Method Article

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

DOI:

10.3791/58481

⸱

November 17th, 2018

 ,  , 
1The Peter Gorer Department of Immunobiology, King's College London, 2The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota jelitowa ma decydujący wpływ na zdrowie człowieka. Dysbioza mikrobiologiczna jest związana z wieloma powszechnymi immunopatologiami, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit, astma i zapalenie stawów. W związku z tym kluczowe znaczenie ma zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wzajemnych oddziaływań między mikrobiotą a układem odpornościowym. Podawanie antybiotyków, wspomagając usuwanie patogenów, wywołuje również drastyczne zmiany w wielkości i składzie społeczności bakteryjnych jelit, co może mieć wpływ na zdrowie człowieka. Antybiotykoterapia u myszy podsumowuje wpływ i długoterminowe zmiany w mikrobiocie ludzkiej u pacjentów leczonych antybiotykami oraz umożliwia badanie mechanistycznych powiązań między zmianami w zbiorowiskach drobnoustrojów a funkcją komórek odpornościowych. Chociaż opisano kilka metod antybiotykoterapii myszy, niektóre z nich wywołują poważne odwodnienie i utratę wagi, co komplikuje interpretację danych. W tym miejscu udostępniamy dwa protokoły doustnego podawania antybiotyków, które można stosować do długotrwałego leczenia myszy bez wywoływania znacznej utraty wagi. Protokoły te wykorzystują kombinację antybiotyków, które są ukierunkowane zarówno na bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne i mogą być dostarczane ad libitum w wodzie pitnej lub przez zgłębnik doustny. Ponadto opisano metodę ilościowego oznaczania gęstości drobnoustrojów w próbkach kału metodą qPCR, która może być wykorzystana do walidacji skuteczności antybiotykoterapii. Połączenie tych podejść zapewnia wiarygodną metodologię manipulacji mikrobiotą jelitową i badania skutków antybiotykoterapii u myszy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa przewodu pokarmowego ssaków jest unikalnym środowiskiem skolonizowanym przez wysoce złożoną mieszaninę mikroorganizmów, które nawiązują wzajemną relację z gospodarzem. System obronny błony śluzowej jelit składa się z warstwy nabłonkowej i mnóstwa komórek odpornościowych, które ograniczają komensale w jelicie, zachowując jednocześnie ich liczbę i różnorodność. I odwrotnie, organizmy komensalne są niezbędne do rozwoju w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego. Podczas gdy interakcje między bakteriami gospodarza i komensalnymi są zwykle korzystne, staje się coraz bardziej oczywiste, że rozregulowane wzajemne oddziaływanie układu odpornościowego i mikrobioty może sprzyjać rozwojowi przewlekłych chorób zapalnych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, zapalenie stawów lub astma1,2.

Mikrobiota jelitowa może być zmieniona przez różne czynniki, ale być może najbardziej drastyczne zmiany są wywoływane przez leczenie antybiotykami, które poważnie zmienia zarówno wielkość, jak i skład społeczności bakteryjnych3,4. Chociaż korzyści płynące ze stosowania antybiotyków w leczeniu zakażeń są niepodważalne, zmiany mikrobioty wywołane ekspozycją na antybiotyki u ludzi mogą również modyfikować obronę immunologiczną, co może prowadzić do szkodliwych skutków dla zdrowia. Na przykład antybiotykoterapia u ludzi wiąże się ze zwiększonym ryzykiem biegunki wywołanej przez Clostridium difficile, astmy i niektórych rodzajów raka3. Antybiotykoterapia u myszy podsumowuje wpływ i długoterminowe zmiany stwierdzone w społecznościach jelitowych pacjentów leczonych antybiotykami i umożliwiła zbadanie mechanistycznych powiązań między zmianami w społecznościach drobnoustrojów a funkcją komórek odpornościowych. Jednak kilka doniesień wykazało, że podawanie antybiotyków do wody pitnej ad libitum powoduje bardzo zauważalną utratę wagi, ponieważ myszy powstrzymują się od picia wody, prawdopodobnie z powodu jej nieprzyjemnego smaku5,6. Tak więc w tych modelach ciężkie odwodnienie towarzyszące doustnemu podawaniu antybiotyków może komplikować interpretację eksperymentów mających na celu określenie wpływu antybiotykoterapii na funkcjonowanie komórek odpornościowych.

