Artykuł metodologiczny

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

DOI:

10.3791/58502

⸱

29 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Method Development and Analytics, Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service, Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products, Agroscope

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mączlik Bemisia tabaci (Gennadius) jest inwazyjnym szkodnikiem o dużym znaczeniu, wpływającym na produkcję warzyw i roślin ozdobnych w wielu krajach na całym świecie. Poważne straty w plonach są spowodowane bezpośrednim dokarmianiem, a co ważniejsze, również przenoszeniem ponad 100 szkodliwych wirusów chorobotwórczych roślin. Jeśli chodzi o inne szkodniki inwazyjne, zwiększony handel międzynarodowy ułatwia rozprzestrzenianie się B. tabaci na obszary poza jego rodzimym zasięgiem. Inspekcje produktów importowanych z roślin w punktach wjazdu, takich jak porty morskie i lotnicze, są zatem postrzegane jako ważny środek zapobiegawczy. Jednak ta ostatnia linia obrony przed inwazjami szkodników jest skuteczna tylko wtedy, gdy łatwo dostępne są metody szybkiej identyfikacji podejrzanych okazów owadów. Ponieważ morfologiczne zróżnicowanie między regulowanym B. tabaci a bliskimi krewnymi bez statusu kwarantanny jest trudne dla osób niebędących taksonomami, opracowano szybki test identyfikacji molekularnej oparty na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Niniejsza publikacja przedstawia szczegółowy protokół nowego testu opisujący szybką ekstrakcję DNA, ustawienie reakcji LAMP, a także interpretację jej odczytu, która pozwala na identyfikację próbek B. tabaci w ciągu jednej godziny. W porównaniu z istniejącymi protokołami wykrywania określonych biotypów B. tabaci, opracowana metoda jest ukierunkowana na cały kompleks gatunków B. tabaci w jednym teście. Ponadto test jest przeznaczony do stosowania na miejscu przez inspektorów zdrowia roślin po minimalnym przeszkoleniu laboratoryjnym bezpośrednio w punktach wprowadzenia. Dokładna walidacja przeprowadzona w warunkach laboratoryjnych i na miejscu pokazuje, że zgłoszony test LAMP jest szybkim i wiarygodnym narzędziem identyfikacyjnym, poprawiającym zarządzanie B. tabaci.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mączlik Bemisia tabaci (Gennadius) jest inwazyjnym szkodnikiem insektycznym, wpływającym na plony wielu ważnych gospodarczo upraw, w tym roślin ozdobnych, warzyw, roślin strączkowych i bawełny1,2. Oprócz szkód spowodowanych bezpośrednim karmieniem łykiem, gatunek homoptera szkodzi roślinom pośrednio poprzez wydalanie dużych ilości spadzi na powierzchnię liści i owoców, a także przez przenoszenie licznych wirusów chorobotwórczych dla roślin1,3,4. Ostatnie badania genetyczne porównujące sekwencje DNA mitochondrialnego genu oksydazy cytochromu c 1 (COI) wykazały, że B. tabaci jest kompleksem gatunkowym składającym się z co najmniej 34 gatunków morfokrypicznych3,4. Dwa wysoce inwazyjne i szkodliwe elementy tego kompleksu, biotyp B pochodzący z Bliskiego Wschodu i regionu Azji Mniejszej, a także biotyp Q pochodzący z regionu Morza Śródziemnego, zostały rozproszone na całym świecie poprzez międzynarodową działalność handlową z produktami roślinnymi, w szczególności przez transport roślin ozdobnych1,5,6. Ze względu na jego światowy status szkodnika, Międzynarodowa Unia Ochrony Przyrody i Zasobów Naturalnych (IUCN) umieściła B. tabaci na liście "100 najgorszych inwazyjnych gatunków obcych na świecie", a członkowie kompleksu gatunków są organizmami regulowanymi przez wiele krajów1,3,4.

