Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58479

⸱

18 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 3Center for Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Streszczenie

Ostatnie badania nad klamrami całokomórkowymi z neuronów istoty żelowej (SG) dostarczyły dużej ilości informacji na temat mechanizmów rdzeniowych leżących u podstaw transmisji czuciowej, regulacji nocyceptywnej oraz rozwoju przewlekłego bólu lub swędzenia. Implementacja zapisów elektrofizjologicznych wraz z badaniami morfologicznymi opartymi na użyteczności ostrych wycinków rdzenia kręgowego jeszcze bardziej pogłębiła naszą wiedzę na temat właściwości neuronów i składu obwodów lokalnych w SG. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy i praktyczny przewodnik dotyczący przygotowania wycinków rdzenia kręgowego oraz pokazujemy reprezentatywne wyniki zapisu całych komórek i morfologii. Protokół ten pozwala na idealne zachowanie neuronów i może do pewnego stopnia naśladować warunki in vivo. Podsumowując, możliwość uzyskania preparatu in vitro wycinków rdzenia kręgowego umożliwia stabilne zapisy cęgów prądowych i napięciowych, a tym samym może ułatwić szczegółowe badania wewnętrznych właściwości błony, obwodów lokalnych i struktury neuronalnej przy użyciu różnych podejść eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Substantia gelatinosa (SG, blaszka II rogu grzbietowego kręgosłupa) jest bezsprzecznie ważnym centrum przekaźnikowym do przekazywania i regulowania informacji sensorycznych. Składa się z interneuronów pobudzających i hamujących, które otrzymują dane wejściowe z pierwotnych włókien doprowadzających, lokalnych interneuronów i endogennego zstępującego układu hamującego1. W ostatnich dziesięcioleciach rozwój ostrego preparatu do cięcia rdzenia kręgowego i pojawienie się zapisu całokomórkowego patch-clamp umożliwiły różne badania nad wewnętrznymi właściwościami elektrofizjologicznymi i morfologicznymi neuronów SG2,3,4, a także badania obwodów lokalnych w SG5,6. Ponadto, korzystając z preparatu do badania rdzenia kręgowego in vitro, naukowcy mogą interpretować zmiany w pobudliwości neuronów7,8, funkcja kanałów jonowych9,10, oraz aktywności synaptyczne11,12 w różnych stanach patologicznych. Badania te pogłębiły naszą wiedzę na temat roli, jaką neurony SG odgrywają w rozwoju i utrzymywaniu przewlekłego bólu i swędzenia neuropatycznego.

Zasadniczo, kluczowym warunkiem uzyskania przejrzystej wizualizacji somy neuronalnej i idealnego łatania całych komórek za pomocą ostrych wycinków rdzenia kręgowego jest zapewnienie doskonałej jakości wycinków, dzięki czemu można uzyskać zdrowe i łatane neurony. Jednak przygotowanie wycinków rdzenia kręgowego obejmuje kilka etapów, takich jak wykonanie laminektomii brzusznej i usunięcie błony pajęczynówki, które mogą stanowić przeszkodę w uzyskaniu zdrowych plastrów. Chociaż przygotowanie wycinków rdzenia kręgowego nie jest łatwe, wykonywanie nagrań in vitro na wycinkach rdzenia kręgowego ma kilka zalet. W porównaniu z preparatami do hodowli komórkowych, wycinki rdzenia kręgowego mogą częściowo zachować nieodłączne połączenia synaptyczne, które są w fizjologicznie istotnym stanie. Ponadto zapis całej komórki patch-clamp za pomocą wycinków rdzenia kręgowego można połączyć z innymi technikami, takimi jak double patch clamp13,14, badania morfologiczne15,16 i jednokomórkowy RT-PCR17. Dlatego technika ta dostarcza więcej informacji na temat charakterystyki anatomicznej i genetycznej różnorodności w określonym regionie i pozwala na badanie składu obwodów lokalnych.

Tutaj podajemy podstawowy i szczegółowy opis naszej metody przygotowania ostrych wycinków rdzenia kręgowego i pozyskiwania zapisów całokomórkowych krostek z neuronów SG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nanchang (Nanchang, PR China, Ethical No.2017-010). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować stres i ból zwierząt doświadczalnych. Wykonane tu zapisy elektrofizjologiczne prowadzono w temperaturze pokojowej (RT, 22–25 °C).