Kilka podejść może być użytych do zbadania wielkości i składu społeczności mikrobiologicznych w przedziale jelitowym7. Technologie sekwencjonowania nowej generacji dostarczyły bezcennych danych na ten temat8, jednak metody te są stosunkowo drogie i wymagają specjalistycznych analiz bioinformatycznych w celu interpretacji danych. Z drugiej strony, tradycyjne metody hodowli mikrobiologicznej pozwalają na wykrycie gatunków bakterii, ale mają niską czułość, a duża część bakterii komensalnych (zwłaszcza beztlenowców) jest bardzo trudna lub niemożliwa do wyhodowania przy użyciu obecnie dostępnych metod8. Ilościowe techniki łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) są coraz częściej stosowane do ilościowego oznaczania i identyfikacji gatunków bakterii kałowych, ponieważ zapewniają szybki i wiarygodny, niezależny od hodowli pomiar całkowitego obciążenia mikrobiologicznego. W związku z tym metody qPCR okazały się przydatne do badania zmian mikrobioty związanych z wiekiem lub progresją kilku chorób, w tym nieswoistego zapalenia jelit9,10. W związku z tym metody qPCR zapewniają szybkie i opłacalne podejście do walidacji wpływu różnych metod leczenia (w tym antybiotyków) na obciążenie bakteriami kałowymi i skład mikrobioty10,11,12.

Tutaj prezentujemy szczegółowy opis krok po kroku dwóch odrębnych protokołów doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA, przygotowywania standardów i kwantyfikacji bakterii w próbkach kału za pomocą qPCR. Protokoły te stanowią wiarygodną metodę manipulowania mikrobiotą jelitową u myszy oraz badania wpływu antybiotykoterapii na homeostazę jelitową i chorobę

.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu 6-8 tygodniowych myszy typu dzikiego (C57BL6/J) utrzymywanych w obiekcie wolnym od patogenów (SPF). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez King's College London i Francis Crick Institute, Animal Welfare and Ethical Review Body oraz brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury na zwierzętach upewnij się, że odpowiednie pozwolenia zostały uzyskane za pośrednictwem lokalnej instytucji/organizacji.

1. Podawanie antybiotyków

UWAGA: Dostępne są dwie alternatywne metody leczenia antybiotykami: doustne podawanie przez zgłębnik (krok 1.1) i podawanie antybiotyków przez wodę pitną (krok 1.2).

