Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

21 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Streszczenie

W błonie śluzowej jelit komórki odpornościowe stanowią unikalną jednostkę immunologiczną, która promuje tolerancję immunologiczną, jednocześnie zapewniając obronę immunologiczną przed patogenami. Powszechnie wiadomo, że plastry Peyera (PP) odgrywają istotną rolę w błonowej sieci immunologicznej, ponieważ zawierają kilka podzbiorów efektorowych limfocytów T i B. Pewna część tych komórek efektorowych, pęcherzykowych limfocytów T pomocniczych (TFH) i komórek B centrum rozrodczego (GC) jest profesjonalizowana w regulacji odporności humoralnej. W związku z tym charakterystyka tych podzbiorów komórek w obrębie PP pod względem ich programu różnicowania i właściwości funkcjonalnych może dostarczyć ważnych informacji na temat odporności błony śluzowej. W tym celu dla naukowców cenna byłaby łatwa do zastosowania, wydajna i powtarzalna metoda izolacji limfocytów z PP. W tym badaniu naszym celem było wygenerowanie skutecznej metody izolowania limfocytów z mysich PP o wysokiej wydajności komórek. Nasze podejście ujawniło, że początkowe przetwarzanie tkanek, takie jak użycie odczynników trawiennych i mieszanie tkanek, a także warunki barwienia komórek i wybór paneli przeciwciał, mają ogromny wpływ na jakość i tożsamość izolowanych limfocytów oraz na wyniki eksperymentalne.

Tutaj opisujemy protokół umożliwiający badaczom efektywne izolowanie populacji limfocytów z PP, co pozwala na powtarzalną ocenę podzbiorów limfocytów T i B opartą na cytometrii przepływowej, koncentrując się głównie na podzbiorach komórek B TFH i GC.

Wprowadzenie

Cały przewód pokarmowy od początku do końca jest pokryty rozległą siecią limfoidalną, która zawiera więcej komórek odpornościowych niż jakikolwiek inny organ u ludzi i myszy1. Plastry Peyera (PP) stanowią główny składnik gałęzi jelitowej tej komórkowej organizacji immunologicznej, tak zwanej tkanki limfatycznej związanej z jelitami (GALT)2,3. W ramach PP w sposób ciągły pobierane są próbki tysięcy milionów antygenów pochodzących z materiałów dietetycznych, mikrobioty komensalnej i patogenów, a w razie potrzeby montuje się odpowiednie odpowiedzi immunologiczne wobec nich, utrzymując w ten sposób homeostazę immunologiczną jelit. W tym sensie PP można nazwać "migdałkami jelita cienkiego". PP składają się z głównych podprzedziałów: kopuły podnabłonkowej (SED), dużych stref pęcherzyków komórek B; leżący nad nim nabłonek związany z pęcherzykami (FAE) i obszar międzypęcherzykowy (IFR), w którym znajdują się limfocyty T4. Ta unikalna kompartmentalizacja PP umożliwia współpracę różnych podzbiorów komórek efektorowych, nadając w ten sposób immunokompetencję w jelitach.

PPs nie mają doprowadzającej limfy i z tego powodu antygeny transportowane do PP z jelita cienkiego nie są przenoszone przez naczynia limfatyczne, w przeciwieństwie do większości innych narządów limfatycznych. Zamiast tego, wyspecjalizowane komórki nabłonkowe zlokalizowane w FAE, tak zwane komórki M, są odpowiedzialne za transfer antygenów luminalnych do klasy PPs5. Następnie transportowane antygeny są odbierane przez komórki dendrytyczne (DC) i fagocyty, które znajdują się w regionie kopuły podnabłonkowej (SED) pod klasą FAE6,7. Ten proces sortowania antygenów przez DC w PP ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej8 i późniejszej generacji komórek wydzielających IgA9.

