Artykuł metodologiczny

Nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu

DOI:

10.3791/58485

⸱

14 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Nihon University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dwie nowatorskie metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym przy minimalnym wysiłku fizycznym dla zwierząt doświadczalnych. Opisano również metodę ilościowej oceny poziomów dystrybucji leków w mózgu poprzez szlak nos-mózg przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Donosicielstwo zostało uznane za potencjalną drogę dostarczania z nosa do mózgu środków terapeutycznych, które omijają barierę krew-mózg. Pojawiło się jednak niewiele doniesień dotyczących nie tylko analizy ilościowej, ale także optymalnych warunków podawania i schematów dawkowania w badaniach nad porodem z nosa do mózgu. Ograniczony postęp w badaniach nad mechanizmami szlaku no-mózg z wykorzystaniem gryzoni stanowi istotną przeszkodę w projektowaniu systemów dostarczania leków z nosa do mózgu.

Aby osiągnąć pewien postęp w tym względzie, opracowaliśmy i oceniliśmy dwie nowe metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym dla zwierząt doświadczalnych. Opisano również metodę oceny poziomów dystrybucji leków w mózgu poprzez szlak nos-mózg przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny (masa cząsteczkowa: 5000) jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

Początkowo opracowaliśmy protokół podawania donosowego oparty na pipetach za pomocą tymczasowo otwieranych masek, co umożliwiło nam niezawodne podawanie zwierzętom w stabilnym znieczuleniu. Korzystając z tego systemu, [14C]-inulina mogła być dostarczana do mózgu z niewielkim błędem eksperymentalnym.

Następnie opracowaliśmy protokół podawania donosowego polegający na odwrotnej kaniulacji od strony dróg oddechowych przez przełyk, który został opracowany w celu zminimalizowania skutków klirensu śluzowo-rzęskowego (MC). Technika ta doprowadziła do istotnie wyższych poziomów [14C]-inuliny, którą ilościowo wykryto w opuszce węchowej, mózgu i rdzeniu przedłużonym, niż metoda pipetowana. Wydaje się, że dzieje się tak dlatego, że retencja roztworu leku w jamie nosowej została znacznie zwiększona przez aktywne podawanie za pomocą pompy strzykawkowej w kierunku przeciwnym do MC do jamy nosowej.

Podsumowując, można oczekiwać, że dwie metody podawania donosowego opracowane w tym badaniu będą niezwykle użytecznymi technikami oceny farmakokinetyki u gryzoni. W szczególności metoda odwrotnej kaniulacji może być przydatna do oceny pełnego potencjału dostarczania kandydatów na leki z nosa do mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioleki, takie jak peptydy, oligonukleotydy i przeciwciała, są uważane za potencjalnie przydatne jako nowe środki terapeutyczne dla opornych na leczenie zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego, które obecnie nie mają terapii leczniczej. Ponieważ jednak większość leków biologicznych to makrocząsteczki rozpuszczalne w wodzie, dostarczanie z krwi do mózgu po podaniu dożylnym lub doustnym jest niezwykle trudne ze względu na impedancję bariery krew-mózg (BBB).

W ostatnich latach donosowe podawanie donosowe było potencjalną ścieżką dostarczania środków terapeutycznych z nosa do mózgu, która pozwala uniknąć BBB1,2,3,4,5. Pojawiło się jednak stosunkowo niewiele doniesień dotyczących analizy ilościowej ścieżki dostarczania od nosa do mózgu6. Co więcej, nie było praktycznie żadnych doniesień na temat ustalonych optymalnych warunków podawania i schematów dawkowania, takich jak objętość, czasy, okresy czasu i szybkość, dla badań nad dostarczaniem z nosa do mózgu. Wyżej wymienione braki można przypisać następującym przyczynom: (i) optymalna metoda podawania donosowego dla myszy nie została jeszcze ustalona, oraz (ii) podawanie donosowe przez pipetowanie, które jest powszechnie stosowane, zwykle charakteryzuje się zmiennością międzyosobniczą wśród zwierząt ze względu na klirens śluzowo-rzęskowy (MC), co często prowadzi do niedoszacowania rzeczywistego potencjału dostarczania danego leku z nosa do mózgu.