  1. Zgłębnik oralny
    1. Przygotować zapasy poszczególnych antybiotyków, rozpuszczając je w autoklalawowanej wodzie w następujących stężeniach: ampicylina w stężeniu 100 mg/ml, gentamycyna w stężeniu 100 mg/ml, neomycyna w stężeniu 100 mg/ml, metronidazol w stężeniu 10 mg/ml i wankomycyna w stężeniu 100 mg/ml. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,45 μm. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj koktajl antybiotyków, mieszając przygotowane powyżej buliony. Na objętość 1 ml wymieszać 50 μl ampicyliny (5 mg/ml wersja ostateczna), 50 μl gentamycyny (5 mg/ml wersja ostateczna), 50 μl neomycyny (5 mg/ml wersja ostateczna), 500 μl metronidazolu (5 mg/ml wersja ostateczna), 25 μl wankomycyny (2,5 mg/ml wersja ostateczna) i 325 μl wody. Przygotuj koktajl na świeżo przed użyciem.
    3. Załaduj mieszaninę antybiotyków do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i zamocuj odpowiednią igłę do pomiaru (20 G dla myszy 15-20 g), eliminując wszelkie pęcherzyki.
    4. Myszy z głębnikiem z 200 μl mieszanki antybiotyków.
      1. Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy, rozciągnij głowę i szyję, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku tylnej części gardła. Następnie delikatnie przełóż go do przełyku i wstrzyknij 200 μl roztworu.
    5. Podawaj koktajl antybiotykowy raz dziennie przez czas trwania eksperymentu.
  2. Antybiotyki w wodzie pitnej
    UWAGA: Uważnie monitoruj masę ciała myszy codziennie przez pierwsze dwa tygodnie podawania antybiotyku w wodzie do picia.
    1. Przygotuj koktajl antybiotyków, rozpuszczając w 1 l autoklawowanej wody: 1 g ampicyliny (1 g/l końcowy), 1 g neomycyny (1 g/l końcowy), 1 g metronidazolu (1 g/l końcowy), 0,5 g wankomycyny (0,5 g/l końcowy) i 8 saszetek (0,75 g każda) sztucznego słodzika (60 g/l końcowy). Wstrząsaj aż do rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Słodzik jest dodawany, aby ukryć smak antybiotyków i zapobiec odwodnieniu myszy. Chociaż kilka marek słodzików może działać, końcowe wymagane stężenie może być różne dla każdej konkretnej marki.
    2. Wlej koktajl antybiotykowy do butelki z wodą (~100 ml / butelkę) i umieść butelkę na klatce dla myszy.
      UWAGA: Używaj brązowych butelek lub przykryj butelki folią, aby chronić antybiotyki przed światłem.
    3. Zastąp koktajl antybiotykowy świeżym bulionem dwa razy w tygodniu na czas trwania eksperymentu.

2. Pobieranie próbek kału z kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego

  1. Zważyć i oznaczyć autoklawowane probówki o pojemności 2 ml do pobrania próbki.
  2. W celu pobrania świeżych próbek kału umieść każdą mysz w ograniczniku i zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytu do probówki zbiorczej.
    UWAGA: Próbki można również uzyskać, umieszczając myszy w czystej autoklawowanej klatce i pobierając próbki kału za pomocą czystych, wysterylizowanych kleszczy.
  3. Poddaj myszy eutanazji z uduszeniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.
  4. Połóż tuszę myszy z całkowicie odsłoniętym brzuchem i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.
  5. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej, aby odsłonić otrzewną bez uszkadzania jakichkolwiek tkanek wewnętrznych. Podnieś otrzewną i wykonaj nacięcie, aby odsłonić jelita.
  6. Usuń jelita (od okrężnicy do żołądka) za pomocą kleszczy i nożyczek i umieść je na sterylnej szalce Petriego.
  7. Ostrożnie użyj kleszczy, aby odsunąć jelito cienkie (SI) od tętnic krezkowych i tłuszczu. Rozszerz jelito i umieść je na czystej chusteczce laboratoryjnej.
  8. Za pomocą linijki zmierz i odetnij 4 cm dystalnego odcinka jelita krętego SI (najbliższa część jelita ślepego). Odetnij i wyrzuć 1 cm jelita proksymalnego do jelita ślepego. Pozostanie 3 cm porcja jelita krętego, która posłuży do zebrania bakterii jelitowych.
  9. Przytrzymaj część jelita krętego (3 cm) nad sterylną probówką o pojemności 2 ml. Zebrać zawartość jelita, bezpośrednio wytłaczając jelito i umieszczając próbkę w probówce. Ta próbka będzie zawierała bakterie z zawartości jelita krętego.
  10. Przygotować strzykawkę o pojemności 20 ml z zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przepłukać część jelita krętego (wyrzucić przepływ).
  11. Umieść część jelita krętego na czystym ręczniku papierowym i otwórz ją wzdłuż nożyczkami.
  12. Zeskrob wnętrze ściany jelita krętego skalpelem.
  13. Zbierz wszelkie bakterie na skalpelu, myjąc skalpel 1 ml PBS nad czystą probówką wirówkową. Wirować w temperaturze 8 000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie i wyrzucić supernatant. Ta próbka będzie zawierać bakterie ze ściany jelita krętego.
    UWAGA: Próbki kału z kału, jelita krętego i ściany można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  14. Zważyć probówki zawierające próbki na podstawie zawartości kału i jelita krętego i odjąć masę od pustych probówek (z kroku 2.1), aby uzyskać masę kału w każdej próbce.
  15. Ekstrakcja bakteryjnego DNA z kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego przy użyciu dostępnych na rynku zestawów. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Kwantyfikacja mikrobioty jelitowej metodą qPCR