W Unii Europejskiej (UE) B. tabaci jest wymieniony w Dyrektywie Zdrowia Roślin 2000/29/WE Załącznik 1AI jako organizm kwarantannowy, którego wprowadzanie z krajów spoza UE i jego rozpowszechnianie w UE jest zabronione4. Podstawowym środkiem zapobiegawczym zapobiegającym rozprzestrzenianiu się organizmów kwarantannowych jest inspekcja przesyłek roślin w punktach wejścia (POE), takich jak lotniska i porty morskie7,8. W przypadku wykrycia organizmu kwarantannowego, odpowiedzialna za to Krajowa Organizacja Ochrony Roślin (NPPO) podejmuje działania polegające na odrzuceniu lub usunięciu (w tym zniszczeniu) zainfekowanej przesyłki9. Jednak funkcjonariusze kontrolujący import często nie mają wiedzy taksonomicznej, aby dokładnie zidentyfikować szeroki zakres gatunków szkodników związanych z globalnym handlem9. Zwłaszcza identyfikacja niedojrzałych stadiów życiowych (np. jaj i larw) bez wyraźnych kluczy morfologicznych jest praktycznie niemożliwa dla osób niebędących taksonomami8,9,10. W związku z tym, aby umożliwić wdrożenie środków kwarantanny z minimalnym opóźnieniem, istnieje potrzeba alternatywnych, szybkich testów identyfikacyjnych na miejscu9.

A candidate method to technologia izotermicznej amplifikacji DNA (LAMP) za pośrednictwem pętli, która ostatnio okazała się odpowiednią technologią do identyfikacji patogenów roślinnych11,12,13. LAMP jest wysoce specyficzny, ponieważ metoda wykorzystuje co najmniej dwie pary starterów rozpoznające sześć różnych docelowych sekwencji DNA14. Ze względu na aktywność polimerazy DNA Bst polegającą na przemieszczaniu nici DNA, reakcje LAMP przeprowadza się w warunkach izotermicznych14. W związku z tym, w przeciwieństwie do konwencjonalnych testów opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), nie ma potrzeby stosowania termocyklera13,14. Kolejną zaletą w porównaniu z testami opartymi na PCR jest ich odporność na potencjalne inhibitory w ekstrakcie DNA, co pozwala uniknąć konieczności etapu oczyszczania DNA13. Ze względu na szybkość i prostotę protokołu, LAMP może być wykonywany nawet w warunkach na miejscu przy użyciu przenośnego, zasilanego bateryjnie urządzenia do wykrywania w czasie rzeczywistym8,15.

A Test LAMP został zaprojektowany w odpowiedzi na zapotrzebowanie na szybką metodę identyfikacji na miejscu dla B. tabaci8. Nadrzędnym celem było opracowanie protokołu, który mógłby być stosowany przez inspektorów zdrowia roślin z ograniczonym przeszkoleniem laboratoryjnym. W związku z tym duży nacisk położono na optymalizację szybkości i prostoty protokołu. Podczas gdy istniejące testy diagnostyczne zostały na ogół opracowane w celu identyfikacji jednego lub kilku biotypów B. tabaci, nowatorski test LAMP obejmuje cały kompleks gatunkowy B. tabaci8,16,17,18. Problem wyraźnej różnorodności genetycznej w obrębie taksonu kompleksu został rozwiązany poprzez zastosowanie kombinacji różnych zestawów starterów i zastosowanie zdegenerowanych starterów8. Nowy test B. tabaci LAMP został zaprojektowany w taki sposób, że startery celują w fragment na końcu 3' mitochondrialnego genu COI8. Gen ten stanowi odpowiedni cel dla testów diagnostycznych na zwierzętach, ponieważ zawiera regiony wystarczająco konserwatywne, aby zapewnić czułość diagnostyczną dla określonego gatunku, jednocześnie wystarczająco rozróżniając między blisko spokrewnionymi organizmami19,20. Co więcej, gen COI jest często używany jako marker genetyczny w badaniach genetycznych populacji oraz jako sekwencja sygnatury w analizach kodów kreskowych DNA, co skutkuje licznymi wpisami sekwencji DNA w bazach danych typu open source, takich jak GenBank i BOLD21,22. Oprócz publicznie dostępnych sekwencji COI z B. tabaci, sekwencje COI z blisko spokrewnionych gatunków (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciae i Trialeurodes spp. [N = 4]) zostały włączone do projektu startera tego badania i wykorzystane do oceny czułości diagnostycznej i swoistości w silico8.

