Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli poprzez współekspresję chimerycznego RNA, który zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Głównym produktem jest okrągła cząsteczka, która ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

Streszczenie

Wraz z rosnącym zainteresowaniem biologią RNA i wykorzystaniem cząsteczek RNA w zaawansowanych zastosowaniach biotechnologicznych, metody produkcji dużych ilości rekombinowanych RNA są ograniczone. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli w oparciu o koekspresję chimerycznej cząsteczki, która zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Wiroidy to stosunkowo małe, niekodujące, wysoce sparowane koliste RNA, które są zakaźne dla roślin wyższych. Ligaza tRNA rośliny żywicielskiej jest enzymem rekrutowanym przez wiroidy należące do rodziny Avsunviroidae, takie jak utajony wiroid bakłażana (ELVd), w celu pośredniczenia w krążeniu RNA podczas replikacji wiroidu. Chociaż ELVd nie replikuje się w E. coli, prekursor ELVd jest skutecznie transkrybowany przez polimerazę RNA E. coli i przetwarzany przez rybozymy młotkowate osadzone w komórkach bakteryjnych, a powstałe monomery są krążone przez współeksprymowaną ligazę tRNA, osiągając niezwykłe stężenie. Wprowadzenie interesującego RNA do rusztowania ELVd umożliwia produkcję dziesiątek miligramów rekombinowanego RNA na litr kultury bakteryjnej w normalnych warunkach laboratoryjnych. Główna frakcja produktu RNA jest okrągła, co ułatwia oczyszczanie rekombinowanego RNA do wirtualnej jednorodności. W tym protokole komplementarny DNA (cDNA) odpowiadający interesującemu RNA jest wstawiany w określonej pozycji cDNA ELVd w plazmidzie ekspresyjnym, który jest używany wzdłuż plazmidu do koekspresji ligazy tRNA bakłażana do transformacji E. coli. Koekspresja obu cząsteczek pod kontrolą silnych promotorów konstytutywnych prowadzi do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA. Rekombinowany RNA można wyekstrahować z komórek bakteryjnych i oddzielić od większości bakteryjnych RNA, wykorzystując jego okrągłość.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do DNA i białek, protokoły łatwej, wydajnej i opłacalnej produkcji dużych ilości RNA nie są obfite. Jednak badania i przemysł wymagają coraz większych ilości tych biomolekuł do zbadania ich unikalnych właściwości biologicznych¹, lub do wykorzystania w zaawansowanych zastosowaniach biotechnologicznych, w tym jako wysoce specyficznych aptamerów², środki terapeutyczne³, lub selektywne pestycydy⁴. Transkrypcja in vitro i synteza chemiczna są powszechnie stosowane w badaniach do produkcji RNA. Metody te wiążą się jednak z istotnymi ograniczeniami, gdy wymagane są duże ilości produktów. Logiczną alternatywą jest wykorzystanie endogennej maszynerii transkrypcyjnej żywych komórek, a następnie proces oczyszczania w celu oddzielenia interesujących RNA od komórkowych towarzyszy. Podążając za tą strategią, opracowano metody wytwarzania rekombinowanych RNA w komórkach bakteryjnych, takie jak przyjazny dla laboratorium Escherichia coli⁵ lub morsko-fioletowy fototroficzny alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum⁶. Większość metod wytwarzania rekombinowanego RNA u bakterii opiera się na ekspresji natywnego, wysoce stabilnego rusztowania RNA, takiego jak tRNA lub rRNA, w którym wstawiany jest interesujący RNA⁷. Nakłada to konieczność uwolnienia interesującego RNA z cząsteczki chimerycznej, jeśli obecność dodatkowego RNA stanowi problem dla dalszych aplikacji⁸. Inną koncepcją w biotechnologii rekombinacji RNA jest produkcja rekombinowanych kompleksów rybonukleoproteinowych, które same w sobie mogą być pożądanym produktem lub być stosowane jako strategia ochronna w celu zwiększenia stabilności interesującego RNA^9,10. Podobnie, produkcja cyrkularnych RNA została również zasugerowana jako strategia generowania bardziej stabilnych produktów¹¹.