UWAGA: Ta procedura obejmuje generowanie wzorca (krok 3.1) oraz metodę konfiguracji qPCR dla próbek standardowych i kałowych (krok 3.2)

  1. Opracowanie wzorca do qPCR
    1. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do amplifikacji genu 16S rRNA z genomowego DNA wyekstrahowanego z kultury bakteryjnej przy użyciu odczynników13 i warunków PCR wyszczególnionych w Tabeli 1.
    2. Uruchom produkt PCR na 1,5% żelu agarozowym i oczyść pasmo DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA.
    3. Związać oczyszczony fragment DNA za pomocą zestawu do klonowania (patrz tabela materiałów, użyć wektora zawierającego markery oporności na antybiotyki i fuzję genu β-galaktozydazy (LacZ) w celu selekcji niebiesko-białej kolonii) i przekształcić E. coli kompetentną dla DH10 zgodnie z instrukcjami producenta. Przemiana płytki na płytki agarowe Ampicillin (100 μg/ml), X-gal (20 μg/mL) Luria Bertani (LB) (10 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar). Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
    4. Wybierz pojedynczą dodatnią (białą) kolonię z tabliczki. Zaszczepić go w 5 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
    5. Z kultury O/N wyizolować i oczyścić plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do minipreparatu zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie zsekwencjonować wstawkę plazmidu, aby upewnić się, że plazmid zawiera tylko jedną kopię genu 16S rRNA i określić jego długość w parach zasad (bp).
    6. Linearyzuj plazmid enzymem restrykcyjnym, który przecina plazmid tylko raz.
    7. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
    8. Oznaczyć stężenie plazmidu, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
    9. Oblicz liczbę kopii plazmidu/μl próbki, korzystając z następującego wzoru14:
      liczba kopii = (ilość * 6.022 × 1023) / (długość * 1 ×10 9 * 650)
      gdzie ilość jest stężeniem DNA otrzymanym w kroku 3.1.8 (w ng/μl); a długość to całkowita długość plazmidu (z wstawką) w BP. Ilość egzemplarzy będzie uzyskiwana w egzemplarzach/μL.
      UWAGA: Istnieją narzędzia online oparte na powyższym wzorze, które umożliwiają łatwe obliczenie liczby kopii plazmidu.
    10. Porcję i przechowywać wzorzec w razie potrzeby w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Konfiguracja qPCR dla próbek standardowych i kału
    1. Rozmrozić na lodzie wzorzec qPCR (z kroku 3.1.10), próbki kału, DNA (z kroku 2.15) i odczynniki qPCR (z dostępnego na rynku zestawu).
      UWAGA: odczynniki qPCR użyte w tym przykładzie obejmują mieszaninę reakcyjną SYBR Green qPCR oraz startery do przodu i do tyłu (Tabela 2).
    2. Rozcieńczyć wzorzec w sterylnej wodzie wolnej od DNA w zakresie od 107 do 102 kopii/μl (np. 1/5 seryjnych rozcieńczeń od 107 do 6,4 x 102 kopii/μL). Rozcieńczyć próbkę kału DNA do 1/2, 1/5, 1/10.
    3. Przeprowadzić reakcję mieszaniny wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus 1 (tabela 2).
    4. Zmieszać 30 μl mieszanki wzorcowej i 5 μl matrycy (wzorcowej, próbki lub wody do kontroli ujemnej)
    5. Dodaj 10 μl tej mieszanki do każdego dołka w 384-dołkowej płytce optycznej qPCR. Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
    6. Uszczelnić miejsce qPCR, krótko odwirować i załadować płytkę do maszyny qPCR zaprogramowanej w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 20 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.
    7. Uzyskaj wartości CT dla wzorca i próbek.
    8. Wygeneruj krzywą standardową, wykreślając wartości CT dla wzorców w funkcji logarytmu liczby kopii plazmidu (zgodnie z obliczeniami w kroku 3.1.9). Wykonaj regresję liniową krzywej standardowej.
    9. Obliczyć liczbę kopii 16S rDNA dla próbek kału poprzez interpolację wartości CT (uzyskanych w kroku 3.2.2) na krzywej standardowej.
      UWAGA: Liczbę kopii 16S rDNA dla każdej próbki należy skorygować, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia próbki (przygotowany w kroku 3.2.2), końcową objętość kwasów nukleinowych, które zostały wymyte (w kroku 2.15) oraz ilość próbki kału (obliczoną w kroku 2.14) w celu uzyskania kopii genów na gram kału.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj oferujemy dwa alternatywne protokoły doustnego leczenia myszami antybiotykami. Rysunek 1 pokazuje procentowy udział masy ciała (w stosunku do pierwotnej wagi podstawowej dla każdego zwierzęcia) u myszy leczonych antybiotykami albo przez doustne zgłębnik (czerwony), albo w wodzie pitnej (niebieski) przez 10 kolejnych dni. Nie stwierdzono zauważalnej utraty wagi u myszy, które otrzymują antybiotyki przez zgłębnik doustny. Jednakże, gdy myszy są leczone antybiotykami ad libitum w wodzie pitnej, tracą na wadze (~10%) w ciągu pierwszych kilku dni po podaniu antybiotyku, ale następnie odzyskują normalny przyrost masy ciała (Rysunek 1). Niemniej jednak około 5-10% myszy otrzymujących antybiotyki w wodzie pitnej może osiągnąć >20% utratę masy ciała w ciągu pierwszego tygodnia leczenia, w którym to przypadku są poddawane eutanazji.