Znieczulenie wziewne z użyciem izofluranu (inicjacja: 4%, utrzymanie: 2%) z maską inhalacyjną dla gryzoni zyskało szerokie zastosowanie, w celu zmniejszenia lub wyeliminowania bólu związanego z operacją wykonywaną na zwierzętach doświadczalnych. Stosowanie masek sprawia, że stosunkowo łatwo jest wykonywać typowe podawanie leku zwierzętom doświadczalnym w znieczuleniu wziewnym drogą podskórną, dootrzewnową i dożylną. Jednak w przypadku podawania donosowego maska musi zostać tymczasowo zdjęta ze zwierząt w celu podania leku. Przy podaniu dawki poniżej 2% izofluranu zwierzęta zazwyczaj szybko budzą się po znieczuleniu wziewnym. Gdy objętość podawana w jednej dawce jest duża, może to spowodować przepływ roztworu leku z jamy nosowej do przełyku, a zatem może być konieczne podzielenie pojedynczej dużej dawki na kilka mniejszych dawek do podawania donosowego małym zwierzętom. Ponieważ podanie donosowe wymaga zdjęcia maski w celu wielokrotnego podawania i wystarczającego czasu na długotrwałe podawanie do jamy nosowej, istnieje duże prawdopodobieństwo, że myszy obudzą się ze znieczulenia podczas procedury podawania. To sprawia, że bardzo trudno jest wykonać podanie donosowe w stabilnym stanie znieczulenia i prawdopodobnie przyczynia się do obserwowanej międzyosobniczej zmienności dostarczania z nosa do mózgu wśród gryzoni.

W tym badaniu opracowaliśmy dwie nowatorskie metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym, które nakładają minimalny stres fizyczny na zwierzęta doświadczalne. Do pierwszej metody zastosowaliśmy czasowo otwieraną maskę, która umożliwia podanie donosowe podczas znieczulenia wziewnego. Otwierana część maski zawiera silikonową zatyczkę, która może być używana zgodnie z czasem podawania, aby ułatwić stabilne podawanie donosowe za pomocą pipety. W przypadku drugiej metody chirurgicznie wprowadzono kaniulę, która przechodziła z przełyku do jamy nosowej, a następnie podłączono do niej pompę strzykawkową, aby roztwór leku mógł być bezpośrednio i niezawodnie dostarczany do jamy nosowej w stabilnym znieczuleniu wziewnym. Metoda ta może zwiększyć dostarczanie leków do mózgu drogą z nosa do mózgu, ponieważ poprzez znaczne zminimalizowanie skutków MC, lek retencyjnie w jamie nosowej uległby poprawie. Ponadto opisujemy metodę ilościowej oceny poziomów dystrybucji leków (% dla wstrzykniętej dawki/g mózgu) w mózgu przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny [masa cząsteczkowa (MW): 5000] jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie na zwierzętach (#AP17P004) zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nihon (Tokio, Japonia). To badanie (#17-0001) zostało zatwierdzone przez Centrum Radioizotopów Szkoły Farmacji Uniwersytetu Nihon.

1. Zwierzęta używane do donosowego podawania w znieczuleniu wziewnym

  1. Myszy eksperymentalne należy umieścić w klatkach ze stali nierdzewnej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło w godzinach 8:00–20:00), z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną na poziomie 23 ± 1°C, wilgotnością 50% ± 10% oraz dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
  2. Przed eksperymentem należy znieczulić myszy poprzez inhalację 2% izofluranu, po rozpoczęciu leczenia w stężeniu 4%. Potwierdź wymagany poziom znieczulenia, sprawdzając, czy nie zniknęła korekta powierzchni.