Niedawno opracowaliśmy nową metodę produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA u E. coli, która uczestniczy w trzech z powyższych koncepcji: wstawieniu interesującego RNA do wysoce stabilnego okrągłego rusztowania RNA i koekspresji rekombinowanego RNA z białkiem oddziałującym, aby prawdopodobnie wytworzyć stabilny kompleks rybonukleoproteinowy, który gromadzi się w znacznych ilościach w komórkach bakteryjnych¹². W przeciwieństwie do poprzednich opracowań, użyliśmy rusztowania RNA całkowicie obcego dla E. coli, a mianowicie wiroidu. Wiroidy są bardzo szczególnym rodzajem czynników zakaźnych roślin wyższych, które składają się wyłącznie ze stosunkowo małego (246-401 nt) wysoce sparowanego z zasadami kolistego RNA¹³. Co ciekawe, wiroidy są niekodującymi RNA i bez pomocy własnych białek są w stanie wykonywać złożone cykle zakaźne w zakażonych gospodarzach¹⁴. Cykle te obejmują replikację RNA do RNA w jądrach lub chloroplastach, w zależności od rodziny wiroidów - odpowiednio Pospiviroidae lub Avsunviroidae - przemieszczanie się przez zakażoną roślinę i unikanie odpowiedzi obronnej gospodarza. Wiroidy muszą być zaliczane do najbardziej stabilnych RNA w przyrodzie, w konsekwencji bycia nagim okrągłym RNA i konieczności przetrwania w nieprzyjaznym środowisku komórek zakażonych roślinami. Ta właściwość może sprawić, że wiroidy będą szczególnie przydatne jako rusztowania do stabilizacji rekombinowanego RNA w podejściach biotechnologicznych. Ponadto nowa metoda opiera się na koekspresji rusztowania wiroidowego z oddziałującym białkiem roślinnym. Wiroidy replikują się w mechanizmie toczącego się koła, w którym enzymy gospodarza są rekrutowane w celu katalizowania różnych etapów procesu. Warto zauważyć, że niektóre wiroidy, a dokładniej te, które należą do rodziny Avsunviroidae¹⁵, zawierają rybozymy, które są również zaangażowane w replikację. W zależności od gatunku wiroidu, w transkrypcji wiroidalnych RNA pośredniczy polimeraza RNA gospodarza II lub polimeraza RNA kodowana jądrowo (NEP) w postaci chloroplastu. Przetwarzanie wiroidalnego RNA wydaje się być katalizowane przez RNazę typu III gospodarza, chociaż w wiroidach z rybozymami oligomeryczne RNA pośrednie ulegają samorozszczepieniu podczas replikacji. Wreszcie, powstałe monomery wiroidowe są cyrkularyzowane, w zależności od rodziny wiroidów, przez ligazę DNA gospodarza 1 lub izoformę chloroplastyczną ligazy tRNA^16,17. Ten ostatni enzym bierze udział w ligacji monomerycznych form wiroidów z rodziny Avsunviroidae, takich jak utajony wiroid bakłażana (ELVd)¹⁸.