1. Zwierzęta

  1. Używaj szczurów Sprague-Dawley (w wieku 3-5 tygodni) dowolnej płci. Zwierzęta trzymane są w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i zapewniają im ad libitum dostęp do odpowiedniej ilości pożywienia i wody.

2. Przygotowanie roztworów i materiałów

  1. Rozwiązania
    1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) (w mM): 117 NaCl, 3,6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glukoza, 0,4 kwas askorbinowy i 2 pirogronian sodu. Patrz tabela 1.
    2. Przygotować sacharozę-ACSF (w mM): 240 Sacharoza, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0,4 Kwas askorbinowy i 2 pirogronian sodu. Patrz tabela 2.
    3. Przygotuj roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie K+ (w mM): 130 K-glukonian, 5 KCl, 10 Na 2-fosfokreatyna, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP i 0,3 Li-GTP. Patrz tabela 3.
    4. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie Cs+ (w mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na 2-fosfokreatyna, 5 tetraetyloamonu (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP i 0,3 Li-GTP. Patrz tabela 4.
      Uwaga: Wszystkie roztwory należy przygotować przy użyciu wody destylowanej. ACSF i sacharoza-ACSF powinny być karbonogenowane (mieszanina 95%O2 i 5% CO2 ) przed użyciem w celu utrzymania optymalnego pH około 7,4, a osmolalność tych dwóch roztworów należy dostosować do 300–310 mOsm. Ponieważ kwas askorbinowy może wpływać na kanały wapniowe, środek ten należy pominąć, jeśli chce się rejestrować prądy wapniowe. Osmolalność i pH roztworów wewnątrzkomórkowych należy zmierzyć i dostosować odpowiednio do 290–300 mOsm i 7,2–7,3. Zaleca się filtrowanie roztworów wewnątrzkomórkowych za pomocą filtrów 0,2 μm i przechowywanie roztworów w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Cs+ i TEA stosuje się w roztworze wewnątrzkomórkowym na bazie Cs+ w celu zablokowania kanału potasowego, co sprzyja wykorzystaniu wzmacniacza do utrzymywania potencjału błonowego na stałym poziomie 0 mV podczas rejestrowania hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC).
    5. Przygotuj 0,05% roztwór neurobiotyny 488. Rozpuść 2 mg neurobiotyny 488 w 4 ml roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ i dostosuj osmolalność do 290–300 mOsm, używając wody destylowanej lub sacharozy, jeśli to konieczne.
      Uwaga: 1 mM sacharozy zwiększa osmolarność o 1 mOsm.
    6. Przygotuj 3% agar jako blok na rdzeń kręgowy. Rozpuść 7,5 g agaru w 250 ml oczyszczonej wody w szklanej zlewce, a następnie podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje i będzie klarowny. Zamieszaj roztwór i wlej mieszaninę do plastikowego pudełka o wymiarach 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm w celu zestalenia. Przed użyciem należy przechowywać agar w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) do przetwarzania immunohistochemicznego. Wymieszaj 40 g proszku PFA z ~800 ml podgrzanego (około 60 °C) 1x roztwór PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Powoli dostosuj pH, dodając 1 N kropli NaOH, aż proszek PFA całkowicie się rozpuści. Gdy roztwór stanie się klarowny, dostosuj całkowitą objętość do 1 l za pomocą 1x PBS. W razie potrzeby ponownie dostosuj pH do 7,2–7,4 za pomocą 1 N HCl, a następnie przefiltruj 4% roztwór PFA i przechowuj go w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      Uwaga: PFA jest toksyczny, dlatego należy nosić maski, rękawiczki, a także okulary ochronne. Przeprowadź proces przygotowania 4% PFA w wentylowanym kapturze. Proszek PFA można całkowicie rozpuścić przy pH około 9–10.
  2. Instrumentów
    1. W przypadku typowego systemu elektrofizjologicznego należy użyć mikroskopu pionowego wyposażonego w kontrast różnicowy interferencji w podczerwieni (IR-DIC) i obiektyw zanurzeniowy o wysokiej rozdzielczości, kamerę CCD/CMOS, wzmacniacz patch-clamp, uchwyt na mikropipety i mikromanipulator umożliwiający precyzyjną regulację pozycji pipety. Stolik XY jest również potrzebny do poruszania mikroskopem.
    2. Zamontuj wszystkie urządzenia na stole wibroizolacyjnym otoczonym klatką Faradaya. Podłącz monitor wideo do kamery wideo, aby obserwować neurony i wizualizować mikropipety.
  3. Mikropipety
    1. Wykonaj elektrody rejestrujące z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Typowa rezystancja pipety waha się od 3 do 6 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.
  4. Blok agaru
    1. Przygotuj blok agaru o wymiarach 1,2 cm x 1,5 cm x 2,0 cm. Przytnij blok do kształtów pokazanych w Rysunek 1 zgodnie z wymaganiami.

