Artykuł metodologiczny

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

DOI:

10.3791/58509

⸱

26 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekrutacja monocytów z krwi do docelowych tkanek obwodowych jest kluczowa dla procesu zapalnego podczas uszkodzenia tkanki, rozwoju guza i chorób autoimmunologicznych. Jest to możliwe dzięki procesowi wychwytywania ze swobodnego przepływu na powierzchnię światła aktywowanych komórek śródbłonka, a następnie ich adhezji i migracji przezśródbłonkowej (transmigracji) do leżącej poniżej dotkniętej tkanki. Jednak mechanizmy, które wspierają preferencyjną i zależną od kontekstu rekrutację subpopulacji monocytów, nadal nie są w pełni poznane. Dlatego opracowaliśmy metodę, która pozwala na jednoczesną wizualizację i pomiar rekrutacji różnych subpopulacji monocytów pod przepływem. Metoda ta, oparta na poklatkowym obrazowaniu konfokalnym, pozwala na jednoznaczne rozróżnienie monocytów adherentnych i transmigrujących. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do jednoczesnego badania kaskady rekrutacyjnej proangiogennych i nieangiogennych monocytów in vitro. Co więcej, metoda ta może zostać rozszerzona o różne etapy rekrutacji do trzech populacji monocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty stanowią fagocytarny składnik wrodzonej odporności, który jest niezbędny do zwalczania patogenów, oczyszczania uszkodzonych tkanek, angiogenezy i patofizjologii wielu chorób, w tym nowotworów1,2,3. Monocyty to komórki pochodzące ze szpiku kostnego złożone z heterogennych subpopulacji, które krążą we krwi, ale mogą być rekrutowane do miejsca zapalenia w tkance obwodowej za pomocą określonych mechanizmów molekularnych. Kaskady rekrutacji monocytów, podobnie jak w przypadku leukocytów w ogóle, implikują różne etapy, w tym wychwytywanie, toczenie, pełzanie, zatrzymanie, migrację przezśródbłonkową (transmigracja) i migrację przez ścianę naczynia (błona podstawna i komórki ścienne)4. Etapy te obejmują głównie cząsteczki wywołane stanem zapalnym na śródbłonkowej powierzchni światła, takie jak selektyny, ligandy glikoproteinowe, chemokiny, cząsteczki adhezyjne międzykomórkowe i połączeniowe oraz ich receptory na leukocytach, takie jak ligandy selektorynowe i integryny. Szlaki transportowe przez połączenia komórek śródbłonka (parakomórkowe) lub przez ciało komórki śródbłonka (transkomórkowe) mogą być wykorzystywane przez leukocyty do przekraczania bariery śródbłonka5. Chociaż historycznie udokumentowano, że monocyty migrują drogą transkomórkową, zaproponowano potencjalne rozbieżności w ich szlaku migracyjnym, ponieważ monocyty nie są już uważane za jednorodną populację komórek. Obecnie staje się jasne, że różnorodność monocytów może być definiowana przez każdą z ich różnic i cech wspólnych, w odniesieniu do ich charakterystycznych kaskad wynaczynienia3,6. Dlatego, aby jednoznacznie rozróżnić subpopulacje monocytów, kluczowe jest zobrazowanie i fenotypowanie zachowania każdej z tych różnych subpopulacji podczas procesu rekrutacji.