2. Przygotowanie rozwiązania administracyjnego

  1. Przygotować roztwór do podawania [14C]-inuliny (50 μM, 0,5 μCi/ml na mysz) rozcieńczając w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Podawanie donosowe myszom

  1. Metoda mikropipet z wykorzystaniem tymczasowo otwieranej maski inhalacyjnej (Rysunek 1)
    Uwaga: Ta technika jest modyfikacją protokołu podawania donosowego przy użyciu mikropipety opracowanej przez Freya i wsp.3
    1. Unieruchom myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, przyklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem (Rysunek 1A).
    2. Podawaj całkowitą objętość 25 μl roztworu do podawania każdej myszy w odstępach 30-sekundowych, w dawkach od 1 do 2 μl podawanych naprzemiennie do lewego i prawego nozdrza, podczas gdy myszy są unieruchomione w znieczuleniu wziewnym (Ryc. 1B i C).
    3. Uwaga: Odpadowy gaz znieczulający jest usuwany za pomocą środków aktywnych (okap wyciągowy, utwardzona szafka bezpieczeństwa biologicznego, próżnia itp.), gdy maska jest otwarta i w sposób pasywny (kanister z gazem znieczulającym) po zamknięciu
  2. Odwrotna kaniulacja metod od strony dróg oddechowych przez przełyk (Rysunek 2)
    Uwaga: Ta technika jest modyfikacją protokołu wchłaniania donosowego dla szczurów ustalonego przez Hirai i wsp.7
    1. Unieruchom myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, zaklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem.
    2. Włosy na szyi są golone i przygotowywane poprzez aplikację betadyny lub chlorheksydyny, a następnie płukanie nasączone alkoholem.
    3. Odsłoń tchawicę i przełyk, rozszerzając skórę poniżej gardła kleszczami po wykonaniu małego nacięcia (1,5 cm) nożyczkami.
    4. Wykonaj nacięcie (1 mm) w tchawicy za pomocą nożyczek.
    5. Wprowadzić kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm) na długość 1,2 cm i przymocować przeciwległy koniec kaniuli do wnętrza maski wziewnej.
    6. Wykonaj nacięcie (1 mm) w przełyku za pomocą nożyczek, włóż kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,28 mm, średnica zewnętrzna: 0,61 mm) na długość 1,4 cm w kierunku tylnej części jamy nosowej i podwiąż ją (Rysunek 2A i B).
      Uwaga: Procedury od 3.2.2 do 3.2.4 przeprowadzono pod mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu ×10.
    7. Przymocować igłę (27 g × 1/2) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej roztworem do podawania i podłączyć do programowalnej pompy mikrostrzykawkowej.
    8. Podłącz powyższą igłę do kaniuli, która została wprowadzona do przełyku w punkcie 3.2.5 (Rysunek 2C).
    9. Podawać całkowitą objętość 25 μl [14C] roztworu inuliny ze stałą szybkością (5 μl/min) (ryc. 2C i 2D).

4. Eksperyment ilościowy z użyciem znakowanych radioaktywnie makrocząsteczek rozpuszczalnych w wodzie ([14C]-inulina)

  1. Odetnij głowy eksperymentalnym myszom w znieczuleniu i otwórz ich czaszki, używając nożyczek i od strony rdzenia przedłużonego, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
  2. Ostrożnie wyekstrahuj cały mózg, nabierając go za pomocą mikroszpatułki z czaszki.
  3. Umieść bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem soli fizjologicznej na szalce Petriego, która jest przechowywana na lodzie.
  4. Umieść wyekstrahowane mózgi na zwilżonej bibule filtracyjnej.
  5. Krew przylegającą do powierzchni mózgu zetrzeć wacikiem zwilżonym roztworem soli fizjologicznej, aby wyeliminować przynajmniej wpływ [14C]-inuliny we krwi na powierzchnię mózgu.
  6. Szybko rozbioruj mózgi i podziel je na trzy części: opuszkę węchową, mózg i rdzeń przedłużony (w tym most).
  7. Umieścić próbki mózgu w solubilizatorze tkanek w temperaturze 50 °C na 1 godzinę.
  8. Dodać 10 μl płynnego koktajlu scyntylacyjnego do próbek mózgu.
  9. Przenieść 25 μl podwielokrotności roztworu do podawania rozpuszczonego w koktajlu scyntylacyjnym do fiolki scyntylacyjnej w celu określenia radioaktywności zastosowanego roztworu.
  10. Zmierzyć rozpady na minutę radioaktywności [14C] w próbce mózgu ([14C] Xmózg) i zastosowanym roztworze ([14C] Xw dawce) w płynnym liczniku scyntylacyjnym wyposażonym w odpowiednią poprawkę krzyżową dla 3H i 14C.