Ze względu na duże obciążenie antygenowe ze strony flory komensalnej i materiału pokarmowego, PP zawierają endogennie aktywowane podzbiory komórek T i B efektorowych w dużych ilościach, takich jak komórki B TFH i IgA+ GC10, co sugeruje, że PP reprezentują miejsce aktywnej odpowiedzi immunologicznej11. Wykrywanie do 20-25% komórek TFH w całkowitym przedziale limfocytów T CD4 + i do 10-15% komórek B GC w całkowitych komórkach B jest możliwe w PP pobranych od niezaszczepionych młodych myszy C57BL / 6 < klasa sup = "xref">12. W przeciwieństwie do innych typów komórek pomocniczych T (tj. Komórek Th1, Th2, Th17), komórki TFH wykazują unikalny tropizm w pęcherzykach komórek B, głównie dzięki ekspresji CXCR5, która sprzyja naprowadzaniu komórek TFH wzdłuż gradientu CXCL1313. W strefach pęcherzyków komórek B PP komórki TFH indukują rekombinację przełącznika klasy IgA i hipermutację somatyczną w aktywowanych komórkach B, z których różnicują się komórki wytwarzające IgA o wysokim powinowactwie14. Następnie te wydzielające przeciwciała komórki plazmatyczne migrują do blaszki właściwej (LP) i regulują homeostazę immunologiczną w jelitach10.

Identyfikacja i charakterystyka populacji komórek B TFH i GC w obrębie PP może umożliwić badaczom zbadanie dynamiki humoralnych odpowiedzi immunologicznych w warunkach stanu ustalonego bez potrzeby stosowania czasochłonnych modeli immunizacji tradycyjnie stosowanych w badaniach komórek B TFH-GC15,16,17,18. Analiza komórek TFH w PP nie jest tak prosta, jak w przypadku innych podzbiorów komórek. Wyzwania techniczne obejmują określenie idealnych warunków przygotowania tkanki, kombinacji przeciwciał i markerów powierzchniowych, a także wybór odpowiednich kontroli pozytywnych i ujemnych. Zarówno dziedziny badawcze TFH, jak i PP wykazują dużą zmienność pod względem procedur eksperymentalnych i są dalekie od osiągnięcia konsensusu w celu ustanowienia standardowych protokołów z kilku powodów. Po pierwsze, na każdy podzbiór komórek w PP ma tendencję do zróżnicowanego wpływu warunków przygotowania tkanek wymagających dalszych modyfikacji w sposób specyficzny dla podzbioru komórki. Po drugie, istnieje znaczna rozbieżność między zgłoszonymi metodami w odniesieniu do szczegółów przygotowania komórek z PP. Po trzecie, liczba badań porównawczych opartych na protokole badających idealne techniki przygotowania tkanek i warunki eksperymentalne do badań PP i TFH jest raczej ograniczona.

Aktualne badania oparte na protokole sugerujące przygotowanie komórek PP19,20,21,22 nie były zorientowane na komórki TFH- lub GC B. Ponadto stwierdzono, że niektóre warunki przygotowania tkanek zalecane dla PPs19,20, takie jak trawienie oparte na kolagenazie, wpływają negatywnie na wynik identyfikacji TFH za pomocą cytometrii przepływowej18. Na tej podstawie doszliśmy do wniosku, że zoptymalizowany, ustandaryzowany i powtarzalny protokół, który można wykorzystać do badania dynamiki komórek TFH i GC B w PP, byłby cenny dla badaczy pracujących nad tym tematem. Ta potrzeba dała nam impuls do stworzenia ulepszonego i aktualnego protokołu izolacji i charakterystyki limfocytów PP, który jest precyzyjnie zoptymalizowany pod kątem odzyskiwania komórek, żywotności i wydajności w charakterystyce cytometrycznej przepływowej kilku podzbiorów limfocytów T i B. Naszym celem było również wykluczenie kilku pracochłonnych etapów przygotowania sugerowanych w poprzednich protokołach, a tym samym skrócenie wymaganych manipulacji i czasu przygotowania tkanek i komórek z PP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania i eksperymenty opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Projektowanie eksperymentalnych zestawów i grup myszy

  1. (Opcjonalnie) Wspólne użytkowanie myszy eksperymentalnych w celu ułatwienia poziomej transmisji mikroflory jelitowej między myszami doświadczalnymi oraz zmniejszenia niespecyficznej zmienności w obrębie limfocytów PP. Dodatkowo używaj kontroli rodzeństwa z miotu tej samej płci, aby zminimalizować zmienność.