Kwantyfikacja bakterii w próbkach kału wymaga użycia odpowiedniej krzywej standardowej, którą uzyskuje się poprzez wykreślenie logarytmu liczby kopii dla wzorca (obliczonego w kroku 3.2.2) w porównaniu z wartościami CT uzyskanymi z qPCR (krok 3.2.7). Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny przykład krzywej standardowej, która spełnia kryteria wydajności krzywej standardowej z wartością R2 0,99827, nachyleniem -3,09 i wydajnością ((-1 + 10^(-1/nachylenie))*100) wynoszącą 110%. Preferowane są wartości R2 wynoszące 0,99 i skuteczność PCR w zakresie od 90 do 110%. W zakresie liniowym równanie analizy regresji umożliwia ilościowe określenie obfitości 16S rDNA w próbkach kału. Rysunek 2B pokazuje liczbę kopii 16S rDNA w stolcu kałowym, zawartość SI i ścianę SI. W Rysunek 2B dane są pokazane jako kopie 16S rDNA/g próbki kału dla kału i zawartości SI. W przypadku ściany SI dane przedstawiono jako całkowitą liczbę kopii 16S rDNA uzyskanych z bakterii odzyskanych z 3 cm ściany SI (ponieważ ilość materiału wyjściowego jest zbyt mała, aby uzyskać dokładną wagę).

