogólne zastosowanie do obu ras, a także szerzej do innych wielbłądowatych.

Protokół

Wszystkie procedury z alpakami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami (2017-2627 i 2018-2925) zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky (IACUC).

1. Wytwarzanie przeciwciał alpaki specyficznych dla antygenu

  1. Obchodzenie się z alpakami i uwagi ogólne
    1. Uzyskanie odpowiedniej zgody instytucjonalnej i/lub regulacyjnej.
    2. Uzyskaj dorosłe alpaki w wieku poniżej 10 lat z oceną kondycji ciała co najmniej 3,0 (skala 1-5)12. Ponieważ są to zwierzęta stadne, trzymaj co najmniej dwa, a najlepiej trzy zwierzęta razem.
      nuta: Samce są zalecane, ponieważ generalnie mają bardziej równomierny temperament i łatwiej się z nimi pracuje.
    3. Sprawdź stan zdrowia zwierząt poprzez badanie weterynaryjne, w tym przegląd diety, warunków mieszkaniowych, szczepień i programów zwalczania pasożytów13. Upewnij się, że zwierzęta są na bieżąco ze szczepieniami odpowiednimi dla lokalnego regionu geograficznego w oparciu o profesjonalne zalecenia weterynaryjne. Opracuj program kontroli ekto- i endopasożytów w porozumieniu z lekarzem weterynarii w oparciu o przegląd historii stada, z którego pochodzi i specyficznych warunków lokalnych13.
    4. Aklimatyzuj się przez co najmniej tydzień, w tym trening w kantarze i narażenie na ograniczenia.
    5. Pobrać próbkę krwi o objętości 4 ml w celu uzyskania surowicy do wykorzystania jako kontrola przed szczepieniem (patrz krok 1.4). Zamrozić surowice i przechowywać w temperaturze -20 °C w 0,5 ml porcji.
      nuta: W tym czasie można pobrać dodatkową krew do pełnej analizy komórek krwi (CBC) w celu monitorowania początkowego stanu zdrowia zwierząt.
  2. Przygotowanie antygenu
    1. Przygotować oczyszczone antygeny białkowe w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (HBS) i stężyć do ≥1 mg/ml. Około 3 mg białka jest potrzebne do pełnego protokołu, w tym immunizacji, płukania i potwierdzenia klonów.
      nuta: Przeciwciała wielbłądowate wykazują wysoką swoistość i selektywność wobec antygenów białkowych, ale na ogół nie nadają się dobrze do białek niestrukturalnych lub antygenów peptydowych, które są na ogół nieustrukturyzowane.
    2. Ustal czystość antygenu, z pożądaną czystością >90%. Wykorzystaj metodę analityczną, taką jak SDS-PAGE.
      ostrożność: Znaczne zanieczyszczenie innymi białkami może prowadzić do problemów podczas selekcji, gdzie przeciwciała jednodomenowe mogą być izolowane do zanieczyszczeń, a nie do białka docelowego.
    3. Przygotować zamrożone porcje antygenu, które zawierają łącznie 100 μg antygenu. Idealne jest 50 μl preparatu o stężeniu 2 mg/ml. 100 μl z 1 mg/ml to najbardziej rozcieńczony roztwór białkowy odpowiedni do immunizacji. Alternatywnie, jeśli antygen nie może zostać poddany zamrożeniu/rozmrożeniu i wiadomo, że jest stabilny w roztworze przez długi czas, można go przechowywać w temperaturze 4 °C.
      nuta: Aby upewnić się, że antygen może zostać poddany cyklowi zamrażania/rozmrażania, należy przetestować 20 μl podwielokrotności antygenu, którą należy przelać do cienkościennej probówki PCR i zatrzaskowo zamrozić w ciekłym azocie. Rozmrozić probówkę, przeprowadzić wirowanie z dużą prędkością i sprawdzić odzysk ilościowy, porównując absorpcję UV/VIS przed i po zamrożeniu lub uruchamiając żel SDS-PAGE. Jeśli jest to wykonalne, antygen powinien być również badany pod kątem zachowania aktywności biologicznej. Jeżeli cykl zamrażania i rozmrażania przebiega pomyślnie, pozostały antygen zamraża się zatrzaskowo w podwielokrotnościach o objętości 100 μl i przechowuje w temperaturze -80 °C. Jeśli wystąpią problemy z cyklem zamrażania/rozmrażania, protokół można powtórzyć z dodatkiem do 20% glicerolu.
  3. immunizacja
    1. Wymieszać do pięciu antygenów, po 200 μg każdy, z adiuwantem w końcowej objętości od 300 do 1000 μl. Adiuwant powinien stanowić ≥50% końcowej objętości, używając wody jako rozcieńczalnika.
      nuta: Jeśli konieczne jest użycie buforu, użyj HEPES, MOPS lub glicyny. pH między 5 a 6 często okazywało się korzystniejsze niż ściśle neutralne. Unikaj jonów wielowartościowych, takich jak fosforan lub cytrynian, ponieważ mogą one powodować krzepnięcie.
    2. Przytnij włosy alpaki za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia, w kształcie półksiężyca wzdłuż podstawy szyi od ramienia do ramienia, aby odsłonić obszary przylegające do węzłów chłonnych łuku.