Monocyty człowieka, świni, szczura i myszy zostały podzielone na subpopulacje fenotypowe z pewnymi przypisanymi funkcjami i specyficznymi zachowaniami migracyjnymi7,8,9. Na przykład u ludzi monocyty można podzielić na trzy podzbiory w oparciu o ich powierzchniową ekspresję CD14, koreceptora dla bakteryjnego lipopolisacharydu i CD16, receptora Fc-gamma III. Subpopulacje ludzkich monocytów obejmują klasyczne CD14 + CD16-, pośrednie CD14 + CD16 + i nieklasyczneCD14 dimCD16 + komórki6,9. Wykazano, że klasyczne monocyty CD14 + CD16- są głównie zapalne, podczas gdy pula monocytów CD16 + łącznie wykazuje ekspresję TIE2 i funkcję proangiogenną 10. Konsekwentnie, stymulacja komórek śródbłonka cytokinami zapalnymi α takimi jak ludzki czynnik martwicy nowotworów (TNF) lub interleukina (IL-1)beta (konwencjonalne zapalenie), jest wystarczająca do wywołania pełnej rekrutacji klasycznych monocytów CD14 + CD16. Jednak jednoczesne działanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)A i TNFα (zapalenie wywołane czynnikami angiogennymi) jest wymagane, aby sprowokować transmigrację puli proangiogennej monocyt<ów CD16 + sup class="xref">3. Historycznie rzecz biorąc, tradycyjny system Transwell w warunkach statycznych, równoległa komora przepływu płytowego i μ-suwakowe komory przepływowe były używane do ilościowej analizy rekrutacji jednej populacji leukocytów na raz in vitro11,12,13. Chociaż protokoły te zostały zweryfikowane, bardziej solidna metoda, która pozwoliła na jednoczesną analizę wielu subpopulacji monocytów, byłaby uważana za bardziej wnikliwą. Takie metodologie muszą uwzględniać wiele interakcji i różne częstości występowania w każdej populacji, a także zapewniać mechanistyczne zrozumienie podobieństw i specyfiki kaskad rekrutacyjnych, które definiują każdy podzbiór monocytów.

Tutaj prezentujemy metodę opartą na obrazowaniu poklatkowym rekrutacji monocytów w przepływie, która pozwala na jednoczesne badanie kaskad migracyjnych różnych subpopulacji monocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta integruje pewne krytyczne cechy, które naśladują zapalenie komórek śródbłonka, a także hemodynamikę krążących monocytów w żyłkach pozakapilarnych, głównym miejscu rekrutacji leukocytów in vivo. Proponowana metoda wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które są generowane za pomocą dobrze ugruntowanego protokołu izolacji od ludzkiej pępowiny. Ten zasób kliniczny ma tę zaletę, że jest łatwo dostępny jako biologiczny produkt uboczny, a jednocześnie zapewnia rozsądną wydajność komórek śródbłonka, które można wyizolować z żyły pępowinowej. Użyliśmy również barwników fluorescencyjnych i immunofluorescencji, aby rozróżnić różne składniki komórkowe, oraz mikroskopii konfokalnej, aby jednoznacznie określić pozycjonowanie monocytów (luminalne vs. abluminalne) w czasie. Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu jednoczesnego pomiaru poziomów transmigracji subpopulacji monocytów. Ponadto należy zauważyć, że metodologia ta może zostać rozszerzona o badanie innych subpopulacji leukocytów i procesów rekrutacji przy użyciu różnych biomarkerów i znakowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materiały ludzkie zostały użyte za świadomą zgodą darczyńców-ochotników i zgodnie ze szwajcarskimi komisjami etycznymi ds. badań klinicznych.