Aby ocenić wpływ antybiotyków na gęstość bakterii w próbkach kału, myszy były leczone antybiotykami przez doustne zgłębniki codziennie przez 10 dni (dni od 1 do 10), a próbki kału pobierano przed (dzień 0), w różnych punktach czasowych podczas antybiotykoterapii (dni 5 i 10) oraz 7 dni po zaprzestaniu podawania antybiotyków (dzień 17; Rysunek 3A). Jak pokazano w Rysunek 3B, antybiotykoterapia wywołuje silny spadek liczby kopii 16S rDNA/g kału wykrytych w 5 i 10 dniu, podczas gdy gęstość bakterii w kale powróciła do normalnego poziomu (porównywalnego z przed leczeniem) 1 tydzień po zaprzestaniu podawania antybiotyku (dzień 17).

figure-results-1
Rycina 1: Podawanie antybiotyków. Myszy otrzymywały antybiotyki przez zgłębnik doustny (czerwony) lub w wodzie pitnej (niebieski) przez 10 kolejnych dni. Wykres przedstawia masę ciała myszy w czasie trwania eksperymentów w stosunku do pierwotnej masy ciała przed podaniem antybiotyku (dzień 0). Dane są wyświetlane jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Amplifikacja qPCR genu 16S rRNA wzorców i próbek kału. (A) Regresja liniowa krzywej standardowej z deskryptorami krzywej standardowej. (B) Obliczanie obfitości genów w próbkach kału. Dane są wyświetlane jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Bakterie kałowe podczas antybiotykoterapii. (A) Schemat schematu podawania antybiotyków przez zgłębnik doustny (Ab) i pobierania próbek, jak pokazano *. (B) Kopie 16S rDNA na gram kału w próbkach kału od myszy pobranych we wskazanych dniach. Dane są wyświetlane jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

wzrost wzrost wzrost
Odczynnikgłośność
DNA8 μL
Bufor 10X2 μl
Zasilacze dNTP (10 mM)0,4 μl
Eubacteria - Podkład F (10 mM)1 μL
Eubacteria - Podkład R (10 mM)1 μL
Polimeraza Taq0,2 μl
H2O7,4 μl
Całkowita objętość20 μL
Sekwencje podkładowe
Eubacteria - F podkład5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'
Eubacteria - Podkład R5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'
Warunki jazdy na rowerze
temperaturaGodzinaCykli
94 °CCzas trwania: 5 min1x
94 °C30 sekund30-krotny
60 °C30 sekund30-krotny
72 °C1 min30-krotny
72 °CCzas trwania: 5 min1x
4 °C∞1x

Tabela 1: Odczynniki i warunki PCR. Poniższa tabela zawiera odczynniki i warunki cykliczne PCR do amplifikacji genu 16S rRNA z hodowli bakteryjnej w celu wytworzenia wzorca do wykorzystania w testach qPCR. Sekwencje elementarne zostały pierwotnie opublikowane przez Kruglova i wsp.13.

Odczynnikgłośność
SYBR Green master mix (2x)17,5 μL
Eubacteria - Podkład F (10 mM)0,7 μl
Eubacteria - Podkład R (10 mM)0,7 μl
H2O11,1 μl

Tabela 2: qPCR master mix. Podane objętości (objętość końcowa 35 μl) dotyczą pojedynczej próbki, którą należy poddać trzykrotnemu badaniu (po 10 μl każda) na 384-dołkowej płytce qPCR (z uwzględnieniem dodatkowych 5 μl w przypadku błędu pipetowania). Ilość ta może być zwiększana w zależności od liczby próbek, które mają być analizowane.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy eksperymentalne protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom i oznaczania ilościowego bakterii kałowych za pomocą qPCR. Kombinacja antybiotyków stosowanych w tym protokole (zawierających ampicylinę, gentamycynę, neomycynę, metronidazol i wankomycynę) działa zarówno na bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne, oferując działanie bakteriobójcze wobec pełnego spektrum bakterii. Zarówno doustne zgłębniki, jak i podawanie antybiotyków w wodzie pitnej znacznie zmniejszają obciążenie bakteriami kałowymi 5,6,12. Co więcej, oba zabiegi mają głęboki wpływ na fenotyp myszy, ponieważ rozwijają one kilka cech typowych dla myszy wolnych od zarazków, w tym zmniejszony rozmiar śledziony i powiększone jelito ślepe. Wybór konkretnej metody podawania antybiotyków może zależeć od długości eksperymentu, ponieważ metoda doustnego podawania przez zgłębnik wymaga codziennego podawania antybiotyków, co jest bardziej pracochłonne i może powodować większy dyskomfort u zwierząt w dłuższej perspektywie.