    3. Trzymając alpakę za szyję, powoli wstrzyknij antygen podskórnie wzdłuż podstawy szyi w pobliżu węzłów chłonnych łuku za pomocą igły 22 G. Wykonać pięć wstrzyknięć w ilości ~200 μL (lub mniejszej) w odległości ~5 cm od siebie.
      nuta: Podczas wstrzykiwań zwierzęta powinny być skrępowane przez drugiego członka personelu. Wstrzykiwanie i krwawienie alpak wymaga ostrożności, ponieważ są one podatne na kopanie, nie tylko od tyłu, ale także z boków. Trzymanie zwierząt blisko siebie, w grupie, podczas zabiegów jest optymalne. Biorąc pod uwagę, że są to zwierzęta stadne, są spokojniejsze w grupie i podczas zabiegów potrzebne jest mniej silne ograniczenie.
    4. Monitorować zwierzęta przez ~20 minut po wstrzyknięciu pod kątem objawów anafilaksji (patrz krok 1.6). Co tydzień należy monitorować miejscowy stan zapalny w miejscach wstrzyknięć, co nie jest oczekiwane w przypadku stosowania zalecanego adiuwanta. Należy upewnić się, że wyciek krwi z miejsca wstrzyknięcia nie jest nadmierny.
    5. Wykonywać pięć kolejnych wstrzyknięć wzmacniających tygodniowo, używając 100 μg każdego antygenu w mieszaninie. Przycinanie włosów w miejscach wstrzyknięć może być wymagane co tydzień, w zależności od pory roku. Jesienią i zimą sierść zwierząt może szybko rosnąć.
  4. Pobieranie krwi
    1. Przypnij i zdezynfekuj miejsce zbiórki wacikami nasączonymi alkoholem.
    2. Delikatnie krępuj zwierzę z szyją trzymaną pionowo i prosto.
      nuta: Zwierzęta można krępować ręcznie, jak pokazano na filmie. Jeśli to możliwe, użycie zsypu dla alpak w celu unieruchomienia alpak podczas krwawienia i wstrzyknięć może ułatwić obsługę. Aby skorzystać ze zsypu dla alpak, alpaki z kantarem są wprowadzane do zsypu i przytrzymywane za pomocą prętów na szyję i pasków z szybkozłączkami. Wersje zsypu na alpaki są dostępne u komercyjnych dostawców.
    3. Wykorzystując projekcję brzuszną wyrostka poprzecznego kręgów jako punkt orientacyjny, zamknij żyłę, wywierając nacisk tylko przyśrodkowo na wyrostek brzuszny.
      nuta: U dorosłych alpak nie ma wyraźnej bruzdy szyjnej. Żyły szyjne są chronione przez brzuszne występy poprzecznych wyrostków kręgowych. Ta gruba skóra (np. 1 cm grubości "płytka bojowa" ponad środkową 1/3 szyi u mężczyzn) i muskulatura szyi utrudniają widzenie lub badanie palpacyjne samej żyły szyjnej. Następnie użycie punktów orientacyjnych kręgów jest najbardziej pomocnym wskaźnikiem lokalizacji szyi.
    4. Włóż igłę pod kątem 45° lekko przyśrodkowo (~szerokość palca) do występu w kierunku środka szyi. Manipuluj igłą, aż zacznie płynąć krew.
      nuta: Żyła szyjna i tętnica szyjna znajdują się blisko siebie. Krew żylna może mieć dość czerwony kolor, ale nadal jest ciemniejsza niż krew tętnicza. Po pobraniu należy uciskać miejsce przez 0,5-1 minutę (lub dłużej, jeśli dostęp do tętnicy szyjnej), aż do zapewnienia hemostazy.
    5. Pobrać 4-10 ml krwi do celów analitycznych. Użyj igły 1.5 cala, 20 G, zwykle w połączeniu ze strzykawką lub probówką do pobierania krwi o odpowiednim rozmiarze. Wykorzystaj lawendowe górne probówki K2EDTA do pobierania pełnej krwi podczas oczyszczania limfocytów. Używaj złotych górnych probówek do separacji surowicy (BD) podczas pobierania krwi do produkcji surowicy.
    6. Pobrać 50-100 ml krwi do celów produkcyjnych. Użyj dodatkowego 12-calowego przedłużacza do infuzji z zestawem do infuzji 19-20 G ze skrzydełkami "motyla".
      nuta: Konfiguracja zestawu przedłużającego umożliwia asystentowi napełnianie wielu probówek do pobierania krwi, dzięki czemu dożylny może skupić się na stabilizacji igły do pobrania. Dodanie zestawu infuzyjnego dostosowuje się do potencjalnego ruchu zwierzęcia (procedura 3-5 minut) i zapewnia operatorom wygodną odległość roboczą.
  5. Monitorowanie układu immunologicznego
    1. Trzy do czterech dni po trzecim i piątym wstrzyknięciu należy wykonać małe próbne krwawienie od każdego zwierzęcia, aby uzyskać surowice do testów. Zamrozić i przechowywać surowice w porcjach o pojemności 0,5 ml. W tym samym czasie należy pobrać dodatkowe próbki krwi w celu monitorowania stanu zdrowia zwierzęcia, jak omówiono powyżej.
    2. Potwierdź obecność przeciwciał specyficznych dla antygenu za pomocą testu ELISA za pomocą surowic uzyskanych z krwawień testowych w punktach czasowych przed uzyskaniem odporności, trzech i pięciu tygodni. Najlepiej jest wykonać ostatnie krwawienie, gdy miano przeciwciał nadal rośnie.
