Artykuł metodologiczny

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58509

⸱

26 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Streszczenie

Rekrutacja monocytów z krwi do docelowych tkanek obwodowych jest kluczowa dla procesu zapalnego podczas uszkodzenia tkanki, rozwoju guza i chorób autoimmunologicznych. Jest to możliwe dzięki procesowi wychwytywania ze swobodnego przepływu na powierzchnię światła aktywowanych komórek śródbłonka, a następnie ich adhezji i migracji przezśródbłonkowej (transmigracji) do leżącej poniżej dotkniętej tkanki. Jednak mechanizmy, które wspierają preferencyjną i zależną od kontekstu rekrutację subpopulacji monocytów, nadal nie są w pełni poznane. Dlatego opracowaliśmy metodę, która pozwala na jednoczesną wizualizację i pomiar rekrutacji różnych subpopulacji monocytów pod przepływem. Metoda ta, oparta na poklatkowym obrazowaniu konfokalnym, pozwala na jednoznaczne rozróżnienie monocytów adherentnych i transmigrujących. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do jednoczesnego badania kaskady rekrutacyjnej proangiogennych i nieangiogennych monocytów in vitro. Co więcej, metoda ta może zostać rozszerzona o różne etapy rekrutacji do trzech populacji monocytów.

Wprowadzenie

Monocyty stanowią fagocytarny składnik wrodzonej odporności, który jest niezbędny do zwalczania patogenów, oczyszczania uszkodzonych tkanek, angiogenezy i patofizjologii wielu chorób, w tym nowotworów1,2,3. Monocyty to komórki pochodzące ze szpiku kostnego złożone z heterogennych subpopulacji, które krążą we krwi, ale mogą być rekrutowane do miejsca zapalenia w tkance obwodowej za pomocą określonych mechanizmów molekularnych. Kaskady rekrutacji monocytów, podobnie jak w przypadku leukocytów w ogóle, implikują różne etapy, w tym wychwytywanie, toczenie, pełzanie, zatrzymanie, migrację przezśródbłonkową (transmigracja) i migrację przez ścianę naczynia (błona podstawna i komórki ścienne)4. Etapy te obejmują głównie cząsteczki wywołane stanem zapalnym na śródbłonkowej powierzchni światła, takie jak selektyny, ligandy glikoproteinowe, chemokiny, cząsteczki adhezyjne międzykomórkowe i połączeniowe oraz ich receptory na leukocytach, takie jak ligandy selektorynowe i integryny. Szlaki transportowe przez połączenia komórek śródbłonka (parakomórkowe) lub przez ciało komórki śródbłonka (transkomórkowe) mogą być wykorzystywane przez leukocyty do przekraczania bariery śródbłonka5. Chociaż historycznie udokumentowano, że monocyty migrują drogą transkomórkową, zaproponowano potencjalne rozbieżności w ich szlaku migracyjnym, ponieważ monocyty nie są już uważane za jednorodną populację komórek. Obecnie staje się jasne, że różnorodność monocytów może być definiowana przez każdą z ich różnic i cech wspólnych, w odniesieniu do ich charakterystycznych kaskad wynaczynienia3,6. Dlatego, aby jednoznacznie rozróżnić subpopulacje monocytów, kluczowe jest zobrazowanie i fenotypowanie zachowania każdej z tych różnych subpopulacji podczas procesu rekrutacji.