W trakcie pracy nad analizą sekwencji i wymagań strukturalnych ELVd, które decydują o rozpoznaniu przez ligazę tRNA bakłażana (Solanum melongena L.), stworzyliśmy eksperymentalny system oparty na koekspresji obu cząsteczek w E. coli¹⁹. Zauważyliśmy, że dłuższe niż jednostka transkrypty ELVd skutecznie rozszczepiają się w komórkach E. coli przez osadzone rybozymy młota i że powstałe monomery wiroidowe z końcami 5'-hydroksylowymi i 2',3'-fosfodiestrowymi były skutecznie krążone przez współeksprymowaną ligazę tRNA bakłażana. Co więcej, powstały w ten sposób kolisty wiroidowy RNA osiągnął nieoczekiwanie wysokie stężenie w E. coli, przewyższając stężenie endogennych rRNAs¹². Brak produktów pośrednich replikacji wskazywał na brak amplifikacji RNA do RNA ELVd w tych komórkach bakteryjnych. Co ciekawe, insercja heterologicznych RNA w określonej pozycji cząsteczki wiroidu miała umiarkowany wpływ na akumulację kolistych RNA pochodzących z wiroidów¹². Te obserwacje skłoniły nas do wyobrażenia sobie metody wytwarzania dużych ilości rekombinowanych RNA u bakterii. W tej metodzie cDNA odpowiadające interesującym RNA są wprowadzane do cDNA ELVd, a powstały chimeryczny RNA ulega ekspresji w E. coli przez silny konstytutywny promotor. Aby system działał, E. coli musi zostać przekształcona z plazmidem w celu ekspresji ligazy tRNA bakłażana. Transkrypt pochodzący z ELVd dłuższy niż jednostka jest przetwarzany przez osadzone rybozymy młota, a powstałe monomery z odpowiednimi końcami są rozpoznawane i cyrkularyzowane przez współeksprymowaną ligazę tRNA. W ten sposób interesujący RNA jest wprowadzany do bardzo stabilnego okrągłego rusztowania składającego się z wiroidalnej cząsteczki kolistej. Ten rekombinowany chimeryczny RNA jest najprawdopodobniej dalej stabilizowany wewnątrz komórek E. coli poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego poprzez interakcję z ligazą tRNA. Korzystając z tej metody (patrz protokół poniżej), aptamery RNA, RNA spinki do włosów i inne ustrukturyzowane RNA zostały łatwo wyprodukowane w ilościach kilkudziesięciu miligramów na litr kultury E. coli w normalnych warunkach laboratoryjnych i oczyszczone do jednorodności z wykorzystaniem cyrkularności¹².

Protokół

1. Budowa plazmidu

1. Amplifikować przez PCR (lub PCR z odwrotną transkrypcją, jeśli zaczyna się od matrycy RNA) cDNA odpowiadające RNA będącemu przedmiotem zainteresowania, używając starterów z przedłużeniem 5', aby umożliwić złożenie się w plazmidzie ekspresyjnym. Aby uniknąć niepożądanych mutacji, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności.
   1. Aby wprowadzić cDNA do plazmidu ekspresji za pomocą Gibson assembly²⁰, dodaj następujące rozszerzenia 5' do starterów PCR: do przodu, 5'-tctccccctcccccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; rewers, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X reprezentuje nukleotydy homologiczne do końcowych końców interesującego RNA.
   2. Inkubować przez 30 s w temperaturze 98 °C, następnie 30 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C, a na koniec przedłużyć o 10 minut w temperaturze 72 °C.
2. Trawić 100 ng plazmidu pLELVd-BZB za pomocą 10 U enzymu restrykcyjnego typu IIS Bpi I przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w reakcji 20 μl w probówce o pojemności 0,5 ml w buforze G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA).
   nuta: Wszystkie plazmidy są dostępne na życzenie u autora korespondencyjnego. Bpi I jest odpowiednikiem Bbs I.
3. Oddzielić produkty PCR i trawienia przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 7,2). Barwić żel przez 15 minut, wstrząsając 200 ml 0,5 μg/ml bromku etydyny. Wizualizuj DNA za pomocą transiluminatora UV i przetnij pasma odpowiadające amplifikowanemu cDNA i plazmidowi trawionemu przez Bpi I (2046 pz) za pomocą ostrza skalpela.
   UWAGA: Trawienie Bpi I pLELVd-BZB uwalnia również produkt o stężeniu 528 pz odpowiadający niebiesko-białemu reporterowi LacZ.
4. Eluować DNA z fragmentów żelu za pomocą kolumn z żelem krzemionkowym (zestaw do odzyskiwania DNA żelu w tabeli materiałów) i określić ilościowo stężenie DNA za pomocą analizy spektrofotometrycznej.
5. Przygotuj reakcję montażu Gibsona, używając amplifikowanego cDNA i strawionego plazmidu. Użyj 3-krotnego nadmiaru molowego insert w porównaniu z vector²⁰. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C i oczyszczać produkty reakcji za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym (zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA w tabeli materiałów).
6. Użyj oczyszczonych produktów reakcji montażu Gibsona do elektroportowania kompetentnych komórek E. coli DH5α. Używając kuwet do elektroporacji 1 mm, zastosuj następujące ustawienia: 1 500 V i 5 ms. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w super zoptymalizowanym bulionie z represją katabolityczną (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glukozy, pH 7,0) płynnym podłożu, a następnie rozprowadzić na Luria-Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego), 10 g/L NaCl) agar (1,5%) zawierające 50 μg/ml ampicyliny.
   1. W celu zbadania kolonii odpowiadających przekształconym klonom E. coli, które prawdopodobnie zawierały insert, 15 minut przed posiewem elektroporowanych komórek rozprowadź 30 μl 50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-gal) w dimetyloformamidzie. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
7. Zbierz kilka białych kolonii i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w płynnym podłożu LB. Oczyść plazmidy za pomocą zestawu miniprep (patrz tabela materiałów) i przeanalizuj ich rozmiary za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym w buforze TAE.
8. Wybierz najbardziej prawdopodobny rekombinowany plazmid na podstawie migracji elektroforetycznej w porównaniu z kontrolą pLELVd-BZB. Potwierdź sekwencję wybranego plazmidu przez sekwencjonowanie za pomocą starterów 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' i 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGGGGGAG-3', które otaczają całą kasetę ekspresyjną w pLELVd-BZB.
   nuta: Pamiętaj, że ten plazmid zawiera polilinker o długości 528 pz z markerem LacZ, który jest zastąpiony przez interesujące nas cDNA. Mapowanie restrykcji może pomóc w doborze odpowiednich rekombinowanych plazmidów.