Ze względu na dokładność metody, jej szybkość (<1 h) i prostotę protokołu, test okazał się odpowiedni do zastosowania na miejscu, gdy jest wdrażany jako część procedury kontroli importu w szwajcarskim POE8.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

  1. Przygotowanie porcji alkalicznego roztworu do ekstrakcji DNA.
    1. Wyprodukować zapas alkalicznego roztworu do ekstrakcji DNA, używając wody molekularnej uzupełnionej 600 μM wodorotlenku potasu (KOH) i 2 μM czerwieni krezolowej.
      UWAGA: KOH to mocna zasada rozpuszczona w wodzie. Unikaj rozlania oraz kontaktu ze skórą i oczami.
    2. Dozować 30 μl alkalicznego roztworu do ekstrakcji DNA (przygotowanego w kroku 1.1.1) do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Roztwór do ekstrakcji DNA należy zużyć w ciągu 1 roku.
  2. Przygotowanie dodatniej kontroli amplifikacji B. tabaci (PAC).
    1. Generowanie amplikonów PCR docelowego fragmentu DNA LAMP.
      UWAGA: Wprowadzenie do ogólnych zasad i praktyk PCR znajduje się w Lorenz23.
      1. Zsyntetyzuj lub otrzymaj startery C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') i TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′) amplifikujące fragment mitochondrialnego genu COI24,25.
      2. Ustawić reakcję PCR zgodnie z opisem w tabeli 1. Użyć ekstraktu DNA (patrz krok 2.1) z referencyjnego próbki B. tabaci jako matrycy DNA.
        UWAGA: Opcjonalnie możliwa jest ekstrakcja DNA B. tabaci do PAC przy użyciu zestawu handlowego zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Zaprogramuj termocykler w następujących warunkach: 15 minut w 95 °C; 45 cykli po 40 s w 95 °C, 15 s w 45 °C, z krokiem od 60 s do 60 °C, 2 minuty w 72 °C; 7 minut w 72 °C; przytrzymaj w 4 °C.
      4. Oczyść produkt do amplifikacji PCR za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta i eluuj produkt końcowy w wodzie molekularnej.
      5. Użyj komercyjnego zestawu z barwnikiem interkalującym DNA, aby zmierzyć stężenie DNA w produkcie do amplifikacji PCR zgodnie z instrukcjami producenta i rozcieńczyć wodą o czystości cząsteczkowej do stężenia 1 ng/μL. Rozcieńczony produkt do amplifikacji PCR należy przechowywać jako roztwór podstawowy PAC w temperaturze -20 °C.
        UWAGA: Roztwór podstawowy PAC należy zużyć w ciągu 1 roku.
      6. Uzupełnić roztwór podstawowy PAC (przygotowany w kroku 1.2.1.5) 0,6 μM KOH i rozcieńczyć wodą o czystości cząsteczkowej do stężenia 5 x 10-3 ng/μL. Przechowywać produkt w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: W ciągu 5 godzin należy zużyć PAC do przygotowania gotowych do użycia zestawów LAMP B. tabaci opisanych w następnym kroku.
  3. Przygotowanie gotowego do użycia zestawu B. tabaci LAMP (protokół na 20 sztuk)
    1. Za pomocą nożyczek pokrój 8-rurkowe paski LAMP na dwa 4-rurkowe paski LAMP.
    2. Oznacz rurki 4-rurowych pasków LAMP zgodnie ze schematem pokazanym na Rysunek 1.
    3. Przygotować B. tabaci LAMP reaction mastermix (protokół na 80 reakcji).
      1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml dodać 1195,1 μl gotowej do użycia izotermicznej mieszanki wzorcowej GspSSD (zawierającej polimerazę GspSSD, pirofosfatazę, siarczan magnezu, deoksynukleotydy, barwnik wiążący DNA wiążący podwójną nić) i 717,4 μl mieszanki starterów B. tabaci LAMP. Krótko wirówka wirowa i pulsacyjna.
      2. Dozować 22,5 μl B. tabaci LAMP reaction mastermix (przygotowanego w kroku 1.3.3.1) do każdej probówki 4-rurowych pasków LAMP (przygotowanych w kroku 1.3.1) i wirować pulsacyjnie.
    4. Szybko przetrząsnąć LAMPĘ PAC B. tabaci (przygotowaną w kroku 1.2) i odwirować pulsacyjnie. Następnie dodać 2,5 μl do probówki oznaczonej "PAC" każdego 4-probówkowego paska LAMP (Rysunek 1).
    5. Zamknij pokrywy i przechowuj gotowe do użycia zestawy B. tabaci LAMP w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zużyj je w ciągu 1 roku.