1. Izolacja i zamrażanie komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

  1. Dodać 5 ml roztworu powlekającego do kolby T75 (0,1 mg/ml kolagenu G i 0,2% żelatyny w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej PBS o pH 7,4) przez 30 minut w temperaturze 37 °C przed rozpoczęciem izolacji HUVEC.
  2. Wyczyść pępowinę PBS, przetrzyj ją sterylnymi kompresami i umieść na sterylnej szalce Petriego o średnicy 20 cm. Odetnij końce sznurka sterylnymi nożyczkami.
  3. Zidentyfikuj pojedynczą dużą żyłę i dwie małe tętnice. Delikatnie włóż kaniulę z przymocowanym do niej trójdrożnym kranem do końców żył na końcach pępowiny.
  4. Mocno dokręć przewód i połączenie kaniuli odcinkiem drutu.
  5. Dwukrotnie przepłucz pępowinę 20 ml pożywki RPMI zawierającej 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B, aby przepłukać żyły pępowiny. Ten proces sprawia, że wygląd sznurka jest bielszy i wyraźniejszy. Opróżnij żyłę przed dodaniem kolagenazy, zbierając RPMI za pomocą strzykawki na jednym końcu.
  6. Perfundować żyłę 12 ml 1 mg/ml kolagenazy typu I (filtrowanej 0,22 μm).
  7. Zamknąć zawór odcinający na końcach przewodu i inkubować przewód w temperaturze 37 °C przez 12 minut.
  8. Delikatnie masuj pępowinę, aby oderwać komórki śródbłonka od światła żyły.
  9. Weź 30 ml RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i podłącz ją do jednego końca pępowiny.
  10. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 50 ml do drugiego końca pępowiny
  11. Otworzyć kran i przepłukać żyłę z jednego końca, jednocześnie zbierając odwrotnie z drugiego końca.
    nuta: Pobrana zawiesina zawiera komórki śródbłonka.
  12. Odwirować tę zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.
  13. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml kompletnej pożywki M199 (M199 zawierającej 20% FCS, 15 μg/ml suplementów na wzrost komórek śródbłonka, 100 μg/ml heparyny sodu, 0,5 μM hydrokortyzonu, 10 μg/ml kwasu L-askorbinowego, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B).
  14. Usunąć roztwór powlekający z kolby T75 i przepłukać raz PBS.
  15. Komórki pobrane z kroku 1.13 należy wysiać do kolby T75 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  16. Następnego dnia przepłukać kolbę 3 razy kompletną pożywką M199 w celu usunięcia resztek czerwonych krwinek, a następnie zmieniać pożywkę co 2 dni, aż do zbiegu.
  17. Przy 80–90% konfluencji przepłucz monowarstwę HUVEC raz 5 ml PBS i odłącz komórki 5 ml 0,05% trypsyny w 1 mM EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 4 ml M199 i 1 ml FCS, aby zatrzymać działanie trypsyny. Przepłukać kolbę, aby odłączyć cały HUVEC.
  18. Zebrać podwielokrotność 50 μl do barwienia VE-kadheryny, PECAM-1 i gp38 i przeanalizować metodą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości HUVEC.
  19. Zebrać pozostałość HUVEC z kroku 1.18 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  20. Odrzucić supernatant z kroku 1.19, ponownie zawiesić osad komórek w roztworze zamrażającym (FCS zawierającym 10% DMSO) o gęstości 5 x 105 komórek/ml w krioprobówkach i zamrozić w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie do czasu użycia.
  21. Aby sprawdzić czystość HUVEC:
    1. Dodać 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego VE-kadheryna-FITC, 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego PECAM1-PE i 1 μl przeciwciała anty-ludzkiej Podoplaniny-APC do podwielokrotności 50 μl HUVEC pobranej w kroku 1.18.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Dodać 100 μl PBS i wirować przy 400 x g przez 30 s.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl PBS. Dane można teraz pozyskiwać za pomocą technik cytometrii przepływowej.
      nuta: HUVEC są dodatnie dla VE-kadheryny i PECAM-1 oraz ujemne dla podoplaniny.

2. Rozmrażanie HUVEC

UWAGA: Używaj HUVEC przy niskim przejściu do eksperymentów (maksymalnie 5 przejść).

  1. Pokryć kolbę T75 1 ml roztworu powlekającego w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Szybko rozmrozić HUVEC w temperaturze 37 °C przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pełnego M199.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnego M199.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie powlekanej kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2 dni.

3. Hodowla HUVEC w komorze 0,4 μ-Slide

  1. Pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu przepływowego należy wstępnie pokryć komory szkiełka o masie 0,4 μ 30 μl PBS zawierającego 0,1 mg/ml kolagenu G, 0,2% żelatyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Umyć komory 100 μl PBS.
  3. Odłączyć komórki od 80–90% zlewającego się HUVEC kolby T75.
  4. Przepłukać HUVEC 5 ml PBS i odłączyć je od 5 ml 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C na 5 minut.
  5. Przepłukać i zebrać zawiesinę komórek w kompletnym M199 i policzyć komórki najwygodniejszą metodą. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić osad komórkowy przy 106 komórkach/ml i rozprowadzić 30 μl (30 000 komórek) na komorę.
  7. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.
  8. Dodać 150 μl kompletnego M199 do każdej komory i hodować komórki przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 dni.