2. Ekspresja RNA

1. Koelektroporować (patrz warunki w ppkt 1.6) wybrany szczep E. coli (E. coli BL21 lub pochodną BL21) z pochodną pLELVd-BZB, która zawiera cDNA odpowiadające RNA będącemu przedmiotem zainteresowania i plazmidowi p15LtRnlSm w celu koekspresji ligazy tRNA bakłażana. Użyj E. coli HT115(DE3), który nie ma RNazy III²¹, do ekspresji RNA z długimi dwuniciowymi regionami.
   Uwaga: Zarówno RNA, które są przedmiotem zainteresowania, jak i mRNA ligazy tRNA są transkrybowane przez polimerazę RNA E. coli. W szczepie E. coli nie jest wymagany lizogen DE3 do ekspresji polimerazy RNA T7, chociaż obecność tego lizogenu nie ma szkodliwych skutków.
2. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37 °C w ciekłym podłożu SOC, bakterie elektroporowane na płytce w pożywce stałej LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Wybierz kolonię i zaszczep 1 l kolby Erlenmeyera z przegrodami 250 ml płynnego podłoża Terrific Bulth (TB) (12 g/l tryptonu, 24 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,4% glicerolu, 0,17 M KH₂PO₄ i 0,72 M K₂HPO₄), zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem przy 180 obrotach na minutę (obr./min). Zbierz bakterie między 12 a 16 godzinami po inokulacji hodowli.

3. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA

1. Do celów analitycznych pobrać 2 ml porcji kultury w żądanych punktach czasowych i odwirować przy 14 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 1 mM EDTA) przez wirowanie.
   1. Dodać jedną objętość (50 μl) mieszaniny fenolu (nasyconego wodą i zrównoważonego w pH 8,0 z Tris-HCl, pH 8,0) i chloroformu. Rozbij komórki przez energiczne wirowanie i oddziel fazę wodną i organiczną przez wirowanie przez 5 minut przy 14 000 x g.
   2. Ostrożnie odzyskaj fazy wodne (górne), które zawierają całkowite bakteryjne RNA.
      Uwaga: Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy.
2. W celach przygotowawczych wlać kulturę do butelki wirówkowej o pojemności 250 ml i odwirowywać komórki o sile 14 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Umyj komórki, ponownie zawieszając je w 30 ml wody. Przenieść do probówki wirówkowej i ponownie odwirować komórki w tych samych warunkach.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu chromatograficznego (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) przez wirowanie.
   nuta: W tym czasie komórki można zamrozić w temperaturze -20 °C, aby kontynuować oczyszczanie w dowolnym innym momencie.
4. Używając świeżego lub rozmrożonego preparatu bakteryjnego, rozbij komórki, dodając 1 objętość (10 ml) fenolu:chloroformu (patrz krok 3.2) i energicznie wirując.
5. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g, odzyskać fazę wodną i ponownie ekstrahować 1 objętością (10 ml) chloroformu w tych samych warunkach.
   nuta: W tym momencie preparat RNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
6. Dalsze oczyszczanie całkowitego bakteryjnego RNA za pomocą chromatografii anionowymiennej. Przefiltrować preparat RNA przez filtr strzykawkowy 45 μm i załadować na 1 ml kolumny dietyloetanoloaminy (DEAE).
   1. Do oczyszczania chromatograficznego należy użyć systemu chromatografii cieczowej o natężeniu przepływu 1 ml/min. Przed załadowaniem próbki należy zrównoważyć kolumnę z 10 ml buforu chromatograficznego (patrz krok 3.3 w celu zapoznania się ze składem).
   2. Załadować próbkę i przemyć kolumnę 10 ml buforu chromatograficznego. Eluować RNA za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) i zebrać 1 ml podwielokrotności.
      Uwaga: RNA szybko eluuje się we wstępnych frakcjach. Kolumna może być ponownie wykorzystana do dalszego oczyszczania. W tym celu należy przemyć kolumnę 10 ml wody i przechowywać w temperaturze 4 °C w 20% etanolu.
7. Ponieważ większa część rekombinowanego RNA gromadzi się w E. coli w postaci kolistej, właściwość ta może być wykorzystana do oczyszczenia do jednorodności¹². Oddziel koliste RNA od liniowych odpowiedników za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (2D PAGE) łączącej warunki niedenaturacyjne i denaturujące (8 M mocznika)^12,22.