3. Przygotowanie ostrego odcinka rdzenia kręgowego

Uwaga: Poprzeczne lub przystrzałkowe przekroje rdzenia kręgowego są przygotowywane zgodnie z wcześniejszym opisem18,19,20.

  1. Przed perfuzją przezsercową i ekstrakcją rdzenia kręgowego należy przygotować ~500 ml sacharozy-ACSF zrównoważonej 95%O2 i 5% CO2 i schłodzić roztwór do lodowatości (0–4 °C).
  2. Ostudzić wszystkie narzędzia preparacyjne (np. nożyczki preparacyjne, nożyczki do tęczówki, kleszcze zębate, kleszcze drobnoziarniste, kleszcze zakrzywione) na lodzie. Schemat przygotowania ostrego wycinka rdzenia kręgowego jest pokazany na Rysunek 1.
  3. Perfuzja przezsercowa
    1. Po pojedynczym wstrzyknięciu (dootrzewnowym, i.p.) uretanu (1,5 g/kg) odczekaj 2-3 minuty i oceń głębokość znieczulenia szczurów, testując reakcje szczypania palców u nóg lub ogonów. Po utrzymaniu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia należy umieścić szczura na kruszonym lodzie w pozycji leżącej.
      Uwaga: Aby uzyskać głębokie znieczulenie wystarczające do nieodczuwania bólu podczas torakotomii, postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC.
    2. Wykonaj nacięcie (3–4 cm) przez skórę od wyrostka mieczykowatego do obojczyka, a następnie wykonaj poprzeczne nacięcie poniżej poziomu wyrostka mieczykowatego.
    3. Chwyć i podnieś wyrostek mieczykowaty za pomocą pary zakrzywionych kleszczy, aby całkowicie odsłonić przeponę. Wykonaj poprzeczne nacięcie przez przeponę, a następnie przeciąć klatkę piersiową między mostkiem a żebrami obustronnie, aby otworzyć jamę klatki piersiowej. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby uchwycić wyrostek mieczykowaty, tak aby klatka piersiowa była zamocowana, a serce było wystarczająco odsłonięte.
    4. Delikatnie przytrzymaj serce za pomocą kolejnych zakrzywionych kleszczy, a następnie wprowadź igłę 22 G przez lewą komorę do podstawy łuku aorty.
    5. Natychmiast przetnij prawy przedsionek cienkimi nożyczkami, a następnie rozpocznij perfuzję lodowatego, natlenionego sacharozy-ACSF przez system grawitacyjny.
      Uwaga: Szybka i wystarczająca perfuzja przezsercowa z lodowatą sacharozą-ACSF może ułatwić szybkie chłodzenie rdzenia kręgowego, podczas gdy niskie stężenie sodu i wapnia może pomóc złagodzić toksyczność pobudzającą i chronić funkcje neuronów. Ponadto usunięcie czerwonych krwinek byłoby korzystne dla zmniejszenia barwienia tła biocytyny podczas wykonywania badania morfologicznego. Perfuzja jest uważana za wystarczającą i zaspokojoną, o ile płyn wychodzący z prawego przedsionka jest przezroczysty, a kolor wątroby i łap szczura jest blady. Końcówka igły 22 G powinna być, aby uniknąć pęknięcia serca i łuku aorty.