Monocyty człowieka, świni, szczura i myszy zostały podzielone na subpopulacje fenotypowe z pewnymi przypisanymi funkcjami i specyficznymi zachowaniami migracyjnymi7,8,9. Na przykład u ludzi monocyty można podzielić na trzy podzbiory w oparciu o ich powierzchniową ekspresję CD14, koreceptora dla bakteryjnego lipopolisacharydu i CD16, receptora Fc-gamma III. Subpopulacje ludzkich monocytów obejmują klasyczne CD14 + CD16-, pośrednie CD14 + CD16 + i nieklasyczneCD14 dimCD16 + komórki6,9. Wykazano, że klasyczne monocyty CD14 + CD16- są głównie zapalne, podczas gdy pula monocytów CD16 + łącznie wykazuje ekspresję TIE2 i funkcję proangiogenną 10. Konsekwentnie, stymulacja komórek śródbłonka cytokinami zapalnymi α takimi jak ludzki czynnik martwicy nowotworów (TNF) lub interleukina (IL-1)beta (konwencjonalne zapalenie), jest wystarczająca do wywołania pełnej rekrutacji klasycznych monocytów CD14 + CD16. Jednak jednoczesne działanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)A i TNFα (zapalenie wywołane czynnikami angiogennymi) jest wymagane, aby sprowokować transmigrację puli proangiogennej monocyt<ów CD16 + sup class="xref">3. Historycznie rzecz biorąc, tradycyjny system Transwell w warunkach statycznych, równoległa komora przepływu płytowego i μ-suwakowe komory przepływowe były używane do ilościowej analizy rekrutacji jednej populacji leukocytów na raz in vitro11,12,13. Chociaż protokoły te zostały zweryfikowane, bardziej solidna metoda, która pozwoliła na jednoczesną analizę wielu subpopulacji monocytów, byłaby uważana za bardziej wnikliwą. Takie metodologie muszą uwzględniać wiele interakcji i różne częstości występowania w każdej populacji, a także zapewniać mechanistyczne zrozumienie podobieństw i specyfiki kaskad rekrutacyjnych, które definiują każdy podzbiór monocytów.

Tutaj prezentujemy metodę opartą na obrazowaniu poklatkowym rekrutacji monocytów w przepływie, która pozwala na jednoczesne badanie kaskad migracyjnych różnych subpopulacji monocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta integruje pewne krytyczne cechy, które naśladują zapalenie komórek śródbłonka, a także hemodynamikę krążących monocytów w żyłkach pozakapilarnych, głównym miejscu rekrutacji leukocytów in vivo. Proponowana metoda wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które są generowane za pomocą dobrze ugruntowanego protokołu izolacji od ludzkiej pępowiny. Ten zasób kliniczny ma tę zaletę, że jest łatwo dostępny jako biologiczny produkt uboczny, a jednocześnie zapewnia rozsądną wydajność komórek śródbłonka, które można wyizolować z żyły pępowinowej. Użyliśmy również barwników fluorescencyjnych i immunofluorescencji, aby rozróżnić różne składniki komórkowe, oraz mikroskopii konfokalnej, aby jednoznacznie określić pozycjonowanie monocytów (luminalne vs. abluminalne) w czasie. Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu jednoczesnego pomiaru poziomów transmigracji subpopulacji monocytów. Ponadto należy zauważyć, że metodologia ta może zostać rozszerzona o badanie innych subpopulacji leukocytów i procesów rekrutacji przy użyciu różnych biomarkerów i znakowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Materiały pochodzenia ludzkiego zostały wykorzystane za świadomą zgodą ochotników i zgodnie z wytycznymi Szwajcarskich Komitetów Etycznych ds. badań klinicznych.