    3. Wygeneruj płytki powinowactwa antygenowego przy użyciu 96-dołkowych płytek poddanych obróbce powierzchniowej. Rozcieńczyć 0,1 μg antygenu w 100 mM buforze węglanu sodu o pH 9,0. Dodać 100 μl roztworu do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Dziesięć rozcieńczeń każdego antygenu bada się dwukrotnie. Przygotowuje się ślepą próbę studzienki kontrolnej, która jest pokryta wyłącznie buforem węglanowym.
    4. Po całonocnej inkubacji odwrócić płytkę, aby usunąć zawartość studzienek i przemyć trzykrotnie 0,1 ml PBS, 0,1% Tween 20 (PBS-T).
    5. Zablokować studzienki, dodając 0,1 ml BSA (5 mg/ml) do PBS-T i inkubując płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Umyć płytkę trzykrotnie za pomocą PBS-T, pipetując roztwór myjący do studzienki, a następnie usuwając roztwór myjący przez odwrócenie płytki.
    7. Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenia po 0,3 ml surowic przedimmunologicznych i immunologicznych w buforze PBS-T, stosując początkowe rozcieńczenie 1/100 i do 1/102 400.
    8. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia do studzienek i pozostawić do inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Wyjmij surowicę z każdej studzienki i przemyj ją trzykrotnie 0,2 ml PBS-T.
    10. Inkubować każdą studzienkę z 0,1 ml sprzężonego z HRP koziego przeciwciała IgG przeciwko lamom kozim w rozcieńczeniu 1:20 000 przez 1 godzinę
      nuta: Mierzona odpowiedź immunologiczna obejmuje zarówno przeciwciała konwencjonalne, jak i tylko oparte na łańcuchach ciężkich, które są obecne w krążeniu w przybliżeniu w równych proporcjach3,14.
    11. Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 0,2 ml PBS-T.
    12. Dodać 100 μl substratu peroksydazy chromogennej do studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej, aż intensywność dwóch najwyższych punktów koncentracji zostanie nasycona, co zwykle trwa 5-10 minut.
    13. Dodaj 100 μl 0,1 M kwasu siarkowego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
    14. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika płytek.
    15. Wykreślić absorbancję jako stężenie funkcyjne.
  6. Monitorowanie alpak i potencjalne powikłania
    1. Zapewnij odpowiednie monitorowanie alpak przez cały czas trwania zabiegu.
      nuta: Oczekuje się, że procedury te nie spowodują znaczących działań niepożądanych. Dobrostan i zdrowie zwierząt powinny być codziennie monitorowane przez personel hodowlany i/lub badawczy podczas karmienia i pojenia. Każde zwierzę z niezłagodzoną naturalną chorobowością wywołaną doświadczalnie lub spontaniczną powinno zostać skierowane do oceny przez służby weterynaryjne z zapewnionym leczeniem (leczeniem), jeśli to konieczne, aż do humanitarnej eutanazji><, jeśli to konieczne. Potencjalne niekorzystne konsekwencje związane z flebotomią to krwawienie, siniaki i krwiaki. Zwierzęta powinny być monitorowane przez 20 minut po pobraniu krwi w celu wykrycia oznak krwawienia. Należy zastosować dodatkowy nacisk na miejsca. Jeśli krwawienie nie ustaje, należy skontaktować się z weterynarzem.
      Inne potencjalne niekorzystne konsekwencje związane z zastrzykami i krwawieniem obejmują powstawanie ziarniniaków i stan zapalny. Powstawanie ziarniniaka nie jest oczekiwane i nie zostało zaobserwowane na Uniwersytecie Kentucky. Może wystąpić zapalenie w miejscu wstrzyknięcia (zaczerwienienie lub obrzęk), które należy zgłosić do lekarza weterynarii. Krwawienie produkcyjne stanowi potencjalnie znaczną objętość krwi, a zwierzęta powinny być monitorowane, aby upewnić się, że są stabilne i aktywne po pobraniu krwi.
      Anafilaksja i reakcje pirogenne to dwie najbardziej prawdopodobne poważne niekorzystne konsekwencje, ale bardzo rzadko są obserwowane. Gdyby do tego doszło, anafilaksja wystąpiłaby wkrótce po wstrzyknięciu antygenu i objawiłaby się wzrostem temperatury w odbycie, osłabieniem, wymiotami, problemami z oddychaniem i/lub biegunką. Temperatura w odbycie może być monitorowana po każdym wstrzyknięciu w celu wykrycia wzrostu temperatury ciała. Jeśli zostaną one rozpoznane, należy natychmiast powiadomić lekarza weterynarii w celu konsultacji. Ponadto powinien być dostępny awaryjny "Crash Kit" (np. epinefryna, kortykosteroidy i leki przeciwhistaminowe) przygotowany w porozumieniu z weterynarzem do leczenia zwierząt podejrzanych o działanie niepożądane.