4. Barwienie HUVEC do testu rekrutacji monocytów pod przepływem

  1. Przygotować pożywkę do etykietowania wykonaną z M199 i 1 μM CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny) i ogrzać ją w temperaturze 37 °C przez 5 minut przed etykietowaniem komórek.
  2. Umyć HUVEC dwukrotnie podłożem M199 podgrzanym w temperaturze 37 °C.
  3. Zastąp pożywkę 30 μl podgrzanej pożywki etykietowej zawierającej 1 μM CMFDA i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 10 minut.
  4. Przemyć raz kompletnym M199 i inkubować komórki z kompletnym M199 w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 min.
    nuta: Ważne jest, aby usunąć wszelkie ślady surowicy przed dodaniem roztworu do znakowania, w przeciwnym razie może to zmienić barwienie HUVEC.
  5. Zastąp pożywkę kompletnym M199 zawierającym ludzki TNFα (500 U/ml) lub mieszaninę ludzkiego TNFα (500 U/ml) z ludzkim VEGFA (1 μg/ml) przez 6 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

5. Izolacja ludzkich monocytów Pan i barwienie subpopulacji

  1. Użyj albo kożucha z zagęszczonej krwi ludzkiej, albo 20 ml świeżo wyizolowanej krwi ludzkiej, pobranej w dniu eksperymentu w probówkach próżniowych EDTA.
  2. Rozcieńczyć krew w PBS-1 mM EDTA (1:1) i delikatnie odpipetować 20 ml rozcieńczonej krwi na wierzchu 20 ml pożywki o gradiencie gęstości. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wolnym przyspieszaniem i bez hamowania.
  3. Zebrać warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) - płytek krwi (między pożywką gradientu gęstości a warstwami osocza) do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml PBS-1 mM EDTA. Uzupełnij do 50 ml PBS-1 mM EDTA.
  4. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml buforu barwiącego (PBS-1 mM EDTA zawierający 0,5% albuminy surowicy bydlęcej BSA).
  6. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  7. Powtórz kroki 5.5 i 5.6.
  8. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml buforu barwiącego. Pobrać podwielokrotność 10 μl na liczbę komórek.
  9. Sprawdź populacje PBMC i szybko policz komórki za pomocą cytometru przepływowego.
    nuta: Można zaobserwować charakterystyczne populacje limfocytów i monocytów (Rysunek 1A). Z 50 ml świeżej krwi ludzkiej spodziewaj się około 50-100 x 106 PBMC.
  10. Do rekrutacji CD14+ w porównaniu z CD14-PBMC w przepływie:
    1. Przepłukać osad trzykrotnie buforem przepływowym (M199 zawierającym 0,5% BSA) i ponownie zawiesić komórki jednojądrzaste w buforze przepływowym w ilości 6 x 106 komórek na ml.
    2. Wykonać podwielokrotności po 200 μl dla każdego testu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut przed badaniem.
    3. Do każdej podwielokrotności dodać 5 μl anty-CD14-PE i Hoechst 33342 w końcowym stężeniu 2 μM. Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    4. Odwirować podwielokrotność przy 400 x g przez 30 s.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 200 μl buforu przepływowego.
  11. Do rekrutacji subpopulacji monocytów w przepływie:
    1. Wyizoluj monocyty za pomocą zestawu do izolacji monocytów zgodnie z instrukcjami producenta.
      nuta: Poniższy protokół izolacji dotyczy komórek 50 x 106. Można go skalować w górę lub w dół, o ile jest to zgodne z zaleceniami producenta.
    2. Odwirować zawiesinę PBMC o sile 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 400 μl buforu barwiącego.
    4. Dodać 50 μl odczynnika blokującego receptor Fc i 50 μl koktajlu przeciwciał Pan Monocyte.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    6. Dodać 400 μl buforu barwiącego i 100 μl sprzężonego z kulkami magnetycznymi przeciwciała antybiotyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    7. Dodaj 2 ml buforu barwiącego i użyj kolumny MACS LS sprzężonej z magnesem.
    8. Umieść kolumnę LS na magnesie i dodaj 1 ml buforu barwiącego. Odrzuć przepływ.
    9. Przepuścić zawiesinę PBMC w kolumnie i zebrać klarowny przepływ zawierający monocyty patelni w nowej probówce o pojemności 15 ml.
    10. Dodaj bufor do barwienia, aby uzupełnić do 5 ml.
    11. Weź podwielokrotność i sprawdź jakość izolacji monocytów za pomocą cytometru przepływowego.
    12. Określ liczbę monocytów na patelni.
      nuta: Można zaobserwować tylko populację monocytów (ryc. 1B).
    13. Odwirować pozostałe monocyty z etapu 5.11.11 przy 200 x g przez 5 minut.
    14. Odrzucić supernatant.
    15. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu przepływowego (M199 zawierającego 0,5% BSA).
    16. Powtórz 5.11.13 do 5.11.14 dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady EDTA.
  12. Wykonać zawiesinę monocytów w buforze przepływowym (M199 z 0,5% BSA) przy 6 x 106 komórek/ml.
  13. Wykonać podwielokrotności 200 μl monocytów dla każdego testu rekrutacyjnego.
  14. Podwielokrotność należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C do 20 minut przed wstrzyknięciem.
  15. Dodać 5 μl przeciwciała anty-CD16-PE i Hoechst 33342 (2 μM końcowy) do każdej podwielokrotności.
  16. Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  17. Odwirować podwielokrotność przy 400 x g przez 30 s.
  18. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 250 μl buforu przepływowego.
  19. Dodać 30 μl zawiesiny monocytów do jednej komory szkiełka, aby posłużyło do ustawienia parametrów akwizycji pod mikroskopem konfokalnym.
  20. Utrzymać podwielokrotności zawiesiny monocytów z etapu 5.18 w temperaturze 37 °C.
    nuta: Zawiesina ta jest gotowa do wstrzyknięcia do układu przepływowego.