1. Izolacja i zamrażanie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

  1. Przed rozpoczęciem izolacji HUVEC dodać do kolby T75 5 mL roztworu powlekającego (0,1 mg/mL kolagenu G i 0,2% żelatyny w PBS o pH 7,4) i inkubować przez 30 min w 37 °C.
  2. Przepłukać pępowinę PBS, wytrzeć sterylnymi kompresami i umieścić w sterylnym naczyniu Petriego o średnicy 20 cm. Odciąć końce pępowiny sterylnymi nożyczkami.
  3. Zidentyfikować jedną dużą żyłę oraz dwie małe tętnice. Delikatnie wprowadzić kaniulę z przymocowanym kurkiem trójdrożnym do końców żyły na końcach pępowiny.
  4. Mocno zabezpieczyć połączenie pępowiny z kaniulą za pomocą kawałka drutu.
  5. Przepłukać pępowinę dwukrotnie 20 mL medium RPMI zawierającego 10 U/mL penicyliny, 10 U/mL streptomycyny oraz 250 ng/mL amfoterycyny B, aby oczyścić żyły pępowiny. Proces ten sprawia, że pępowina staje się bielsza i bardziej przejrzysta. Przed dodaniem kolagenazy opróżnić żyłę, zbierając medium RPMI strzykawką z jednego końca.
  6. Przepłukać żyłę 12 mL kolagenazy typu I o stężeniu 1 mg/mL (przefiltrowanej przez filtr 0,2 µm).
  7. Zamknąć kurek na końcach pępowiny i inkubować pępowinę w 37 °C przez 12 min.
  8. Delikatnie masować pępowinę, aby odseparować komórki śródbłonka z światła żyły.
  9. Pobrać 30 mL medium RPMI zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do strzykawki 50 mL i podłączyć ją do jednego końca pępowiny.
  10. Podłączyć pustą strzykawkę 50 mL do drugiego końca pępowiny.
  11. Otworzyć kurek i przepłukać żyłę z jednego końca, jednocześnie zbierając zawiesinę z drugiego końca.
    UWAGA: Zebrana zawiesina zawiera komórki śródbłonka.
  12. Odwirować tę zawiesinę komórkową przy 20 x g przez 5 min.
  13. Odlać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 10 mL kompletnego medium M19 (M19 zawierające 20% FCS, 15 µg/mL suplementów wzrostu komórek śródbłonka, 100 µg/mL heparyny sodowej, 0,5 µM hydrokortyzonu, 10 µg/mL kwasu L-askorbinowego, 10 U/mL penicyliny, 100 U/mL streptomycyny oraz 250 ng/mL amfoterycyny B).
  14. Usunąć roztwór powlekający z kolby T75 i przepłukać ją raz PBS.
  15. Zasiać komórki zebrane w kroku 1.13 do kolby T75 i umieścić ją w inkubatorze w 37 °C przy 5% CO2.
  16. Następnego dnia przepłukać kolbę 3 razy kompletnym medium M19, aby usunąć resztkowe krwinki czerwone, a następnie wymieniać medium co 2 dni aż do osiągnięcia konfluencji.
  17. Przy konfluencji 80–90% przepłukać monowarstwę HUVEC raz 5 mL PBS i odseparować komórki za pomocą 5 mL 0,05% trypsyny w 1 mM EDTA w 37 °C przez 5 min. Dodać 4 mL M19 i 1 mL FCS, aby zatrzymać działanie trypsyny. Przepłukać kolbę, aby odzyskać wszystkie komórki HUVEC.
  18. Pobrać alikwot 50 µL do barwienia na VE-cadherin, PECAM-1 oraz gp38 i analizować metodą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości HUVEC.
  19. Pozostałe komórki HUVEC z kroku 1.18 zebrać do probówki 15 mL i odwirować przy 20 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  20. Odlać supernatant z kroku 1.19, resuspendować osad komórkowy w roztworze do mrożenia (FCS zawierający 10% DMSO) przy gęstości 5 x 105 komórek/mL w probówkach kriogenicznych i zamrozić w -80 °C lub w ciekłym azotcie do czasu użycia.
  21. Aby sprawdzić czystość HUVEC:
    1. Do alikwotu 50 µL HUVEC zebranego w kroku 1.18 dodać 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego VE-cadherin-FITC, 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego PECAM1-PE oraz 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego Podoplanin-APC.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    3. Dodać 10 µL PBS i odwirować przy 400 x g przez 30 s.
    4. Odlać supernatant i resuspendować w 10 µL PBS. Dane można teraz pozyskać za pomocą technik cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Komórki HUVEC są pozytywne dla VE-cadherin i PECAM-1 oraz negatywne dla podoplaniny.

2. Rozmrażanie komórek HUVEC

UWAGA: Do eksperymentów należy używać komórek HUVEC o niskim numerze pasażu (maksymalnie 5 pasaży).

  1. Pokryć kolbę T75 1 mL roztworu do pokrywania w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Szybko rozmrozić HUVEC w temperaturze 37 °C przez 2 min i resuspenderać komórki w 10 mL kompletnego medium M19.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min i odrzucić nadsącz.
  4. Resuspenderać osad komórkowy w 10 mL kompletnego medium M19.
  5. Przenieść zawiesinę komórkową do uprzednio pokrytej kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Wymieniać medium hodowlane co 2 dni.

3. Hodowla HUVEC w komorze 0.4 µ-Slide

  1. Na pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu z przepływem, pokryj komory slajdu 0,4 µ przy użyciu 30 µL PBS zawierającego 0,1 mg/mL kolagenu G oraz 0,2% żelatyny w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Przepłucz komory 10 µL PBS.
  3. Odczep komórki z hodowli HUVEC w kolbie T75 przy konfluencji 80–90%.
  4. Opłucz HUVEC 5 mL PBS i odczep je za pomocą 5 mL 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  5. Wypłucz i zbierz zawiesinę komórkową do pełnej pożywki M199, a następnie policz komórki najwygodniejszą metodą. Wirować przy 20 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Resuspenduj osad komórkowy do stężenia 106 komórek/mL i rozdziel 30 µL (30 0 komórek) na każdą komorę.
  7. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 h.
  8. Dodaj 150 µL pełnej pożywki M199 do każdej komory i hoduj komórki przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Wymieniaj pożywkę co 2 dni.