W przypadku podawania antybiotyków w wodzie pitnej należy zachować ostrożność przy dodawaniu słodzika do mieszanki antybiotyków, ponieważ jest to kluczowy czynnik chroniący myszy przed odwodnieniem. Kilka grup wykazało, że podawanie antybiotyków w wodzie pitnej (bez dodatku substancji słodzącej) prowadzi do bardzo ciężkiej i szybkiej utraty wagi, przy czym wszystkie myszy straciły ponad 20% początkowej masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni eksperymentu. W naszym protokole użycie słodzika na bazie sacharyny wydawało się wystarczające do zamaskowania smaku antybiotyku w wodzie, a myszy straciły na wadze w ciągu pierwszych kilku dni po podaniu antybiotyku, ale szybko odzyskały wagę po tym (ryc. 1). Niemniej jednak w naszych eksperymentach 5-10% myszy nadal osiąga ludzki punkt końcowy w postaci utraty >20% wyjściowej masy ciała i musiało zostać poddanych eutanazji. Przetestowaliśmy również słodziki na bazie sukralozy, które całkowicie nie zapobiegły odwodnieniu myszy (100% myszy straciło >20% wagi), podczas gdy inni autorzy opublikowali podobne niepowodzenia w przypadku słodzików na bazie aspartamu 5,6. Ponadto należy wziąć pod uwagę wiek, tło genetyczne i ogólny stan zdrowia myszy wykorzystanych do eksperymentów, ponieważ mogą one wpływać na utratę masy ciała i dobrostan zwierząt podczas leczenia antybiotykami. Dlatego przez pierwsze dwa tygodnie doustnego podawania antybiotyków należy codziennie monitorować masę ciała myszy i ogólny stan zdrowia.

Metody qPCR zapewniają szybkie i opłacalne podejście do oznaczania ilościowego 16S rRNA w próbkach kału. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne ograniczenia dotyczące tej techniki, w tym: i) wymóg niezawodnego standardu wysokiej jakości; ii) konstrukcję i skuteczność starterów qPCR; iii) fakt, że mikroorganizmy mogą mieć różną liczbę kopii genu 16S rRNA, a zatem kopie genów mogą nie być bezpośrednio równe liczbie komórek15. Niemniej jednak qPCR jest solidną i czułą metodą, która umożliwia szybką analizę próbek kału. Metoda ta może być szczególnie przydatna do szybkiej walidacji wpływu różnych metod leczenia (w tym antybiotyków) na obciążenie bakteriami kałowymi, jak opisano tutaj. Co więcej, chociaż udostępniamy protokół kwantyfikacji całkowitego 16S rRNA, metodę tę można łatwo dostosować (poprzez zaprojektowanie specyficznych starterów16), aby umożliwić identyfikację poszczególnych taksonów bakteryjnych, dostarczając w ten sposób zarówno ilościowych, jak i jakościowych informacji o wielkości i składzie mikrobiomu.