2. Analiza LAMP na miejscu

  1. Ekstrakcja DNA
    1. Użyj sterylnych wykałaczek, aby przenieść próbki owadów do probówek do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml zawierających 30 μl roztworu do ekstrakcji DNA (przygotowanego w kroku 1.1.2).
      UWAGA: Upewnij się, że owady są zanurzone w roztworze ekstrakcyjnym.
    2. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C w termomikserze (300 obr./min). Krótko wirówka wirowa i pulsacyjna.
  2. Test B. tabaci LAMP
    1. Rozmrozić gotowy do użycia zestaw B. tabaci LAMP przygotowany w kroku 1.3. Wirówka szybko wirowa i pulsacyjna.
      UWAGA: Z każdym zestawem możliwe jest przetestowanie dwóch różnych próbek lub analiza ekstraktu DNA z jednej próbki w dwóch egzemplarzach.
    2. Dodać 2,5 μl próbki ekstraktu DNA (przygotowanego w kroku 2.1) do probówek oznaczonych "S1" i "S2" gotowego do użycia zestawu B. tabaci LAMP (Rysunek 1).
    3. Dodać 2,5 μl czystego alkalicznego roztworu do ekstrakcji DNA (przygotowanego w sekcji 1.1) do probówki oznaczonej "NAC" dla kontroli ujemnej amplifikacji (Rysunek 1).
    4. Szybko wymieszaj gotowy do użycia zestaw B. tabaci LAMP i wiruj pulsacyjnie.
    5. Włóż gotowe do użycia zestawy B. tabaci LAMP do urządzenia do analizy LAMP (z pomiarem fluorescencji w czasie rzeczywistym) lub platformy PCR w czasie rzeczywistym i wykonuj izotermiczną analizę amplifikacji DNA w temperaturze 65 °C przez 60 min.
    6. Zmierz temperaturę topnienia produktów amplifikacji DNA, podgrzewając do 98 °C z kolejnym etapem chłodzenia (szybkość narastania 0,05 °C/s) do 75 °C, jednocześnie mierząc fluorescencję w czasie rzeczywistym.
  3. Odczyt testu LAMP
    1. Ręcznie zatwierdź odczyt LAMP w następujący sposób.
      1. Jeśli amplifikacje DNA zostały zmierzone dla próbki i PAC, nie zmierzono amplifikacji DNA dla NAC, a temperatura wyżarzania produktów amplifikacji wynosiła od 80,0 do 85,5 °C, należy uznać wyniki LAMP za DODATNIE (Rysunek 2).
      2. Jeśli nie ma amplifikacji DNA dla próbek (tj. probówek oznaczonych S1 i S2), ale dla PAC i NAC, należy uznać wynik LAMP za UJEMNY (Rysunek 2).
      3. Jeśli amplifikacja DNA została zmierzona dla próbek, ale temperatury wyżarzania odpowiednich produktów amplifikacji były poza zakresem 80,0 \u2012 85,5 °C i/lub PAC nie dał amplifikacji DNA i/lub NAC dał amplifikację DNA, należy uznać wynik LAMP za NIEPRAWIDŁOWY (Rysunek 2).
    2. Opcjonalnie można sprawdzić poprawność odczytu LAMP za pomocą aplikacji walidacyjnej LAMP (plik uzupełniający 1).
      1. Zdefiniuj gatunki docelowe i określ liczbę badanych próbek. Kliknij przycisk "Generuj raport".
      2. Przenieść odczyt (amplifikacja DNA tak/nie, produkt do amplifikacji w temperaturze wyżarzania, wyniki PAC i NAC) z urządzenia do analizy LAMP na miejscu lub platformy PCR w czasie rzeczywistym do odpowiednich pól wejściowych aplikacji walidacyjnej. Wynik walidacji jest wyświetlany natychmiast po wprowadzeniu danych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas walidacji testu B. tabaci LAMP, przeanalizowano próbki owadów przechwycone w trakcie regularnego procesu kontroli importu w Szwajcarii8. Okazy pochodziły z ośmiu różnych krajów (Wyspy Kanaryjskie, Dominikana, Izrael, Malezja, Maroko, Singapur, Tajlandia i Wietnam) i odzwierciedlają różnorodność genetyczną B. tabaci znalezioną w europejskich POEs8. Wszystkie wyniki LAMP zostały zweryfikowane krzyżowo za pomocą kodu kreskowego DNA8.