4. Barwienie HUVEC do testu rekrutacji monocytów w warunkach przepływu

  1. Przygotować medium do znakowania składające się z M19 i 1 µM CMFDA (diacetat 5-chlorometylofluoresceiny) i podgrzać je w temperaturze 37 °C przez 5 min przed znakowaniem komórek.
  2. Przepłukać komórki HUVEC dwukrotnie podgrzanym do 37 °C medium M19.
  3. Zastąpić medium 30 µL podgrzanego medium do znakowania zawierającego 1 µM CMFDA i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min.
  4. Przepłukać raz kompletnym medium M19 i inkubować komórki w kompletnym medium M19 w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 min.
    UWAGA: Ważne jest usunięcie wszystkich śladów serum przed dodaniem roztworu znakującego, w przeciwnym razie może to wpłynąć na barwienie HUVEC.
  5. Zastąpić medium kompletnym medium M199 zawierającym ludzki TNFα (50 U/mL) lub mieszankę ludzkiego TNFα (50 U/mL) z ludzkim VEGFA (1 µg/mL) i inkubować przez 6 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

5. Izolacja monocytów z trzustki ludzkiej i barwienie subpopulacji

  1. Należy użyć warstwy leukocytowej (buffy coat) skoncentrowanej krwi ludzkiej lub 20 mL świeżo pobranej krwi ludzkiej, zebranej w dniu eksperymentu do probówek typu vacutainer z EDTA.
  2. Krew należy rozcieńczyć w PBS-1 mM EDTA (1:1), a następnie ostrożnie nanieść pipetą 20 mL rozcieńczonej krwi na 20 mL medium gradientu gęstości. Wirować przy 40 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej, z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania.
  3. Warstwę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) i płytek krwi (znajdującą się między medium gradientu gęstości a warstwą osocza) należy zebrać do nowej probówki 50 mL zawierającej 40 mL PBS- 1 mM EDTA. Uzupełnić objętość do 50 mL za pomocą PBS- 1 mM EDTA.
  4. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  5. Osad komórkowy należy zawiesić w 10 mL buforu do barwienia (PBS- 1 mM EDTA zawierający 0,5% albuminy surowicy bydlęcej BSA).
  6. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  7. Powtórzyć kroki 5.5 i 5.6.
  8. Osad komórkowy należy ponownie zawiesić w 10 mL buforu do barwienia. Pobrać alikwot 10 µL do pomiaru liczby komórek.
  9. Sprawdzić populacje PBMC i szybko policzyć komórki za pomocą cytometru przepływowego.
    UWAGA: Można zaobserwować charakterystyczne populacje limfocytów i monocytów (Rysunek 1A). Z 50 mL świeżej krwi ludzkiej można spodziewać się około 50-100 x 106 PBMC.
  10. W celu badania rekrutacji PBMC CD14+ versus CDMC CD14- w przepływie:
    1. Przemyć osad trzykrotnie buforem do przepływu (M19 zawierający 0,5% BSA) i zawiesić komórki mononuklearne w buforze do przepływu w stężeniu 6 x 106 komórek na mL.
    2. Przygotować alikwoty po 20 µL dla każdego testu. Inkubować w 37 °C do 20 min przed rozpoczęciem testu.
    3. Do każdego alikwotu dodać 5 µL przeciwciała anty-CD14-PE oraz Hoechst 3342 do końcowego stężenia 2 µM. Wymieszać i inkubować w 37 °C przez 10 min.
    4. Wirować alikwot przy 40 x g przez 30 s.
    5. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 200 µL buforu do przepływu.
  11. W celu badania rekrutacji subpopulacji monocytów w przepływie:
    1. Wyizolować monocyty za pomocą zestawu do izolacji wszystkich monocytów (pan monocyte isolation kit) zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Poniższy protokół izolacji jest przeznaczony dla 50 x 106 komórek. Można go skalować w górę lub w dół, o ile mieści się to w zaleceniach producenta.
    2. Suspensję PBMC wirować przy 20 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 40 µL buforu do barwienia.
    4. Dodać 50 µL odczynnika blokującego receptory Fc oraz 50 µL koktajlu przeciwciał Pan Monocyte.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    6. Dodać 400 µL buforu do barwienia i 10 µL przeciwciał anty-biotynowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    7. Dodać 2 mL buforu do barwienia i użyć kolumny MACS LS połączonej z magnesem.
    8. Umieścić kolumnę LS na magnesie i dodać 1 mL buforu do barwienia. Odrzucić przesącz.
    9. Przepuścić suspensję PBMC przez kolumnę i zebrać klarowny przesącz zawierający wszystkie monocyty do nowej probówki 15 mL.
    10. Dodać bufor do barwienia, aby uzupełnić objętość do 5 mL.
    11. Pobrać alikwot i sprawdzić jakość izolacji monocytów za pomocą cytometru przepływowego.
    12. Wyznaczyć liczbę wszystkich monocytów.
      UWAGA: Można zaobserwować wyłącznie populację monocytów (Rysunek 1B).
    13. Pozostałe monocyty z kroku 5.1.11 wirować przy 20 x g przez 5 min.
    14. Odrzucić supernatant.
    15. Zawiesić osad komórkowy w 5 mL buforu do przepływu (M19 zawierający 0,5% BSA).
    16. Powtórzyć kroki od 5.1.13 do 5.1.14 dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady EDTA.
  12. Przygotować suspensję monocytów w buforze do przepływu (M19 z 0,5% BSA) w stężeniu 6 x 106 komórek/mL.
  13. Przygotować alikwoty po 20 µL monocytów dla każdego testu rekrutacji.
  14. Przechowywać alikwoty w inkubatorze w 37 °C do 20 min przed wstrzyknięciem.
  15. Do każdego alikwotu dodać 5 µL przeciwciała anty-CD16-PE oraz Hoechst 342 (stężenie końcowe 2 µM).
  16. Wymieszać i inkubować w 37 °C przez 10 min.
  17. Wirować alikwot przy 40 x g przez 30 s.
  18. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 250 µL buforu do przepływu.
  19. Dodać 30 µL suspensji monocytów do jednej komory szkiełka, aby służyła ona do ustawienia parametrów akwizycji w mikroskopie konfokalnym.
  20. Przechowywać alikwoty suspensji monocytów z kroku 5.18 w 37 °C.
    UWAGA: Taka suspensja jest gotowa do wstrzyknięcia do systemu przepływowego.