2. Oczyszczanie limfocytów do budowy biblioteki przeciwciał jednodomenowych

  1. Pobrać 50 ml krwi trzy do pięciu dni po ostatnim wstrzyknięciu (patrz krok 1.4).
    nuta: Szybkie przetwarzanie krwi i izolacja RNA jest ważne dla uzyskania odpowiedniego rozmiaru biblioteki15,3, co jest bardzo ważne dla powodzenia panoramowania.
  2. Rozcieńczyć 15 ml pobranej krwi w 5 ml PBS.
  3. Wykorzystaj probówkę do separacji limfocytów do izolacji limfocytów krwi obwodowej (PBL) przez wirowanie w gradiacji gęstości zgodnie z sugestiami producenta.
    ostrożność: Instrukcje producenta wskazują, że można użyć do 25 ml krwi, ale może to spowodować wysycenie układu i uniemożliwić uzyskanie czystego preparatu limfocytów.
  4. Dodać 5 ml PBS schłodzonego do temperatury 4 °C do PBL.
  5. Wirować przez 20 minut w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć dwa razy, dodając 5 ml PBS wstępnie schłodzonego do temperatury 4 °C do PBL, a następnie odwirować przez 20 minut w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C.
  7. Wyizolować całkowite RNA za pomocą systemu opartego na kolumnie wirowej, zgodnie z instrukcjami producenta. Homogenizować komórki, umieszczając wierzchołki w odpowiednim buforze i nakładając na system rozdrabniania biopolimerów. Użyj odpowiedniej liczby kolumn mini lub maxi w zależności od danych wejściowych komórki.
  8. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy, łącząc 10 μg RNA z mieszaniną 0,1 μg starterów Oligo(dT)12-18.
  9. Wygeneruj bibliotekę bakteriofagów przy użyciu sprawdzonych metod4. Obejmuje to klonowanie za pomocą enzymów restrykcyjnych do wektora wyświetlania faga pMES4, a następnie ekspresję wstawki połączonej z genem III faga nitkowatego w celu wytworzenia roztworu faga.