5. Analiza danych

  1. Obliczyć poziomy dystrybucji leku (%) dla dawki wstrzykiwanej (ID%), stosując następujące równanie:
    ID%⁄g mózg = ([14C] Xmózg/[14C] Xw dawce) × 100,
    gdzie Xmózgu (dpm/g mózgu) jest ilością [14C]-inuliny mierzoną w tkance mózgowej, adawka X IN (dpm/25 μl roztworu) jest stężeniem [14C]-inuliny w roztworze używanym do podawania donosowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 pokazuje poziomy [14C]-inuliny (ID%⁄g mózgu) w opuszce węchowej (A), mózgu (B) i rdzeniu przedłużonym (C) uzyskane przy użyciu dwóch rodzajów podawania donosowego ocenianych w niniejszym badaniu. Podanie donosowe metodą pipety umożliwiło dostarczenie [14C]-inuliny do mózgu za pomocą otwieranych masek inhalacyjnych (Ryc. 1). W znieczuleniu wziewnym wyniki ilościowe nie wykazały eksperymentalnej zmienności mię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekuje się, że dostarczanie leków z nosa do mózgu będzie miało wyraźny wpływ na zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ szlak ten stanowi bezpośrednią trasę transportową, która omija barierę krew-mózg. Dotej pory opisano trzy różne ścieżki łączące nos z mózgiem. Pierwszym z nich jest szlak nerwu węchowego, który przechodzi od błony śluzowej węchu w błonie śluzowej nosa do przodomózgowia przez nerw węchowy. Drugi to szlak nerwu trójdzielnego, który przechodzi od błony śluzowej dróg odde...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Private University Research Branding Project od MEXT; Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (17K08249 [do T.K. i T.S.]) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS); grant na wspólne badania od Hamaguchi Foundation for the Advancement of Biochemistry [dla T.S.] oraz Fundacji Naukowej Takeda [dla T.K.]. Dziękujemy Panu Yuya Nito i Pani Akiko Asami za ich cenną pomoc techniczną w przeprowadzeniu eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mysz ddYJaponia SLC, Inc.Mężczyzna, 4-6 tygodni, 20-30 g
IsofluranePfizerv002139
Konfiguracja izofluranuSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-OTAir, SN-489-4
Maska izofulanowaSHINANO manufacturing CO. LTD.Dla małych gryzoni
Maska Isoflurane (typ otwierany)SHINANO manufacturing CO. LTD.Specjalne zamówienia
Pudełko anestezjologiczneSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-85-02
Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-1NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-27H
Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.Pęseta B-13H-1
NARZĘDZIA FINE SCIENCE Inc.11272-30Dumont #7 Pęseta Dumoxel-2
NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.A-12-1
Rurka kaniuli (PE-50)Becton, Dickinson and Company.5069773Średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm
Rurka kaniuli (SP-10)NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.KN-392ID: 0,28 mm, OD: 0,61 mm
GolarkaMARUKAN, LTD.DC-381
Mikroskop stereoskopowyOlympus CorporationSZ61
Igła 27G 1/2 w 13 mmTERUMO CORPORATIONNN-2738R
Strzykawka 1 mlTERUMO CORPORATIONSS-01T
Pompa strzykawkowaNeuro scienceNE-1000
Membrana celulozowaToyo Roshi Kaisya, Ltd.
MikroszpatułkaShimizu Akira Inc.91-0088
Mikropipeta (0,5-10 μl)Eppendorf AGZ368083
Chip do pipetEppendorf AG0030 000.811
Systemetykietowania Tape TimeMed, Inc.T-534-RDo mocowania myszy
[14C]-InulinaAmerican Radiolabeled Chemicals Inc.ARC0124A0,1 mCi/ml
EtOHWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-00461
Licznik scyntylacyjny cieczyPerkin Elmer Life and Analytical Sciences, IncTri-Carb 4810TR
00011090

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
  2. Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
  3. Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5(2008).
  4. Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
  5. Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
  6. Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
  7. Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
  8. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
  9. Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
  10. Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
  11. Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
  12. Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
  13. Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport z nosa do m zgukaniulacja wstecznainulina znakowana izotopowoanaliza dystrybucji w m zguopuszka w chowam zg przednirdze przed u onyklirens luzowo rz skowy

Powiązane artykuły