Z ogólnej liczby 80 próbek przeanalizowanych przez LAMP, 75 próbek (93,8%) zostało poprawnie zidentyfikowanych jako B. tabaci (prawdziwie pozytywne), dwie próbki (2,5%) zostały poprawnie zidentyfikowane jako nienależące do B. tabaci (wyniki prawdziwie negatywne), a trzy próbki (3,8%) zostały błędnie zidentyfikowane jako niebędące B. tabaci (wyniki fałszywie ujemne) (Tabela 2)8. Poprawnie ujemne wyniki pochodziły z dwóch okazów Trialeurodes vaporariorum, gatunku nieobjętego regulacjami, który jest gatunkiem wysokiego ryzyka, który można pomylić z B. tabaci w punktach POE dla produktów roślinnych8. Na podstawie tych wyników obliczono następujące pomiary dokładności diagnostycznej: swoistość testu (odsetek true-ujemny), 100%; czułość testu (odsetek wyników prawdziwie dodatnich), 96,2%; skuteczność testu (procent poprawnych wyników testu), 96,3% (Tabela 2)8. Oceniając czułość analityczną (granicę wykrywalności), test B. tabaci LAMP z powodzeniem amplifikował DNA próbki rozcieńczonej do 100 fg/μl w trzech kontrpróbach technicznych (tabela 3).

Podzbiór testów (N = 13) został przeprowadzony w warunkach na miejscu w szwajcarskim lotnisku POE w Zurychu przez inspektorów zdrowia roślin przy użyciu gotowych do użycia zestawów B. tabaci LAMP 8. Po walidacji krzyżowej w laboratorium referencyjnym wszystkie wyniki testów na miejscu okazały się prawidłowe (skuteczność testu = 100%)8. Oceniając wydajność testu LAMP na miejscu, średni czas do uzyskania dodatniego wyniku (czas do uzyskania pozytywnych wyników) wynosił 38,4 ± 10,3 minuty (średnia ± odchylenie standardowe)8. Reprezentatywny wykres amplifikacji DNA i odpowiadająca mu pochodna wyżarzania z analizy B. tabaci LAMP przeprowadzonej w warunkach na miejscu pokazano na rysunku Rysunek 3A i B. W tym przykładzie próbka pierwsza i druga zostały poprawnie zidentyfikowane jako B. tabaci wskazane przez amplifikację DNA po około 30 minutach (Rysunek 3A) wraz z oczekiwanymi temperaturami wyżarzania w około 82 °C ( Rysunek 3B).