4. Analiza RNA

1. Przygotować 5% żel poliakryloamidowy (37,5:1 akryloamid:N,N'-metylenobisakrylamid, stosunek masowy) w buforze TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) zawierającym 8 M mocznika.
2. Wymieszać 20 μl preparatów RNA z 1 objętością (20 μl) buforu ładującego (98% formamidu, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% błękitu bromofenolowego i 0,0025% cyjanolu ksylenowego), inkubować przez 1,5 minuty w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym i schłodzić na lodzie.
3. Załadować próbki do żelu poliakryloamidowego i uruchomić elektroforezę w odpowiednich warunkach w zależności od wymiarów żelu (np. uruchomić żele 140 x 130 x 2 mm przez 2,5 godziny przy napięciu 200 V). Barwić żel przez 15 minut w 0,5 μg/ml bromku etydyny, zmyć wodą i uwidocznić RNA w świetle UV.

Wyniki

Aby wyprodukować rekombinowane RNA u E. coli za pomocą systemu pochodzącego z ELVd¹², interesujący nas RNA jest przeszczepiany do rusztowania RNA ELVd. Ten chimeryczny RNA ulega koekspresji wzdłuż ligazy tRNA bakłażana w E. coli. Po przetworzeniu, rozszczepieniu i okrężeniu, chimeryczny kolisty RNA, z którego wystaje interesujący go RNA, prawdopodobnie tworzy kompleks rybonukleoproteinowy z koeksprymowanym enzymem bakłażana, który osiąga niezwykłe...

Dyskusja

Podczas badań nad wymaganiami dotyczącymi sekwencji i struktury ELVd związanymi z rozpoznawaniem ligazy tRNA bakłażana, zauważyliśmy, że koekspresja obu cząsteczek w E. coli niebędącej gospodarzem doprowadziła do nieoczekiwanej dużej akumulacji wiroidowych form kołowych w komórkach bakteryjnych¹⁹. Zrozumieliśmy, że duża akumulacja wiroidowego RNA w E. coli najprawdopodobniej była konsekwencją koekspresji wysoce stabilnej cząsteczki RNA, takiej jak stosunkowo mały (333 nt), silnie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agaroza	Conda	8010	D1 niska EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Kwas octowy	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Bromek etydyny	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Żel do odzyskiwania DNA	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Koncentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Trypton	Intron Biotechnology	Ba2014
Ekstrakt drożdżowy	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicylina	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-dimetyloformamid	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramfenikol	Duchefa	C 0113.0025
Glicerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF kolumna	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
Ä System chromatografii cieczowej KTAprime plus	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N' -metylenobisakryloamid	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Mocznik	PanReac AppliChem	146392.1211
Kwas borowy	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamid	PanReac AppliChem	A0937,2500
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Cyjanol ksylenowy	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(akryl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G