6. Przygotowanie systemu fluidycznego

  1. Upewnij się, że inkubator komórek do obrazowania ustawionego na 37 °C.
    nuta: Schemat systemu przepływu jest pokazany w Rysunek 2.
  2. Zamontuj część rurki I: Włóż męskie złącze Luer do jednego końca kawałka silikonowej rurki (8 cm długości i 3 mm grubości) i podłącz drugi koniec do wbudowanego zestawu do wstrzykiwania Luer. Podłącz ostatnie złącze Luer do kawałka silikonowej rurki (40 cm i 3 mm grubości) na jednym końcu.
    nuta: Opcjonalnie 3-kierunkowy kran podłączony do strzykawki o pojemności 5 ml można włożyć między wbudowany zestaw do wstrzykiwań Luer a silikonową rurkę w celu ewentualnego usunięcia pęcherzyków powietrza.
  3. Zamontuj część rurki II: Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml do jednego końca silikonowej rurki (o długości 1 m i grubości 3 mm). Włóż męskie złącze Luer do drugiego końca rurki.
  4. Podłącz rurki części I i części II, wkładając męskie złącze Luer do żeńskiego łącznika Luer lock (Rysunek 2A).
  5. Umieścić wolny koniec rurki silikonowej w zbiorniku zawierającym bufor przepływowy (M199 + 0,5% BSA) ogrzanym w temperaturze 37 °C.
  6. Pociągnąć za tłok strzykawki o pojemności 20 ml, aby napełnić rurkę buforem przepływowym.
  7. Umieścić strzykawkę na pompie i zabezpieczyć ją.
  8. Ustaw pompę w trybie pobierania (w przeciwieństwie do zaparzania) i określ natężenie przepływu.
  9. Określić natężenie przepływu zgodnie z użytym suwakiem IBIDI, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    Uwaga: Współczynnik poślizgu zależy od szkiełka IBIDI użytego w eksperymencie. W przypadku zamka Luer μ-slide I0,4 użytego w tym przykładzie współczynnik poślizgu wynosi 131,6. Szczegółowe informacje na temat czynników poślizgu można znaleźć na stronie internetowej firmy14. Lepkość bufora przepływowego wynosi 0,0072 dyn.s/cm2. Naprężenie ścinające w żyłkach zakapilarnych wynosi około 0,5 dyn/cm2.
  10. Podłącz slajd (Rysunek 2B):
    1. Clamp silikonową rurkę wokół żeńskiego złącza Luer Lock i odłącz dwa męskie złącze Luer od łącznika.
    2. Podłącz je do zbiorników szkiełka zawierającego stymulowany HUVEC i napełnij medium. Na tym etapie unikaj pęcherzyków powietrza.
    3. Zdejmij zaciski i upewnij się, że połączenie nie przecieka.
  11. Umieść szkiełko pod mikroskopem w celu obrazowania poklatkowego i uruchom pompę.