figure-results-1
Rysunek 1: Wizualizacja eksperymentalnego zestawu gotowego do użycia zestawu B. tabaci LAMP opisanego w protokole. S1, próbka 1; S2, próbka 2; PAC, dodatnia kontrola wzmocnienia; NAC, kontrola amplifikacji ujemnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat walidacji odczytu LAMP. PAC: dodatnia kontrola amplifikacji; NAC: ujemna kontrola amplifikacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wykres amplifikacji DNA (A) i pochodna wyżarzania (B) analizy LAMP B. tabaci przeprowadzonej w warunkach na miejscu. Fluorescencję mierzono w jednostkach intensywności względnej. Zielona linia, próbka 1; pomarańczowa linia, próbka 2; niebieska linia, ujemna kontrola amplifikacji (NAC); czerwona linia, dodatnia kontrola wzmocnienia (PAC). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

składnikStan magazynowyKońcowa reakcja conc.Objętość na reakcję
Taq Polimeraza Główna Mix 2x1x10 μL
Podkład C1-J-219520 μM0,4 μM0,4 μl
Podkład TL2-N-301420 μM0,4 μM0,4 μl
Woda klasy molekularnej--8,2 μl
Szablon DNA--1 μL

Tabela 1: Przygotowanie wzorcowej mieszanki reakcji PCR do kontroli dodatniej amplifikacji B. tabaci.Składniki i stężenia potrzebne do przeprowadzenia jednej reakcji PCR. Końcowa objętość reakcji wynosi 20 μl. Sekwencje starterów pokazano w 1.2.1.1.

Rozdział pkt. szt. pkt.
NNTPNFPNTNNFNSEN (%)SPE (%)EFR (%)
Rozdział 80750cyfra arabska396,210096,3

Tabela 2: Wyniki walidacji testu B. tabaci LAMP. N, liczba analiz; NTP, liczba wyników prawdziwie dodatnich; NFP, liczba wyników fałszywie dodatnich; NTN, liczba wyników prawdziwie ujemnych; NFN, liczba wyników fałszywie ujemnych; SEN, czułość diagnostyczna; SPE, swoistość diagnostyczna, EFF, skuteczność testu.

CDNA (fg/μL)NPRTP (min)
(średnia ± SD)		TA (°C)
(średnia ± SD)
1 x 105333,5 ± 2,981,3 ± 0,1
1 x 104330,7 ± 1,181 ± 0,0
1 x 103340,4 ± 3,981,1 ± 0,1
1 x 102350,7 ± 1,681,1 ±0,1
1 x 1010--
1 x 1000--

Tabela 3: Czułość analityczna (granica wykrywalności) testu B. tabaci LAMP. Każde rozcieńczenie badano w trzech egzemplarzach. CDNA, stężenie DNA na reakcję; NPR, liczba dodatnich kontrprób; TP, czas do momentu, gdy wynik dodatni był dostępny; T A, temperatura wyżarzania; SD, odchylenie standardowe.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do dokładnej identyfikacji potencjalnie szkodliwych organizmów bez opóźnień czasowych stanowi kluczowy aspekt zarządzania gatunkami szkodników 9,10,26. Oprócz tego, że jest szybka, w przypadku produktów importowanych z roślin, idealna metoda identyfikacji szkodników powinna być łatwa do wykonania na miejscu w POE 8,26. W artykule przedstawiono protokół nowego testu LAMP do szybkiej identyfikacji B. tabaci, wirusa kwarantanny, często przechwytywanego na granicach europejskich (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt_annual-report _2016.pdf).

Przesłanką do opracowania testu diagnostycznego było zaprojektowanie łatwego do przestrzegania protokołu, który może być wykonywany podczas procedury kontroli importu roślin przez inspektorów zdrowia roślin przy minimalnym przeszkoleniu laboratoryjnym. Aby badanie na miejscu było tak szybkie i proste, jak to tylko możliwe, protokół jest podzielony na dwie części: przygotowanie gotowego do użycia zestawu i faktyczne wykonanie testu LAMP. Pierwsza część może być wykonana w laboratorium zewnętrznym, tak aby inspektor zdrowia roślin mógł przeprowadzić ekstrakcję DNA i test LAMP na miejscu, wykonując tylko jeden etap pipetowania.