Podsumowując, przedstawiliśmy dwa protokoły doustnego leczenia myszami antybiotykami oraz metodę opartą na qPCR do ilościowego określania zmian w bakteriach kałowych wywołanych antybiotykami. Chociaż protokoły te mogą być dalej optymalizowane i łączone z innymi podejściami zgodnie z indywidualnymi potrzebami eksperymentalnymi, mogą służyć jako szybkie, opłacalne i niezawodne narzędzia do manipulowania mysią mikrobiotą jelitową oraz do badania wpływu antybiotykoterapii na homeostazę jelitową i chorobę.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Brytyjską Radę Badań Medycznych (grant dla P.B. MR/L008157/1); R.J. był wspierany przez Marie Curie Intra-European Fellowship (H2020-MSCA-IF-2015-703639); P.M.B. było wspierane przez stypendium od UK Medical Research Council oraz King's College London Doctoral Training Partnership in Biomedical Sciences (MR/N013700/1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól sodowa ampicylinySigma-Aldrich (Merck)A9518
Hydrat soli trisiarczanu neomycynySigma-Aldrich (Merck)N1876
MetronidazolSigma-Aldrich (Merck)M3761
Chlorowodorek wankomycynySigma-Aldrich (Merck)V2002
Sól siarczanu gentamycynySigma-Aldrich (Merck)G3632
TryptonSigma-Aldrich (Merck)T7293
Ekstrakt drożdżowySigma-Aldrich (Merck)Y1625
NaCLSigma-Aldrich (Merck)S7653
Słodzik Sweet'n Low Sweet'nLowDostępny w Wielkiej Brytanii od Amazon.co.uk
X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galaktopiranozyd)Fisher 10234923
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023
Ultraczysta agarozaThermo Fisher Scientific (Invitrogen)16500500
Woda klasy RT-PCRThermo Fisher Scientific (Invitrogen)AM9935
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabsM0530
Deoksynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworówNew England BioLabsN0447
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725124z
klonowaniem ROX TOPO TA™ do sekwencjonowaniaThermo Fisher Scientific (Invitrogen)450030
QIAamp szybki stołek DNA mini kit Qiagen51604
QIAprep spin Zestaw do miniprzygotowaniaQiagen27106
QIAquick gel  zestaw ekstrakcyjnyQiagen28704
Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; mFisher scientific10460031
Swann-MortonTM Sterylne ostrza skalpela ze stali węglowejFisher scientific11792724
Strzykawka (1 ml)BD Plastipak303172
(20 ml)BD Plastipak300613
1,5 ml Krystalicznie czysta probówka do mikrowirówekStarLabE1415-1500
2 ml Ultra wysoka probówka do mikrowirówki do odzyskuStarLabI1420-2600
Igły dozujące doustne 20 G x 38 mm zakrzywione (pk/3)Vet-TechDE008A
Sterilin szalka Petriego 50 mm Materiały laboratoryjnePET2020
Absolutne uszczelki płytkowe qPCRThermo Fisher ScientificAB1170
MicroAmpTM optyczna płytka 384-dołkowa Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)4309849
ViiA7TM 7 z blokiem 384-dołkowymThermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)4453536
(Nanodrop 1000)Termo Fisher ScientificND-1000
Labnet Prism MikrowirówkaLabnetC2500
MultiGene Optimax TermocyklerLabnetTC9610
naukowyStrzykawka System do PCR w czasie rzeczywistym Spektrofotometr

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
  3. Ubeda, C., Pamer, E. G. Antibiotics, microbiota, and immune defense. Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).
  4. Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biology. 6 (11), e280(2008).
  5. Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), e17996(2011).
  6. Hill, D. A., et al. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis. Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).
  7. Fraher, M. H., O'Toole, P. W., Quigley, E. M. Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).
  8. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  9. Sokol, H., et al. Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).
  10. Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota. Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).
  11. Ubeda, C., et al. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).
  12. Saez de Guinoa, J., et al. CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis. EMBO Journal. 37 (5), (2018).
  13. Kruglov, A. A., et al. Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis. Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).
  14. Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes. Nucleic Acids Research. 31 (10), e56(2003).
  15. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743(2012).
  16. Yang, Y. W., et al. Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces. Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oral Antibiotic AdministrationMurine Intestinal MicrobiotaQuantitative Polymerase Chain ReactionFecal Sample AnalysisAntibiotic Cocktail PreparationOral Gavage TechniqueDrinking Water AdministrationBacterial DNA ExtractionqPCR Standard Curve16S rDNA Quantification

Related Articles