3. Przesuwanie przeciwciał w jednej domenie

  1. Wytwarzać płytki powinowactwa do antygenu przy użyciu 96-dołkowych płytek poddanych obróbce powierzchniowej. Rozcieńczyć 0,25 μg antygenu w 100 mM buforze węglanu sodu o pH 9,0. Dodać 100 μl tego roztworu do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Pokryć dwie studzienki na antygen. Przygotować ślepą próbę kontrolną, która jest pokryta wyłącznie buforem węglanowym.
    nuta: Płytki mogą być produkowane i przechowywane przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C, jeśli przeprowadzane są wielokrotne rundy selekcji. Ponadto metoda ta wykorzystuje bezpośrednią absorpcję, która nie wymaga znakowania, podczas gdy inne metody wykorzystują biotynylację lub inne rodzaje strategii znakowania.
  2. Inkubuj płytkę przez noc. Odwrócić, aby usunąć zawartość studzienek i przemyć trzykrotnie 0,1 ml PBS-T.
  3. Zablokować studzienki, dodając 0,1 ml BSA (20 mg/ml) do PBS i inkubując płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Umyć płytkę trzy razy PBS-T, a następnie trzy razy PBS. Antygeny mogą być również znakowane kowalencyjnie i stosowane w systemach wychwytywania, takich jak na przykład systemy streptawidyna/biotyna.
  5. Roztwór fagowy (100 μl) należy poddać wstępnej obróbce 100 μl 40 mg/ml BSA w PBS na platformie wibracyjnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Dodać roztwór fagowy do studzienek pokrytych antygenem i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Użyj wielu studzienek, aby zapewnić łącznie 1011 faga dla każdego antygenu.
  7. Wyrzucić niezwiązany przez inwersję, a następnie przemyć studzienki pięć razy 200 μl PBS-T, a następnie pięć razy PBS.
  8. Eluować związany, dodając 0,1 ml 0,25 mg/ml trypsyny do PBS i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie wibracyjnej przy 700 obr./min.
  9. Przenieść roztwór do fiolki zawierającej 5 μl roztworu chlorowodorku 4-benzenesulfonylu (AEBSF) o stężeniu 4 mg/ml w celu wygaszenia aktywności trypsyny.
  10. Hodować fagi TG1 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem aż do OD600 = 0,5.
  11. Dodaj 50 μl eluowanego faga do 3 ml komórek TG1.
  12. Inkubować w temperaturze 37 °C bez wstrząsania przez 30 minut.
  13. Dodać 7 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny, 2% glukozy
    14. .
  14. Wstrząsać przez noc w temperaturze 37 °C.
    nuta: Aby uzyskać najbardziej zróżnicowane przeciwciała jednodomenowe, klony można sekwencjonować, testować pod kątem pożądanych właściwości i wykorzystywać po jednej rundzie panoramowania. Aby uzyskać przeciwciała jednodomenowe o najwyższym powinowactwie, należy zastosować dwie rundy panoramowania.
  15. Bakterie po całonocnym wzroście ułożyć na płytkach agarowych LB uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny, 2% glukozy. Konieczne będzie przetestowanie kilku seryjnych rozcieńczeń, zaczynając od dwóch rozcieńczeń, posiewając 100 μl rozcieńczeń 1/10 000 i 1/100 000.
  16. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
  17. Wybierz kolonie i zaszczep dołki sterylnej 96-dołkowej płytki zawierającej 100 μl 2XYT ze 100 μg/ml ampicyliny, 2% glukozy, 10% v/v glicerolu na studzienkę.
  18. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
  19. Następnego dnia wstrząsać z prędkością 170 obr./min w temperaturze 37 °C przez 60 min.