7. Obrazowanie poklatkowe rekrutacji monocytów pod przepływem za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Do obrazowania należy używać obiektywu 40x (patrz tabela materiałów).
  2. Aktywuj lasery 405 nm (niebieskie jądra monocytów), 488 nm (zielone komórki śródbłonka) i 561 nm (czerwony podzbiór CD16+).
  3. Użyj komory, w której znajdują się monocyty, aby ustawić parametry akwizycji.
    nuta: Aby wykryć zarówno monocyty nietransmigrowane, jak i transmigrowane, otworek i intensywność lasera 405 nm są ustawione wysoko. Tak więc nietransmigrowane monocyty są nieznacznie widoczne w planie podstawnym. Jednak tylko transmigrujące monocyty mają niezabarwiony obszar wokół jądra odpowiadający nowej przestrzeni zajmowanej pod komórkami śródbłonka.
  4. Umieść komorę, która ma być pobrana, pod mikroskopem.
  5. Wybierz 3 pola widzenia w promieniu 1 cm, aby uzyskać wielopozycyjne obrazowanie konfokalne.
  6. Określ stronę podstawową i wierzchołkową komórek śródbłonka
  7. Ustaw stos z w zakresie 10–12 μm (co 0,5 μm). Uruchamiaj akwizycję poklatkową co 1 minutę.
  8. Po 3 minutach obrazowania wstrzyknąć 200 μl zawiesiny monocytów (6x106 komórek/ml) przez wbudowany port iniekcji Luer.
    nuta: Szybko monocyty pojawiają się w wierzchołkowej płaszczyźnie ogniskowej, przylegają i rozpoczynają transmigrację (przejście od wierzchołka do planu podstawnego).
  9. Obraz przez co najmniej 30 minut. Po zakończeniu przerwij obrazowanie i zatrzymaj przepływ. Clamp rurkę, aby odłączyć je od suwaka.
  10. Utrwalić szkiełko za pomocą 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  11. Umyć szkiełko za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze 4 °C do dalszej analizy, jeśli jest to konieczne.

8. Analizuj dane za pomocą ImageJ

  1. Policz całkowitą liczbę przylegających monocytów w każdym polu. Określ liczbę komórek na mm2.
  2. Policz transmigrujące monocyty, które są obecne w planie podstawowym pod komórkami śródbłonka i zidentyfikowane przez obecność czarnej (w zielonym kanale) wokół jądra.
  3. Podziel liczbę transmigrowanych leukocytów przez całkowitą liczbę przylegających leukocytów. Szybkość transmigracji jest przedstawiana jako procent przylegających monocytów.
  4. Dla ilustracji strona wierzchołkowa i podstawna mogą być pokazane jednocześnie, aby zilustrować zdarzenia zachodzące w każdym z tych śródbłonkowych przedziałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określanie stanu aktywacji HUVEC indukowanej przez TNFα