  4. Wypreparowanie i cięcie rdzenia kręgowego
    1. Wykonaj podłużne nacięcie (5 cm) na skórze grzbietu od ogona do rostralu, a następnie przeciąć klatkę piersiową między kręgosłupem a żebrami po obu stronach w stanie perfuzji.
    2. Wykonaj cięcie na ogonowym końcu kręgosłupa, użyj nożyczek, aby odciąć otaczające tkanki i szybko odizoluj odcinek lędźwiowo-krzyżowy kręgosłupa.
    3. Przenieść odcinek lędźwiowo-krzyżowy do szklanego naczynia zawierającego lodowaty ACSF na bazie sacharozy. Trzymając brzuszną stronę do góry, użyj cienkich nożyczek, aby obustronnie przeciąć szypułkę kręgów i ostrożnie odsłonić rdzeń kręgowy. Wyizolować rdzeń kręgowy o długości 2 cm z powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym (L1–S3) i przenieść odcinek kręgosłupa do innego szklanego naczynia wypełnionego zimną sacharozą-ACSF.
    4. Usuń opony mózgowe i błonę pajęczynówkowo-pajęczynówkową pod mikroskopem preparacyjnym. Odetnij wszystkie korzenie brzuszne i grzbietowe tak szybko, jak to możliwe.
    5. Umieść rdzeń kręgowy na wcześniej przyciętym bloku agaru. Aby przygotować poprzeczne plastry, przymocuj brzuszną stronę rdzenia kręgowego do agaru i pozwól stronie grzbietowej w kierunku ostrza. Aby przygotować plastry przystrzałkowe, przymocuj stronę brzuszną za pomocą superglue do agaru w kierunku pionowym, jak pokazano na Rysunek 1. Następnie zamontuj blok agaru na platformie wibratomu za pomocą superglue. Przygotuj plastry poprzeczne lub przystrzałkowe o grubości 300–500 μm z prędkością posuwu 0,025 mm/s i częstotliwością drgań 80 Hz.
    6. Użyj pipety z plastikowym wykończeniem, aby przenieść plastry na nylonową siatkę w komorze magazynowej zawierającej stale natleniony ACSF w temperaturze 32 °C przez co najmniej 30 minut przed zapisem.
      Uwaga: Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego, zwłaszcza rogu grzbietowego, podczas usuwania opon mózgowych i korzeni rdzeniowych. Rdzeń kręgowy należy przeciąć grzbietowo-brzusznie. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, plastry należy przygotować szybko (w ciągu 15–20 minut). Grubość wycinka kręgosłupa nie powinna przekraczać 600 μm, aby zapewnić widoczność komórek. Ponadto opisana powyżej technika może być wykorzystana do uzyskania poziomych wycinków kręgosłupa.