  20. Usunąć 2 μl pożywki do probówek PCR. Pozostały roztwór można pozostawić na płytce i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  21. Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu starterów odpowiednich dla użytego wektora. W przypadku pMES4 badania przesiewowe PCR klonów z wynikiem dodatnim wykorzystuje startery, które otaczają miejsce klonowania wielokrotnego, to CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC i GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Wykorzystaj warunki cykliczne odpowiednie dla zastosowanej polimerazy, temperaturę wyżarzania 57 °C i 30 cykli.
  22. Przeanalizuj reakcję PCR, uruchamiając 1% (w/v) żel agarozowy. Kolonie, które są dodatnie, mają insercje genów przeciwciał z pojedynczą domeną o wartości ~ 500 pz. Upewnij się, że dodatnie klony stanowią 20-50% próbki.
    nuta: Metoda ta zapewnia środki selekcji i analizy klonów, które można przeprowadzić w większości laboratoriów badawczych. Alternatywnie można zastosować sekwencjonowanie nowej generacji, które zapewnia duże zbiory danych, które umożliwiają analizę statystyczną i porównawczą16.
  23. Zaszczepić dodatnie klony z płytki do świeżych probówek zawierających 7 ml LB ze 100 μg/ml ampicyliny.
  24. Rosnąć z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37 °C.
  25. Wykonaj minipreparację na kulturze, aby uzyskać plazmidowe DNA.
  26. Sekwencjonuj dodatnie klony przy użyciu standardowego startera sekwencjonowania pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC).
  27. Wykonaj analizę obliczeniową na wynikowych sekwencjach przeciwciał z pojedynczą domeną. Upewnij się, że nie ma kodonów stop ani przesunięć ramki.
  28. Sklasyfikuj powstałe sekwencje pod kątem podobieństwa i różnorodności. Sekwencje, które są wielokrotnie identyfikowane, najprawdopodobniej są sekwencjami wiążącymi o wysokim powinowactwie, szczególnie po dwóch rundach selekcji.
  29. Ekspresja przeciwciała z pojedynczą domeną przy użyciu pochodzącego z BL21 szczepu ekspresyjnego cewki E. Wywołać ekspresję poprzez dodanie IPTG, rosnąc przez noc w temperaturze 22 °C.
  30. Oczyść przeciwciało jednodomenowe za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metalu (IMAC).
  31. Walidacja wiązania przeciwciało/antygen w pojedynczej domenie za pomocą testu interakcji bezpośredniej, takiego jak pull-down, natywna elektroforeza żelowa lub ELISA.
  32. Sprawdź wydajność przeciwciała jednodomowego specyficznego dla aplikacji, zgodnie z potrzebami dla konkretnego eksperymentu.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół został wykorzystany do generowania przeciwciał jednodomenowych przeciwko szeregowi antygenów białkowych. Na jedną alpaka wykorzystano pięć antygenów. Monitorowanie odpowiedzi immunologicznej wykazało, że większość antygenów wywoła silną odpowiedź zaczynającą się w trzecim tygodniu (Rycina 1). Pobranie krwi do produkcji i konstrukcja biblioteki po około sześciu tygodniach zapewnia optymalną równowagę w przypadku zwierząt, którym wstrzyknięto wiele antygenów. W przypadku każdego antygenu przeprowadzono dwie rundy panowania, a następnie przesiewano wyizolowane kolonie (Rycina 2). Sekwencjonowanie pozytywnych kolonii pozwoliło zidentyfikować zróżnicowane sekwencje przeciwciał jednodomenowych dla różnych antygenów. Przykładowo, w odniesieniu do antygenu referencyjnego, białka wiążącego maltozę (MBP), wyizolowano trzy unikalne klony (Rycina 3A). Jak często się obserwuje, przeciwciała jednodomenowe wykazują znaczną różnorodność sekwencji i bardzo zmienną długość CDR3 (Rycina 3). Cechy te są szczególnie istotne w oddziaływaniach przeciwciało jednodomenowe/antygen, co widoczne jest w przypadku kompleksu referencyjnego przeciwciało jednodomenowe/CX3CL117 (Rycina 3B).