2. Etapy chirurgicznego wycięcia i przygotowania tkanki:

  1. Chirurgiczne usunięcie jelita cienkiego (SI)
    1. Poddać myszy eutanazji za pomocą uduszenia CO2 lub innej równoważnej metody zatwierdzonej przez instytucjonalną komisję etyczną ds. zwierząt.
    2. Przenieś mysz do dedykowanego obszaru do chirurgicznego wycięcia. Połóż tyłem do dołu i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem. Wykonaj laparotomię, przecinając skórę brzucha i otrzewną wzdłuż linii środkowej od łona do klatki piersiowej, otwierając w ten sposób jamę otrzewnej.
      UWAGA: Pierwsze nacięcie należy wykonać na stosunkowo niewielkim obszarze skóry, aby uniknąć penetracji jamy otrzewnej i uszkodzenia tkanki jelitowej. Kontynuuj wycinanie aż do pożądanej granicy anatomicznej.
    3. Zidentyfikuj kątnicę, która jest idealnym punktem orientacyjnym do wykrywania końcowego odcinka jelita krętego, które stanowi dystalny odcinek jelita cienkiego.
      UWAGA: Kątnica zwykle znajduje się w lewym dolnym rogu odwłoka myszy.
    4. Dokładnie wstrzyknij połączenie krętniczo-kątnicze i wykonaj cięcie na tym poziomie tak dystalnie, jak to możliwe, aby oddzielić jelito cienkie od kątnicy. W kolejnych krokach unikaj nadmiernego kontaktu fizycznego ze ścianą jelita, ponieważ delikatne PP łatwo zapadają się pod dotykiem.
    5. Delikatnie usuń całe jelito cienkie aż do zwieracza odźwiernika, przecinając krezkę nożyczkami. Zidentyfikuj połączenie między odźwiernikiem a dwunastnicą i odetnij dwunastnicę na tym poziomie, co doprowadzi do całkowitego oderwania jelita cienkiego od jamy brzusznej.
      UWAGA: (i) Unikaj nadmiernego wyprostu, ponieważ może to spowodować pęknięcie ściany jelita. (ii) Jeżeli oprócz limfocytów PP pożądana jest izolacja limfocytów LP, konieczne jest całkowite usunięcie tłuszczu krezkowego. Jednak tylko w przypadku izolacji PP pozostały tłuszcz krezkowy może przynieść pewne korzyści podczas dalszych etapów izolacji; Dlatego należy go zachować.
    6. Umieść odłączone jelito cienkie na 6-dołkowej płytce wypełnionej zimną RPMI + 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i delikatnie mieszaj tkanki ręcznie, aż wszystkie segmenty jelita zostaną zanurzone w zimnym podłożu. Utrzymuj tkanki na lodzie przez kolejne kroki.
    7. Po wypreparowaniu żądanej liczby mysich jelit cienkich przystąp do wycięcia PP z pobranego jelita cienkiego.
  2. Chirurgiczne wycięcie PP i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej:
    1. Delikatnie przenieś jelito cienkie na ręczniku papierowym, chwytając tłuszcz krezkowy za pomocą kleszczy i połóż stronę krezkową skierowaną w stronę ręcznika papierowego. Zwilż cały segment jelita zimnym RPMI + 10% FBS, aby uniknąć odwodnienia tkanek i lepkości.
      UWAGA: Pozostała tkanka tłuszczowa krezkowa może być pomocna na tym etapie, ponieważ segmenty tkanki tłuszczowej w miejscu krezkowym SI będą przyklejać się do ręcznika papierowego, utrzymując miejsce przeciwkrezkowe skierowane do góry.
    2. Zidentyfikuj PPs, które pojawiają się jako białe, wielopłatkowe agregaty w kształcie "kalafiora" po stronie przeciwkrezkowej ściany jelita.
      UWAGA: Nie zaleca się wypłukiwania zawartości światła, dopóki wszystkie PP nie zostaną wycięte. Opróżnienie zawartości luminalnej może spowodować zapadnięcie się PP i zapobiegnie kontrastowi kolorów między PP a ścianą jelita, co jest bardzo pomocne w wizualnej identyfikacji PP.
    3. Po zidentyfikowaniu PP po stronie przeciwkrezkowej, umieść chirurgiczne nożyczki z zakrzywionym końcem na PP (krzywa powinna być skierowana do góry), ograniczając PP od jego dystalnej i bliższej granicy.
      Opcjonalnie: Delikatnie popchnij PP w kierunku ostrzy nożyczek za pomocą opuszka palca. Ten manewr doprowadzi do lepszego wykluczenia otaczającej tkanki innej niż PP. Ostrożnie wyciąć PPs, wykluczając otaczającą tkankę jelitową.