4. Nagrania z całego ogniwa

  1. Aby przeprowadzić zapisy całokomórkowe patch-clamp z neuronów SG, użyj roztworu wewnątrzkomórkowego opartego na K + w większości przypadków zapisu, podczas gdy roztwór na bazie Cs + stosuje się tylko do nagrywania hamujących prądów postsynaptycznych.
  2. Delikatnie przesuń plasterek rdzenia kręgowego do komory nagrywania, a następnie utrzymuj go za pomocą platynowego drutu w kształcie litery U, mocno przymocowanego nylonowymi gwintami, aby zapewnić optymalną stabilność cięcia. Równomiernie perfunduj plasterek z bąbelkowym ACSF w temperaturze RT przez system grawitacyjny i ustaw szybkość perfuzji na 2-4 ml / min, aby uzyskać wystarczające natlenienie.
  3. Zidentyfikuj obszar SG (półprzezroczyste pasmo) za pomocą soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, wybierz zdrowy neuron, używając obiektywu o wysokiej rozdzielczości jako komórki docelowej i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.
  4. W razie potrzeby napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ lub Cs+, włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu.
  5. Ustaw ostrość mikropipety i zanurz ją w ACSF za pomocą mikromanipulatora, a następnie zastosuj łagodne nadciśnienie (~1 psi przy pomiarze manometrem), aby odsunąć mikropipetę od wszelkich zabrudzeń i zanieczyszczeń.
  6. Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Zwolnij dodatnie ciśnienie, gdy pipeta zbliży się do neuronu, a na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, tworząc gigaseal.
  7. Zmień potencjał utrzymywania na -70 mV, który jest zbliżony do fizjologicznego spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) komórki. Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek.
    Uwaga: Po przeniesieniu plastra do komory nagrywającej należy zapewnić stałą perfuzję przez co najmniej 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni plastra. Warto zauważyć, że zdolność do rozróżniania zdrowych i niezdrowych/martwych neuronów ma ogromne znaczenie dla dobrego uszczelnienia i stabilnego zapisu. Niezdrowy/martwy neuron ma spuchnięty lub skurczony wygląd, wraz z widocznym dużym jądrem, podczas gdy zdrowy neuron charakteryzuje się trójwymiarowym (3D) kształtem z jasną i gładką błoną, a jego jądro jest niewidoczne. Aby uzyskać konfigurację całego ogniwa, w razie potrzeby należy krok po kroku kompensować szybką lub wolną pojemność. W RT potencjał złącza cieczy oblicza się na 15,1–15,2 mV i 4,3–4,4 mV odpowiednio w roztworze wewnątrzkomórkowym opartym na K+ i Cs+. W naszych badaniach zarejestrowane dane nie zostały skorygowane o potencjał złącza cieczy.
  8. Zapisy wewnętrznych właściwości błony
    1. Rejestruj pasywne właściwości membrany wewnętrznej: Rejestruj RMP natychmiast (w ciągu 20 s) po włamaniu. Określ rezystancję wejściową neuronów, mierząc odpowiedź napięciową na prąd depolaryzujący (10 pA, 500 ms) przy RMP w trybie cęgów prądowych.
    2. Zapisz właściwości wypalania: Przetestuj wzorzec wypalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii 1 s depolaryzujących impulsów prądu (25–150 pA z przyrostem 25 pA) przy RMP. Zmierz próg, amplitudę i połowę szerokości pojedynczego potencjału czynnościowego w trybie offline.
    3. Rejestruj prąd podprogowy: Aby ocenić somatyczne prądy podprogowe, utrzymuj potencjał membrany na poziomie -50 mV w trybie cęgów napięciowych. Następnie zastosuj serię hiperpolaryzujących impulsów napięcia o czasie trwania 1 s od -60 mV do -120 mV, z redukcją o 10 mV.
    4. Rejestruj pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC): Rejestruj EPSC za pomocą roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ w trybie zacisku napięcia przy potencjale podtrzymania -70 mV.
    5. Nagrywaj IPSC: Zastosuj rozwiązanie wewnątrzkomórkowe oparte na Cs+ do rejestrowania IPSC. Po ustaleniu konfiguracji całego ogniwa utrzymuj potencjał błony na poziomie -70 mV przez ~5 minut, a następnie stopniowo zmieniaj potencjał utrzymywania na 0 mV. Poczekaj kilka minut na stabilizację, a następnie rozpocznij nagrywanie zdarzeń IPSC.
      Uwaga: Do dalszych badań powinny być wybierane tylko neurony o RMP mniejszym niż -50 mV i wykazujące przeregulowanie. Rezystancje szeregowe w naszym badaniu wynoszą zazwyczaj 10-30 MΩ i zapis powinien zostać wykluczony, gdy rezystancja szeregowa zmieni się o więcej niż 20%. EPSC można potwierdzić za pomocą kąpieli 50 μM APV i 20 μM CNQX, podczas gdy IPSC można potwierdzić za pomocą 10 μM bicukuliny i 1 μM strychniny.