Chociaż jest to tylko jeden krok, pipetowanie małych ilości płynu może być wyzwaniem dla użytkowników z niewielkim doświadczeniem laboratoryjnym lub bez niego. Aby rozwiązać ten problem, do roztworu ekstrakcyjnego dodaje się barwnik (czerwień krezolowa), aby operator mógł wizualnie potwierdzić, że niewielka ilość (tj . 2,5 μl) DNA jest prawidłowo przenoszona do odpowiedniej probówki. Kolejnym ważnym uproszczeniem protokołu jest aplikacja walidacyjna, która ułatwia wiarygodną interpretację odczytu LAMP (plik uzupełniający 1).

Nowy test B . tabaci LAMP został zwalidowany w warunkach laboratoryjnych i na miejscu poprzez testowanie próbek owadów przechwyconych podczas regularnego procesu kontroli przywozu w Szwajcarii8 . W sumie LAMP przeanalizował 80 okazów z trzech kontynentów: Afryki, Eurazji i Ameryki Północnej. Spośród 80 próbek tylko trzy (3,8%) zostały błędnie zidentyfikowane (wyniki fałszywie ujemne)8. Analizując docelowe sekwencje DNA starterów próbek fałszywie ujemnych, stwierdzono, że były to nowe haplotypy B. tabaci, które do tej pory nie zostały opisane8. Na podstawie tych wyników zestaw podkładów B. tabaci LAMP został zmodyfikowany i pomyślnie poddany ponownej walidacji8.

Jednym z głównych ograniczeń każdej metody opartej na amplifikacji DNA, w tym LAMP, jest to, że identyfikują one tylko wstępnie zdefiniowane docelowe sekwencje DNA 8,27. Kompleksowa wiedza na temat zmienności genetycznej występującej w sekwencji docelowej startera ma zatem kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładności diagnostycznej 8,27. Informacje te są jednak często bardzo ograniczone, zwłaszcza w przypadku nowo pojawiających się gatunków szkodników8 . Chociaż rzadko, oczekuje się wyników fałszywie ujemnych spowodowanych mutacjami w sekwencji docelowej8. W przypadku niniejszego testu B. tabaci LAMP rozwiązaniem tego problemu jest połączenie z technologią opartą na kodowaniu kreskowym DNA, co jest strategią zrealizowaną w trakcie wdrażania tego testu diagnostycznego w POE Zurich Airport8. W tym przypadku wszystkie ujemne wyniki LAMP zostały ponownie przeanalizowane za pomocą kodu kreskowego DNA w zewnętrznym laboratorium8. W przypadku napotkania nowego haplotypu szkodnika, który nie został jeszcze opisany, startery LAMP można zmodyfikować przy użyciu sekwencji DNA wygenerowanej w procesie kodowania kreskowego8. W ten sposób wynikająca z tego utrata prędkości w przypadku ujemnego wyniku LAMP jest kompensowana w celu uzyskania maksymalnej dokładności diagnostycznej zapewnionej w tym dwuetapowym procesie8.

Koszty konfiguracji obecnego testu LAMP w POE wynoszą około 25 000 USD. Wraz z rosnącą liczbą testów LAMP opracowanych dla szkodników roślin (np. Erwinia amylovora, Flavescence dorée i Guignardia citricarpa) taka jednorazowa inwestycja wydaje się uzasadniona 13,15,28. Jednak protokół może potencjalnie zostać zmodyfikowany, aby jeszcze bardziej obniżyć te koszty. Na przykład, w przypadku etapu ekstrakcji DNA w temperaturze 95 °C zastosowany tutaj termomikser może zostać zastąpiony tańszą kąpielą wodną lub wykonując ten krok bezpośrednio w urządzeniu LAMP działającym w czasie rzeczywistym. Co więcej, etapy mieszania w wirze mogłyby być prawdopodobnie zastąpione przez ręczne przesuwanie probówek, a na etapie transferu DNA pipetor mógłby zostać zastąpiony sterylnymi pętlami inokulacyjnymi.