      UWAGA: (i) Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania maksymalnej wydajności komórek PP przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia komórek z sąsiednich przedziałów jelitowych, takich jak LP i nabłonek jelitowy, które są również bogate w limfocyty T. (ii) Z jednego SI wyciętego z myszy C57BL/6 można zebrać 5-10 PP (średniej wielkości, wielopłatkowych). Celując jeszcze mniejszymi PP (nie wielopłatkowymi), możliwe jest zebranie do 12-13 PP na mysz (C57BL/6) przy użyciu tego protokołu.
    4. Przenieś wycięte PP na 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej wypełnioną lodowatym RPMI + 10% FBS i utrzymuj na lodzie za pomocą kleszczy lub zakrzywionych nożyczek chirurgicznych.
      UWAGA: (i) Natychmiast po wycięciu PP śluz i treść jelitową na powierzchni PP można oczyścić, delikatnie pocierając chusteczkę o ręcznik papierowy. Ten krok pomoże poprawić żywotność limfocytów PP. (ii) Zamiast przenoszenia PP na płytkę, można również rozważyć przeniesienie do oddzielnych probówek w zależności od całkowitej liczby próbki.
    5. Opcjonalnie: Po zakończeniu wycinania PP i późniejszego umieszczania w płytce studzienki, liczbę i rozmiar PP pobranych z różnych grup eksperymentalnych/mysich można udokumentować poprzez wykonanie zdjęcia płytki do hodowli tkankowej zawierającej PPs.
    6. Przygotuj zestaw stożkowych probówek o pojemności 50 ml wypełnionych 25 ml RPMI + 10% FBS (wstępnie podgrzanych w temperaturze 37 °C). Za pomocą nożyczek odetnij krawędź końcówki o pojemności 1 000 μl z odległości, która pozwoli na aspirację PP za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odessać PP za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść je z 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej do przygotowanych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Użyj nowej końcówki dla każdej próbki myszy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami.
    7. Zabezpiecz pokrywę i umieść probówki pionowo w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C, z ciągłym mieszaniem przy 125–150 obr./min przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj nowy zestaw probówek o pojemności 50 ml i umieść sitko o pojemności 40 μm na górze każdej probówki, przez które zostanie przygotowana zawiesina pojedynczych komórek.
      UWAGA: (i) Etap mieszania usunie pozostałą zawartość jelitową, śluz i resztki komórek, które zmniejszają żywotność komórek i regenerację limfocytów PP, jeśli nie zostaną usunięte. (ii) Nie stosuj żadnych enzymów trawiennych na tkankę PP, ponieważ proces trawienia powoduje dramatyczną utratę ekspresji CXCR5 z powierzchni komórki.
    8. Po wymieszaniu przenieś PP do sitka komórkowego 40 μm umieszczonego na wierzchu nowo przygotowanych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Używając zaokrąglonej strony tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie przebić PP przez sitko do komórek, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczych komórek. Przepłucz sitko 15–20 ml zimnego RPMI + 10 % FBS.
      UWAGA: (i) Przed filtrowaniem należy potrząsnąć rurkami zawierającymi PP poziomo. To krótkie potrząsanie ułatwi przenoszenie PP do filtrów komórkowych. (ii) Zaleca się stosowanie sitka komórkowego o wielkości 70 μm do izolacji nielimfoidalnych komórek odpornościowych (np. monocytów, makrofagów, DC).
    9. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe o stężeniu 350–400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 10 x 106 komórek/ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: (i) Przed zliczeniem komórek całkowitą liczbę komórek dla każdej grupy PP myszy można w przybliżeniu oszacować za pomocą następującego wzoru: "0,5-1 x 106 komórek x (liczba PP) = całkowita liczba komórek". Konieczne może być dalsze rozcieńczanie błękitem trypanowym w celu zliczania komórek. (ii) Jako alternatywę dla ręcznego liczenia można stosować automatyczne liczniki komórek.
    11. Przenieś 2-2,5 x 106 komórek w odpowiedniej objętości (np. 200 μl) na 96-dołkową płytkę o okrągłym dnie.
      UWAGA: W przypadku próbek jednokolorowych i kontroli ujemnej wystarczy 0,5-1 x 106 komórek.
    12. Odwirować płytkę o masie 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wstrząsnąć płytką.
    13. Umyj komórki w 200 μl buforu barwiącego.