Większość pełnych sekwencji przeciwciał jednodomenowych może zostać wyekspresjonowana i oczyszczona z wydajnością 1-10 mg/L hodowli (Rysunek 4A). Ze względu na różnorodność długości CDR3, różne przeciwciała jednodomenowe wykazują niewielkie różnice w masie cząsteczkowej. Potwierdzenie bezpośredniego wiązania oraz wydajności specyficznej dla danej aplikacji jest kluczowe. Na przykład, po dwóch rundach selekcji przeciwko Antygenowi B, zidentyfikowano panel przeciwciał jednodomenowych (Rysunek 2). Zidentyfikowano wiele identycznych sekwencji, a następnie przeciwciało jednodomenowe zostało wyprodukowane i oczyszczone. Przetestowano je następnie za pomocą bezpośredniego pull-downu z wykorzystaniem żywicy powinowactwa do antygenu, co wykazało silne wiązanie zależne od dawki (Rysunek 4B). Co istotne, przeciwciało jednodomenowe nie wykazało wiązania z żywicą kontrolną. Dane te wykazują bezpośrednią interakcję wiązania, która jest dobrze dostosowana do wychwytu powinowactwa zarówno w formacie pull-down, jak i ELISA.

Wykres wyników testu ELISA, Absorbancja vs. rozcieńczenie surowicy, Antygen A/B, Przed uodpornieniem/Uodpornione, analiza danych.
Rycina 1Reprezentatywne monitorowanie odpowiedzi immunologicznej w odniesieniu do dwóch różnych antygenów, wykazujące znaczną specyficzną odpowiedź immunologiczną na odrębne antygeny u tego samego zwierzęcia. Wiele antygenów wykazuje silną odpowiedź już trzy tygodnie po rozpoczęciu immunizacji, przy czym większość z nich osiąga maksymalną odpowiedź po sześciu tygodniach. Okres sześciu tygodni pozwala również na dojrzewanie powinowactwa i jest rekomendowanym czasem dla pobrania krwi do produkcji oraz izolacji limfocytów B. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy DNA, żel PCR wykazujący analizę klonów, prążki o wielkości 10-50 bp w celu walidacji genetycznej.
Rysunek 2Potwierdzenie pozytywnych klonów metodą PCR. Startery obejmują MCS wektora pMES4, a pozytywny klon nanociała daje amplikon o długości ~50 bp (oznaczony gwiazdką *). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza struktury białek; dopasowanie sekwencji, trójwymiarowy schemat białka, regiony CDR1-3, bioinformatyka.
Rycina 3Sekwencje swoiste dla antygenu podkreślają różnorodność przeciwciał jednodomenowych alpaki. (A) Dopasowanie wybranych sekwencji przeciwciał jednodomenowych wyizolowanych do MBP do referencyjnego przeciwciała jednodomenowego 4XT1, z zaznaczonymi poniżej regionami szkieletowymi oraz regionami determinującymi komplementarność (Kabat). (BStruktura jednodomenowego przeciwciała alpaki 4XT1 związanego z CX3CL1 (PDB 4XT1), z podkreśleniem kluczowej roli zmiennych pętli CDR w specyficznym wiązaniu antygenu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Wyniki elektroforezy SDS-PAGE wykazujące prążki białkowe; analiza z gradientem stężeń antygenu.
Rysunek 4Oczyszczanie i walidacja przeciwciał jednodomenowych. (A) SDS-PAGE oczyszczonych metodą IMAC przeciwciał jednodomenowych, porównująca różnorodne przeciwciała jednodomenowe. Różnice w masach cząsteczkowych wynikają przede wszystkim z różnej długości pętli CDR3. Obserwowane są również różnice w poziomach ekspresji, przy czym w przypadku mniejszości przeciwciał jednodomenowych odnotowano niską wydajność oczyszczonego białka. (B) Weryfikacja bezpośredniego wiązania za pomocą metody pull-down z wykorzystaniem powinowactwa do antygenu. Obserwuje się silne, zależne od dawki wiązanie przeciwciała jednodomenowego z żywicą sprzężoną z antygenem, czego nie stwierdzono w przypadku żywicy kontrolnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Jak wspomniano, wysokie powinowactwo i swoistość przeciwciał jednodomenowych, w połączeniu z ich łatwą ekspresją i stabilnością, sprawiają, że są one idealnymi odczynnikami do zastosowań w badaniach biomedycznych, jako krytyczne odczynniki biochemiczne, narzędzia diagnostyczne lub środki terapeutyczne18. W przypadku zastosowań komercyjnych należy wziąć pod uwagę pewne kwestie związane z własnością intelektualną. Ponadto przeciwciała jednodomenowe mogą być modyfikowane tak, aby zawierały określone markery lub znaczniki, które mogą być używane jako reportery w testach komórkowych lub w diagnostyce. Kluczem do tych zastosowań jest zdolność do wytwarzania specyficznych przeciwciał jednodomenowych przeciwko antygenom będącym przedmiotem zainteresowania. Opisano tutaj metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych przy użyciu alpak, które wytwarzają silną odpowiedź immunologiczną przeciwko szerokiej gamie antygenów białkowych. Opisano zagadnienia dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami i zgodności z przepisami. Są one kluczowe dla sukcesu w tej części procesu.