Przyszłe ulepszenia w zakresie szybkiej identyfikacji B. tabaci i ogólnie gatunków szkodników mogą polegać na wdrożeniu podejścia do sekwencjonowania na miejscu, które umożliwiłoby przeprowadzanie analiz kodów kreskowych DNA w punktach sprzedaży. Obiecującym systemem kandydującym do takiej implementacji jest technologia sekwencjonowania nanoporowego. Rzeczywiście, technologia ta została niedawno z powodzeniem wdrożona w ramach prób kodowania kreskowego DNA na miejscu w celu oceny różnorodności biologicznej lasu deszczowego 8,29,30. System identyfikacji za pomocą kodów kreskowych DNA na miejscu może całkowicie zastąpić potrzebę opracowywania ukierunkowanych testów diagnostycznych i ich walidacji. Umożliwia również zbieranie dodatkowych informacji o cechach szkodników, takich jak geny odporności na pestycydy8. Niemniej jednak, dopóki nowatorskie technologie sekwencjonowania nie zostaną rutynowo wdrożone, test B. tabaci LAMP stanowi szybką (<1 h) i dokładną metodę identyfikacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor Michael Andreou jest udziałowcem firmy OptiGene Limited, która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym artykule. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Annette Grendelmeier, Aurelii Drenovac, Cornelii Studer, Danielowi Frei, Elisabeth Razavi, Markusowi Oggenfussowi, Serainie Vonzun i Svenowi Moellerowi za udział w walidacji testu LAMP B. tabaci.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B. tabaci LAMP mieszanka podkładowaOptiGene Ltd.na życzenieDo przygotowania
B. tabaci LAMP kit
Wirówka MiniSpinEppendorf AG5452000010Do kilku etapów wirowania
Cresol red (czerwony barwnik)Sigma-Aldrich Corp.114472Składnik roztworu do ekstrakcji DNA
Eppendorf ThermoMixerEppendorf AG5382000015Do ekstrakcji DNA
Genie II (urządzenie do analizy LAMP na miejscu)OptiGene Ltd.Dżin® IIDo analizy LAMP
Genie Strips (8-rurkowe paski LAMP)OptiGene Ltd.OP-0008-50Do przygotowania
B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master MixQiagen AG203443Do generowania kontroli amplifikacji dodatniej
Labcycler (Thermocycler)SensoQuest GmbH,
dystrybuowany przez Witec AG		011-103Do ekstrakcji DNA
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal MastermixOptiGene Ltd.ISO-001LNLDo przygotowania zestawu
do odczytu B. tabaci LAMP
Mini wirówka Labnet PrismLabnet International Inc.C1801Do kilku etapów wirowania
NucleoFast 96 PCRMarcherey-Nagel GmbH743500.4Do czyszczenia dodatniej kontroli amplifikacji
Roztwór wodorotlenku potasuSigma-Aldrich Corp.319376Składnik roztworu do ekstrakcji DNA
Qbit Fluorometer 3Thermo Fisher Scientific Corp.Q33226Do pomiaru współtrwania DNA
kontroli pozytywnej
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854Do czyszczenia kontroli amplifikacji dodatniej
Probówki Safe-Lock 0,5 ml (probówka do mikrowirówki)Eppendorf AG0030 121.023Do ekstrakcji DNA
Probówki Safe-Lock 2,0 ml (probówka do mikrowirówki)Eppendorf AG0030 120.094Do przygotowania
zestaw do odczytu B. tabaci LAMP
Wykałaczki do drewnaVWR International LLC470226-594Do ekstrakcji DNA
Vortex-Genie 2 (Vortex)Scientific Industries Inc.SI-0236Do kilku etapów mieszania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  2. Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
  3. Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
  4. Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
  5. Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
  6. Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
  7. Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689(2012).
  8. Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
  9. Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
  10. Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
  11. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63(2000).
  12. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
  13. Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
  14. Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238(2017).
  15. Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
  16. Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
  17. Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
  18. Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
  19. Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
  20. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
  21. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en GenBank. Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).
  23. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  24. Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
  25. Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
  26. Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
  27. Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
  28. Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
  29. Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
  30. Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja DNAidentyfikacja na miejscuinspektorzy zdrowia ro linszybkie narz dzie diagnostycznewykrywanie inwazyjnych szkodnik wwalidacja LAMPszwajcarska kontrola importu

Powiązane artykuły