3. Powierzchniowe barwienie przeciwciał

  1. Barwienie żywotności:
    1. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 100 μl możliwego do utrwalenia barwnika żywotności rozcieńczonego w PBS (1:1,000). Inkubować przez 30 minut na lodzie lub w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: (i) Barwienie wewnątrzkomórkowe w celu wykrycia kluczowych czynników transkrypcyjnych, takich jak Foxp3 lub Bcl-6, wymaga utrwalenia komórek. W takim przypadku nie można stosować nieutrwalalnych barwników żywotności (np. 7-AAD, DAPI). (ii) Aby rozcieńczyć możliwy do utrwalenia barwnik żywotności, nie należy używać żadnego buforu barwiącego zawierającego białko. Pożywki używane na tym etapie muszą być wolne od białka. (iii) Wykluczenie martwych komórek za pomocą barwienia żywotności ma zasadnicze znaczenie, ponieważ martwe komórki mogą powodować poważne trudności techniczne w analizie cytometrii przepływowej poprzez emitowanie autofluorescencji i niespecyficzne wiązanie przeciwciał powierzchniowych, co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników.
    2. Umyj komórki dwukrotnie buforem barwiącym. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Trzepocz płytkę.
  2. Blok Fc i warstwa powierzchniowa I:
    1. Przygotować roztwór bloku Fc, rozcieńczając przeciwciało anty-CD16/32 (1:200) w buforze barwiącym.
    2. Zawiesić komórki w 20 μl przygotowanego roztworu bloku Fc. Inkubować przez 15 minut na lodzie.
    3. Bez przemywania dodać 80 μl powierzchniowego koktajlu przeciwciał (patrz tabela 1 w celu uzyskania informacji o przeciwciałach) przygotowanego w odpowiednich rozcieńczeniach. Inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut.
    4. Umyć dwukrotnie, dodając nadmierną ilość buforu barwiącego. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Trzepocz płytkę.
  3. Powierzchnia -Warstwa II:
    1. Przygotować roztwór barwiący streptawidynę, rozcieńczając streptawidynę sprzężoną z fluorochromem w buforze barwiącym.
    2. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki 100 μl wstępnie rozcieńczonego roztworu barwiącego streptawidyny (1:100). Inkubować przez co najmniej 15 minut na lodzie w ciemności.
    3. Umyć dwukrotnie buforem barwiącym. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Przesunąć płytkę.
      Opcjonalnie: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe w celu wykrycia pęcherzykowych regulatorowych limfocytów T nie jest pożądane, po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 200 μl buforu barwiącego i przenieś do odpowiednich probówek w celu uzyskania danych w cytometrze przepływowym. Gdy próbki nie są utrwalone, akwizycja danych za pomocą cytometrii przepływowej powinna zostać przeprowadzona w ciągu 3–4 godzin, aby uzyskać dokładne wyniki.

4. Utrwalenie komórek

  1. Przygotować roztwór roboczy do utrwalania/permeabilizacji (Fix/Perm) przy użyciu odczynników z zestawu barwiących Foxp3/Transcription Factor. Wymieszać jedną część koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z trzema częściami rozcieńczalnika utrwalającego/przepuszczalnego do pożądanej objętości końcowej.
  2. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 200 μl roztworu roboczego Fix/Perm.
  3. Inkubować płytkę na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Nie przekraczaj 20 minut na tym etapie. Dłuższy czas inkubacji może poważnie spowolnić regenerację komórek.
  4. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Trzepocz płytkę. (Opcjonalnie) Po tym etapie utrwalone komórki mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C w buforze barwiącym zawierającym albuminę surowicy bydlęcej (BSA) lub FBS do czasu późniejszego barwienia wewnątrzkomórkowego lub akwizycji cytometrii przepływowej.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu permeabilizacyjnego (x1) świeżo wstępnie rozcieńczonego w oczyszczonej wodzie dejonizowanej.
  6. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Przemyć raz 200 μl buforu permeabilizacyjnego i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

5. Barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Przygotować roztwór bloku Fc, rozcieńczając przeciwciało anty-CD16/32 (1:200) w buforze permeabilizacyjnym.
    UWAGA: Po etapie utrwalania komórki muszą być utrzymywane w buforze przepuszczalnym do końca procesu barwienia wewnątrzkomórkowego.
  2. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 20 μl roztworu bloku Fc. Inkubować przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Bez przemywania dodać 80 μl wewnątrzkomórkowego koktajlu przeciwciał (100 μl końcowej objętości) wstępnie rozcieńczonego w buforze permeabilizacyjnym. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 100 μl buforu do permu i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć raz 200 μl buforu permeabilizacyjnego, odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Po końcowym płukaniu ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego i przenieść komórki do odpowiednich probówek (końcowa objętość 400 μl w buforze barwiącym) i uzyskać dane za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki barwione na płytce 96-dołkowej można również badać bez przenoszenia do probówek, jeśli dostępny jest cytometr przepływowy z czytnikiem płytek. Ten krok minimalizuje utratę komórek podczas transferu komórek.
  7. Zdobądź co najmniej 5 x 10 5 komórek łącznie na cytometrze przepływowym, aby móc przeprowadzić odtwarzalną analizę komórek TFH, TFR oraz GC B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przeciwieństwie do poprzedniego protokołu20, zaobserwowaliśmy, że płytki Peyer (PP) nie są rozmieszczone równomiernie w całym jelicie cienkim (SI), lecz są zlokalizowane bardziej gęsto w kierunku końców dystalnych i proksymalnych SI, co przedstawiono na Rysunku 1A. Analiza cytometryczna wykazała, że przy prawidłowym zastosowaniu nasz protokół pozwala uzyskać populację limfocytów z płytek Peyer, któr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół zoptymalizowany pod kątem charakterystyki cytometrii przepływowej komórek TFH i GC B. Jedną z głównych zalet naszego protokołu jest to, że umożliwia on izolację do 107 (średnio 4-5 x 106 komórek) całkowitych komórek PP od jednej myszy (szczep C57BL/6) bez żadnego procesu trawienia. Zaobserwowaliśmy, że całkowita wydajność komórek była dodatnio skorelowana z liczbą PP i można ją oszacować na podstawie następującego prostego równania, które jest pomocne w planowaniu ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Laurze Strauss i Peterowi Sage'owi za pomocne dyskusje i wsparcie w analizach cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało anty-mysie CD4eBioscience, Biolegend*17-0041-81,10054*Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
anty-mysie CD19eBioscienceMA5-16536Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Tabela 1
przeciwciało anty-mysie PD-1eBioscience61-9985-82Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Tabela 1
przeciwciało anty-mysie ICOSeBioscience12-9942-82Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
Przeciwciało anty-mysie GL7Biolegend144610Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
anty-mysie CXCR5Biolegend*, BD Bioscience145512*, 551960Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
anty-mysie BCL-6Biolegend358512Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
przeciwciało anty-mysie Foxp3 przeciwciałoeBioscience17-5773-82Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
7AADBiolegend420404Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1
Kolagenaza IIWorthingtonLS004176
Kolagenaza IVWorthingtonLS004188
Zestaw do barwienia Foxp3/czynnika transkrypcyjnegoeBioscience00-5523-00
Płytki 6-dołkowe, 12-dołkowe i 96-dołkoweFalcon/Corning353046,353043/3596
Probówki stożkowe 50 mlFalcon3520
40 & mikro; m filtr siatkowy do komórekFalcon352340
10 ml strzykawka-tłokExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Wytrząsarka orbitalnaVWRModel 200
Nożyczki
z drobnym ząbkowaniem
Małe zakrzywione nożyczki
przeciwciało przeciwciało przeciwciało z zakrzywionym końcemKleszcze

Bibliografia

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przepływowakomórki TFHkomórki B centrum kiełkowaniabarwienie komórekpanel przeciwciałtrawienie tkanekżywotność komórekekspresja CXCR5
Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.