Istnieją inne strategie wytwarzania przeciwciał jednodomenowych, które nie wymagają immunizacji, ale zamiast tego wykorzystują biblioteki półsyntetyczne z różnymi systemami do selekcji i iteracyjnej optymalizacji powinowactwa19,20. Jednak zaletą korzystania z bibliotek pochodzących od uodpornionych zwierząt jest możliwość niezawodnego izolowania wysoce wzbogaconych, zróżnicowanych i wysoce powinowactwa przeciwciał jednodomenowych. Ponadto nie tylko obserwuje się znaczące różnice w sekwencji, ale znaczna większość wyizolowanych specyficznych przeciwciał jednodomenowych miała unikalne insercje i delecje, szczególnie w CDR3.

Co więcej, przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane w prostym procesie, który wymaga jedynie niewielkich wstrzyknięć antygenu, a po tym procesie zwierzęta mogą zostać zwrócone do stada. Warto zauważyć, że zwierzę może być swobodnie wykorzystywane do produkcji błonnika, ale musi być wykluczone z wykorzystania jako mięso (łańcuch pokarmowy dla ludzi) ze względu na stosowanie antygenów testowych i adiuwanta niezatwierdzonego przez FDA do produkcji przeciwciał w jednej domenie. Po zakończeniu procedury zwierzęta powinny być monitorowane przez tydzień, poddawane końcowemu badaniu weterynaryjnemu, a następnie mogą zostać zwrócone do swojego gospodarstwa macierzystego lub odpoczywać przez sześć miesięcy przed kolejną rundą produkcji przeciwciał jednodomenowych.

Oświadczenia

Doktorzy Whiteheart i Hersh pracują na Uniwersytecie Kentucky i prowadzą rdzeń w Centrum Medycyny Molekularnej, który wytwarza przeciwciała jednodomenowe u alpak jako opłatę za usługę.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (P30GM103486).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GERBU FAMA adijuwantBiotechnik, Heidelberg, Niemcy 3003,6001
Probówka do pobierania surowicyBecton Dickinson367983
Probówka do pobierania krwiBecton Dickinson366643
Zestaw do pobierania krwi VacutainerBecton Dickinson368652
Maxisorp Płytki immunologiczneNunc439454
BSASigma-AldrichA7906
Przeciwciało IgG przeciwko lamom kozi sprzężone z HRP Bethyl LabsA160-100P
Podłoże peroksydazy chromogennej TMB KPL50-76-03
Czytnik płytekSpectramaxM5Dopuszczalny jest dowolny czytnik obsługujący UV/VIS
Probówka do separacji lifocytów Uni-SepMAXI+NovamedU-17
RNeasy Mini KitQiagen74104
QIAshredderkolumna Qiagen79654
Indeks górny IV odwrotna transkrypcja   Invitrogen18064014
roztwór AEBSFBiosynthA-5440
TG1 wyświetla kompetentne komórkiLucigen60502

Bibliografia

  1. Krah, S., et al. Single-domain antibodies for biomedical applications. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).
  2. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  3. Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).
  4. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  5. Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).
  6. Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits. Journal of Visualized Experiments. (84), e50685(2014).
  7. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  8. Muyldermans, S., et al. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).
  9. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).
  10. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  11. Wang, Y., et al. Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications. International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).
  12. Van Saun, R. J. Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).
  13. Jones, M., Boileau, M. Camelid herd health. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).
  14. Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).
  15. Romao, E., et al. Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies. Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).
  16. Henry, K. A., et al. Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing. Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).
  17. Burg, J. S., et al. Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor. Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).
  18. Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).
  19. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).
  20. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunizacja alpakipobieranie krwiizolacja limfocyt wselekcja metod phage displaytest ELISAanaliza przesuni cia elektroforetycznego gel shiftprodukcja bia ek rekombinowanychekspresja prokariotycznainiekcja antygenu
Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.