5. Badanie morfologiczne

  1. Do eksperymentów morfologicznych należy użyć roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ zawierającego 0,05% neurobiotyny 488.
  2. Po utrzymaniu stabilnego zapisu elektrofizjologicznego przez co najmniej 20 minut, powoli wyjmij mikropipetę w kierunku do góry, aby umożliwić ponowne uszczelnienie błony komórkowej i przeniesienie wycinka rdzenia kręgowego do pojemnika wypełnionego 4% PFA. Utrwal plastry w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4°C przez noc.
  3. Opłucz plastry w PBS, a następnie zanurz je w 50% etanolu na 30 minut. Po kolejnych trzech myciach w PBS zamontuj plastry w ich pierwotnej grubości na szkiełkach z podłożem montażowym.
  4. Użyj mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) do akwizycji obrazu i neuronalnej rekonstrukcji 3D. Skanuj neurony przez soczewkę 20X ze stosem z osią Z 1,5 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ostre skrawki rdzenia kręgowego przygotowano zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Po pocięciu i regeneracji skrawki rdzenia kręgowego przeniesiono do komory rejestracyjnej. Zdrowe neurony zidentyfikowano na podstawie wyglądu somy, wykorzystując mikroskopię IR-DIC. Następnie potencjały czynnościowe neuronów SG wywoływano za pomocą serii depolaryzujących impulsów prądowych (trwających 1 s), utrzymując neurony w potencjale spoczynkowym (RMP). Jak po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten szczegółowo opisuje etapy przygotowania wycinków rdzenia kręgowego, które z powodzeniem zastosowaliśmy podczas wykonywania eksperymentów z klamrą całokomórkową na neuronach SG 18,19,20,21. Wdrażając tę metodę, niedawno informowaliśmy, że minocyklina, druga generacja tetracykliny, może znacznie zwiększyć hamujące przekaźnictwo synaptyczne poprzez mechanizm presynaptyczny w neuronach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81560198, 31660289).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigmaS7653Służy do przygotowania ACSF i PBS
KClSigma60130Służy do przygotowania wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie ACSF, sacharozy-ACSF i K+
NaH2PO4· 2H2OSigma71500Służy do przygotowania ACSF, sacharozy-ACSF i PBS
CaCl2· 2H2OSigmaC5080Stosowany do przygotowania ACSF i sacharozy-ACSF
MgCl2· 6H2OSigmaM2670Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
NaHCO3SigmaS5761Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
D-GlucoseSigmaG7021Używany do wytwarzania ACSF
Kwas askorbinowySigmaP5280Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
Pirogronian soduSigmaA7631Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
SacharozaSigmaS7903Używany do przygotowania sacharozy-ACSF
K-glukonianWako169-11835Używany do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+
Na2-FosfokreatynaSigmaP1937Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
EGTASigma E3889Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
HEPESSigmaH4034Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
Mg-ATPSigmaA9187Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
Li-GTPSigmaG5884Służy do przygotowania roztwór wewnątrzkomórkowy
CsMeSO4SigmaC1426Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+
CsClSigmaC3011Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+
TEA-ClSigmaT2265Służy do przygotowania wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie Cs+ roztwór
Neurobiotyna 488WektorSP-11450,05% neurobiotyna 488 może być stosowana do badań morfologicznych
W naszym protokole zastosowano 3% blok agarowyAgarSigmaA7002
ParaformaldehydSigmaP61484% paraformaldehydu zastosowano do przetwarzania immunohistochemicznego
Na2HPO4Hengxing Chemical Odczynnikiużywane do przygotowania PBS
Mount Coverslipping MediumPolyscience18606
UrethanNational Institute for Food and Drug Control301912281,5 g/kg, i.p.
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision InstrumentsTW150F-41,5 mm OD, 1,12 mm ID
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-97Służy do przygotowania mikropipet
VibratomeLeicaVT1000S
Stół do izolacji drgańTechnical Manufacturing Corporation63544
KameraCCD na podczerwieńDage-MITIR-1000
Wzmacniacz krosowyHEKAEPC-10
MikromanipulatorSutter InstrumentMP-285
Stolik X-YBurleighGIBRALTAR X-Y
Mikroskop pionowyOlympusBX51WI
OsmometrZaawansowanyFISKE 210
Mettler Mikroskop ToledoFE20
ConfocolZeissLSM 700
3% miernik PH

Bibliografia

  1. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  2. Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
  3. Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
  4. Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
  5. Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
  6. Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
  7. Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
  8. Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25(2014).
  9. Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
  10. Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
  11. Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
  12. Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
  13. Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
  14. Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
  15. Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
  16. Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
  17. Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
  18. Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
  19. Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
  20. Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
  21. Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
  22. Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  23. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
  24. Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
  25. Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
  26. Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
  27. Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
  28. Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).
  29. Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
  33. Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
  34. Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
  35. Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ci cie w wibratomierejestracja elektrofizjologicznaprzygotowanie bloku agarowegoroztw r ACSF z sacharozw a ciwo ci b ony neuronalnejanaliza lokalnych obwod w
Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.