6. Przygotowanie układu mikroprzepływowego

  1. Upewnij się, że inkubator komórkowy do obrazowania został ustawiony na 37 °C.
    UWAGA: Schemat układu przepływowego przedstawiono na Rysunek 2.
  2. Montaż części rurek I: Włóż męski konektor Luer do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 8 cm i grubości 3 mm), a drugi koniec podłącz do liniowego zestawu do wstrzykiwania Luer. Następnie podłącz wspomniany konektor Luer do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 40 cm i grubości 3 mm).
    UWAGA: Opcjonalnie, między liniowy zestaw wstrzykiwaczy Luer a rurkę silikonową można wstawić trójdrożny kran połączony z strzykawką o pojemności 5 ml w celu ewentualnego usunięcia pęcherzyków powietrza.
  3. Montaż drenów, część II: Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 1 m i grubości 3 mm). Do drugiego końca rurki wprowadź męski konektor Luer.
  4. Połącz wężyki z części I i części II, wkładając męskie końcówki Luer do żeńskiej złączki Luer lock (Rycina 2A).
  5. Umieść wolny koniec rurki silikonowej w zbiorniku zawierającym bufor przepływowy (M19 + 0,5% BSA) podgrzany do 37 °C.
  6. Pociągnij tłok strzykawki o pojemności 20 ml, aby napełnić przewody buforem przepływowym.
  7. Umieść strzykawkę w pompie i zabezpiecz ją.
  8. Ustaw pompę w trybie pobierania (w przeciwieństwie do trybu podawania) i określ szybkość przepływu.
  9. Wyznacz prędkość przepływu zgodnie z użytym szkiełkiem IBIDI, stosując następujący wzór:
    Równanie szybkości przepływu: naprężenie ścinające podzielone przez lepkość buforu i współczynnik slajdu; wzór dynamiki płynów.
    Uwaga: Współczynnik slajdu zależy od rodzaju slajdu IBIDI użytego w eksperymencie. Dla µ-slajd I0.4 W przypadku zastosowanego w tym przykładzie złącza Luer lock współczynnik przesunięcia wynosi 131,6. W celu uzyskania konkretnych współczynników przesunięcia należy odwiedzić stronę internetową firmy.14Lepkość buforu przepływowego wynosi 0,072 dyn·s/cm.2Naprężenie ścinające w żylkach posutylarnych wynosi około 0,5 dyn/cm².2.
  10. Podłącz preparat (Rycina 2B):
    1. Zaciśnij rurkę silikonową wokół żeńskiego łącznika Luer Lock i odłącz dwa męskie złącza Luer od łącznika.
    2. Podłączyć je do zbiorników na płytce zawierającej stymulowane komórki HUVEC i napełnić pożywką. Na tym etapie należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
    3. Zdejmij zaciski i upewnij się, że połączenie nie przecieka.
  11. Umieść preparat pod mikroskopem w celu wykonania obrazowania time-lapse i uruchom pompę.