Bioaktywność cytokiny zapalnej TNFα może się różnić w zależności od partii i wypełnienia cyklu zamrażania-rozmrażania. Ważne jest, aby sprawdzić stan aktywacji HUVEC z leczeniem TNFα. Można to zrobić, barwiąc równolegle niektóre próbki konfluentnego HUVEC w celu indukcji stanu zapalnego selektyn, ICAM-1 i VCAM-115,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy metodę szczegółowo opisującą badanie, w jaki sposób subpopulacje monocytów przemieszczają się przez monowarstwę śródbłonka objętą stanem zapalnym. W omawianej metodzie wykorzystano mikroskopię konfokalną zamiast mikroskopii z kontrastem fazowym, która jest również wykorzystywana do badania rekrutacji monocytów pod przepływem 3,11,19. Jedną z głównych zalet stosowania mikroskopii konfokalnej do obrazow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Paulowi Bradfieldowi za przeczytanie manuskryptu i informacje zwrotne. A. S. otrzymał wsparcie finansowe od Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust Reg.,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolby do hodowli tkankowych 75 cm2TPP90076Rutynowa hodowla izolowanych HUVEC
µ-Slide VI 0,4IBIDI80606
Probówki wirówkowe 15 mLTPP191015
Probówki wirówkowe 50 mLTPP191050
Collagen GBiochromL 7213Do powlekania hodowli komórkowych kolby
żelatynoweSigma-Aldrich1393Do powlekania kolb do hodowli komórkowych
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez MgCl2 i CaCl2)Sigma-AldrichD8537
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (z MgCl2 i CaCl2)Sigma-AldrichD8662
RPMI-1640 MediumSigma-AldrichR8758
3-drożne zawory odcinająceBIO-RAD7328103
penicylina 10 000 μ/ml streptomycyna 10 000 μ g/mL fungizone 25 μ/mLAMIMED4-02F00-H
Kolagenaza typu 1WorthingtonLS004216
Medium 199 1x avec Earle's salt, L-glutamina, 25 mM HepesGIBCO22340020
Albumina bydlęca frakcja VThermoFisher15260037
Suplement na wzrost komórek śródbłonka, 150 mgMilipore02-102
Heparyna Sól disodowa sodowaSigma-AldrichH3149RT
HydrokortyzonSigma-AldrichH6909
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA 4544
EDTA sól disodowa dwuwodna C10H14N2Na2O8 · 2H2OAPPLICHEMA2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), ludzki rekombinowany klon: REA199, FITCMiltenyi Biotech130-100-713AB_2655150
Przeciwciało CD31-PE, ludzki rekombinowany klon: REA730, PEMiltenyi Biotech130-110-807AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, ludzki rekombinowany klon: REA446, APCMiltenyi Biotech130-107-016AB_2653263
BD Accuri C6 PlusBD Bioscience
µ-Slide I LuerIBIDI80176
CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)ThermoFisherC2925
Rekombinowany ludzki TNF i alfa;Peprotech300-01A
Rekombinowana ludzka VEGFAPeprotech100-20
NE-1000 Programowalna pompa strzykawkowaKF TechnologyNE-1000
Ficoll  Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
Anty-ludzki CD14-PE, ludzki rekombinowany klon: REA599, PEMiltenyi Biotech130-110-519AB_2655051
Zestaw do izolacji Pan Monocyte, ludzkiMiltenyi Biotech130-096-537
Anty-ludzki CD16-PE, ludzki rekombinowany klon: REA423, PEMiltenyi Biotech130-106-762AB_2655403
kolumny LSMiltenyi Biotech130-042-401
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976
Hoechst 33342, Trichlorowodorek, trójwodzianThermoFisherH1399
Rurka silikonowaIBIDI10841
Złącze kolankowe LuerIBIDI10802
Żeńskie złącze Luer LockIBIDI10823
Złącze Luer Lock żeńskieIBIDI10825
Liniowy port wtrysku LuerIBIDI10820
Ar1 mikroskop konfokalnyNikon
40xobiektyw Nikon40x 0,6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3,6-2,8 mm korekcja 0-2 mm
ImageJ SoftwareNIH

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355(2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monocyte RecruitmentFlow CytometryConfocal MicroscopyHUVEC StimulationMonocyte IsolationTransendothelial MigrationTime Lapse ImagingCD16 AntibodyTNF AlphaVEGFA Stimulation

Powiązane artykuły