7. Obrazowanie time-lapse rekrutacji monocytów w warunkach przepływu za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Do obrazowania użyj obiektywu 40x (patrz Tabela materiałów).
  2. Aktywuj lasery 405 nm (niebieskie jądra monocytów), 48 nm (zielone komórki śródbłonka) i 561 nm (czerwony podzbiór CD16+).
  3. Użyj komory zawierającej monocyty do ustawienia parametrów akwizycji.
    UWAGA: Aby wykryć zarówno monocyty nietransmigrowane, jak i transmigrowane, otwór pinhole oraz intensywność lasera 405 nm ustawiono na wysoką wartość. W związku z tym monocyty nietransmigrowane są słabo widoczne w płaszczyźnie podstawnej. Jednak tylko monocyty transmigrowane wykazują niebarwiony obszar wokół jądra, odpowiadający nowej przestrzeni zajmowanej pod komórkami śródbłonka.
  4. Umieść komorę do obrazowania pod mikroskopem.
  5. Wybierz 3 pola widzenia w promieniu 1 cm do konfokalnego obrazowania wielopunktowego.
  6. Zdefiniuj stronę podstawną i apikalną komórek śródbłonka.
  7. Ustaw z-stack w zakresie 10–12 µm (krok 0,5 µm). Przeprowadź akwizycję time-lapse co 1 min.
  8. Po 3 min obrazowania wstrzyknij 20 µL zawiesiny monocytów (6x106 komórek/mL) przez liniowy port wtryskowy Luer.
    UWAGA: Monocyty szybko pojawiają się w apikalnej płaszczyźnie ogniskowej, przylegają i rozpoczynają transmigrację (przechodzą z płaszczyzny apikalnej do podstawnej).
  9. Obrazuj przez co najmniej 30 min. Po zakończeniu przerwij obrazowanie i zatrzymaj przepływ. Zaciśnij rurki, aby odłączyć je od preparatu.
  10. Utrwal preparat 4% paraformaldehydem w 4 °C przez 10 min.
  11. Przemyj preparat buforem PBS i przechowuj w 4 °C do dalszej analizy, jeśli jest to wymagane.

8. Analiza danych w programie ImageJ

  1. Policz całkowitą liczbę przytwierdzonych monocytów w każdym polu widzenia. Wyznacz liczbę komórek na mm2.
  2. Policz ztransmigrowane monocyty znajdujące się w płaszczyźnie podstawnej pod komórkami śródbłonka, identyfikując je po obecności „czarnej dziury” (w kanale zielonym) wokół jądra komórkowego.
  3. Podziel liczbę ztransmigrowanych leukocytów przez całkowitą liczbę przytwierdzonych leukocytów. Wskaźnik transmigracji przedstawia się jako procent monocytów przytwierdzonych.
  4. W celach ilustracyjnych można jednocześnie pokazać stronę apikalną i podstawną, aby zobrazować zdarzenia zachodzące w każdym z tych przedziałów śródbłonka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Określanie stanu aktywacji HUVEC wywołanej przez TNFα

Bioaktywność cytokiny zapalnej TNFα może się różnić w zależności od partii oraz liczby cykli zamrażania i odmrażania. Ważne jest sprawdzenie stanu aktywacji HUVEC po traktowaniu TNFα. Można to przeprowadzić poprzez równoległe barwienie niektórych próbek konfluencyjnych HUVEC w celu oceny indukcji zapalnej selektyn, ICAM-1 oraz VCAM-115,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metodę szczegółowo opisującą badanie, w jaki sposób subpopulacje monocytów przemieszczają się przez monowarstwę śródbłonka objętą stanem zapalnym. W omawianej metodzie wykorzystano mikroskopię konfokalną zamiast mikroskopii z kontrastem fazowym, która jest również wykorzystywana do badania rekrutacji monocytów pod przepływem 3,11,19. Jedną z głównych zalet stosowania mikroskopii konfokalnej do obrazow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Paulowi Bradfieldowi za przeczytanie manuskryptu i informacje zwrotne. A. S. otrzymał wsparcie finansowe od Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust Reg.,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolby do hodowli tkankowych 75 cm2TPP90076Rutynowa hodowla izolowanych HUVEC
µ-Slide VI 0,4IBIDI80606
Probówki wirówkowe 15 mLTPP191015
Probówki wirówkowe 50 mLTPP191050
Collagen GBiochromL 7213Do powlekania hodowli komórkowych kolby
żelatynoweSigma-Aldrich1393Do powlekania kolb do hodowli komórkowych
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez MgCl2 i CaCl2)Sigma-AldrichD8537
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (z MgCl2 i CaCl2)Sigma-AldrichD8662
RPMI-1640 MediumSigma-AldrichR8758
3-drożne zawory odcinająceBIO-RAD7328103
penicylina 10 000 μ/ml streptomycyna 10 000 μ g/mL fungizone 25 μ/mLAMIMED4-02F00-H
Kolagenaza typu 1WorthingtonLS004216
Medium 199 1x avec Earle's salt, L-glutamina, 25 mM HepesGIBCO22340020
Albumina bydlęca frakcja VThermoFisher15260037
Suplement na wzrost komórek śródbłonka, 150 mgMilipore02-102
Heparyna Sól disodowa sodowaSigma-AldrichH3149RT
HydrokortyzonSigma-AldrichH6909
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA 4544
EDTA sól disodowa dwuwodna C10H14N2Na2O8 · 2H2OAPPLICHEMA2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), ludzki rekombinowany klon: REA199, FITCMiltenyi Biotech130-100-713AB_2655150
Przeciwciało CD31-PE, ludzki rekombinowany klon: REA730, PEMiltenyi Biotech130-110-807AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, ludzki rekombinowany klon: REA446, APCMiltenyi Biotech130-107-016AB_2653263
BD Accuri C6 PlusBD Bioscience
µ-Slide I LuerIBIDI80176
CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)ThermoFisherC2925
Rekombinowany ludzki TNF i alfa;Peprotech300-01A
Rekombinowana ludzka VEGFAPeprotech100-20
NE-1000 Programowalna pompa strzykawkowaKF TechnologyNE-1000
Ficoll  Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
Anty-ludzki CD14-PE, ludzki rekombinowany klon: REA599, PEMiltenyi Biotech130-110-519AB_2655051
Zestaw do izolacji Pan Monocyte, ludzkiMiltenyi Biotech130-096-537
Anty-ludzki CD16-PE, ludzki rekombinowany klon: REA423, PEMiltenyi Biotech130-106-762AB_2655403
kolumny LSMiltenyi Biotech130-042-401
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976
Hoechst 33342, Trichlorowodorek, trójwodzianThermoFisherH1399
Rurka silikonowaIBIDI10841
Złącze kolankowe LuerIBIDI10802
Żeńskie złącze Luer LockIBIDI10823
Złącze Luer Lock żeńskieIBIDI10825
Liniowy port wtrysku LuerIBIDI10820
Ar1 mikroskop konfokalnyNikon
40xobiektyw Nikon40x 0,6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3,6-2,8 mm korekcja 0-2 mm
ImageJ SoftwareNIH

Bibliografia

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355(2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekrutacja monocyt wcytometria przep ywowamikroskopia konfokalnastymulacja HUVECizolacja monocyt wmigracja transendotelialnaobrazowanie poklatkoweprzeciwcia o CD16TNF alfastymulacja VEGFA

Powiązane artykuły