Artykuł metodologiczny

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

DOI:

10.3791/58513

⸱

18 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Child Health, University of Arizona College of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of Bath, 3BARROW Neurological Institute at Phoenix Children's Hospital, 4Phoenix Veteran Affairs Healthcare System, 5Department of Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologia i immunohistochemia to rutynowe metody analizy do wizualizacji mikroskopijnej anatomii i lokalizacji białek w tkance biologicznej. W neurobiologii, a także w wielu innych dziedzinach naukowych, techniki te są stosowane. Immunohistochemię można przeprowadzić na tkance montowanej na szkiełku lub na odcinkach swobodnie pływających. Przygotowanie próbek montowanych na szkiełku jest procesem czasochłonnym. Następujący protokół techniki, zwanej Megabrain, skrócił czas potrzebny na kriosekcję i zamontowanie tkanki mózgowej nawet o 90% poprzez połączenie wielu mózgów w jeden zamrożony blok. Co więcej, technika ta zmniejszyła zmienność obserwowaną między rundami barwienia w dużym badaniu histochemicznym. Obecna technika została zoptymalizowana pod kątem wykorzystania tkanki mózgowej gryzoni w dalszych analizach immunohistochemicznych; Można go jednak zastosować w różnych dziedzinach naukowych, w których stosuje się kriosekcję.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiej metody, którą nazywamy Megabrain, opracowanej do kriosekcji wielu mózgów gryzoni jednocześnie do dalszych procedur immunohistochemicznych. Megabrain pozwala na produkcję pojedynczych szkiełek zawierających tkanki pochodzące od wielu zwierząt. Technika ta została zoptymalizowana do jednoczesnego wycinania odcinków koronalnych z 9 półkul dorosłego szczura lub 5 pełnych mózgów dorosłych. Dlatego technika ta ma największe zastosowanie w dużych badaniach immunohistochemicznych lub innych analizach wykonywanych na szkiełkowej tkance mózgowej z dużej kohorty zwierząt.

Immunohistochemia polega na użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, aby zrozumieć i scharakteryzować ich ekspresję oraz zmiany komórkowe w określonej tkance1,2,3. Zastosowanie immunohistochemii jest powszechne w badaniach neurologicznych, wśród innych dyscyplin naukowych, pomagając w komórkowym i molekularnym zrozumieniu mózgu4. Badania na dużą skalę z udziałem wielu zwierząt i sekcji mózgu mogą być zarówno zasobochłonne, jak i czasochłonne. W związku z tym istnieje wieloaspektowe uzasadnienie stojące za opracowaniem Megabrain: skrócenie czasu spędzonego na kriosekcji, montowaniu i barwieniu tkanek, przy jednoczesnym zużyciu mniejszej ilości odczynników. Co więcej, możliwość usprawnienia procesu i barwienia wielu mózgów w tej samej rundzie pomaga złagodzić część zmienności między partiami barwienia, co jest ograniczeniem immunohistochemii3. Ponadto sekcjonowanie Megabrain jest oszczędzającą czas alternatywą dla sekcji pojedynczych zamrożonych mózgów gryzoni i pozwala na szybkie porównanie tkanek między zwierzętami, a nawet grupami leczonymi za pomocą technik mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika Megabrain została zoptymalizowana przy użyciu całych i półwyciętych mózgów od dorosłych samców myszy C57Bl65, młodych szczurów Sprague-Dawley i dorosłych szczurów Sprague-Dawley, które zostały perfundowane przezsercowo solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS), a następnie 4% paraformaldehydu6. Podobne wyniki można osiągnąć u innych szczepów myszy i szczurów, u obu płci i w różnym wieku. W badaniu mającym na celu wygenerowanie danych do tego manuskryptu wykorzystano młode szczury Sprague-Dawley i zostało ono zatwierdzone przez University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee, a zwierzęta doświadczalne były pod opieką zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych7.

1. Krioprotekcja perfundowanych mózgów

  1. Po udanej perfuzji przezsercowej 6, zbierz pełną grupę brain6,8 od zwierząt i po utrwaleniu, umieszczając w 25 ml fiolce z 4% paraformaldehydem w PBS przez 24 godziny
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksycznym utrwalaczem tkanek; Obchodź się ostrożnie. Przenieś paraformaldehyd do specjalnie oznakowanego pojemnika na odpady, który określa jego stężenie i objętość wewnątrz okapu na opary chemiczne, a następnie przechowuj w pojemniku na odpady chemiczne do czasu utylizacji przez Dział Bezpieczeństwa Chemicznego lub odpowiednio przeszkolony personel.
  2. Po upływie 24 godzin, w dygestorium usunąć mózg z 4% paraformaldehydu za pomocą szpatułki. Przenieś mózg do fiolki zawierającej około 20 ml 15% roztworu sacharozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), aż mózg opadnie na dno fiolki (około 24 godzin).
  3. Następnie przenieś mózg do fiolki zawierającej około 20 ml 30% roztworu sacharozy w 1x TBS, aż mózg opadnie na dno fiolki (około 24-48 godzin).

2. Zamrożenie mózgu

  1. Umieść szklaną zlewkę o pojemności 500 ml na warstwie suchego lodu w wiaderku na lód. Wlać 300–400 ml izopentanu (2 metylobutanów) do szklanej zlewki.
  2. Pozwól, aby temperatura izopentanu osiągnęła temperaturę między -45 °C a -50 °C. Ściśle monitoruj i utrzymuj ten zakres temperatur za pomocą termometru, utrzymując go na stałym poziomie przez cały czas trwania procedury. Upewnij się, że odczyty temperatury są pobierane ze środka roztworu, a nie podczas dotykania dna lub boku zlewki.
  3. Na blacie napełnij jednorazową formę do zatapiania (patrz lista materiałów) około 1/2 masy Optimum Temperature (OCT; patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że w KTZ nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, usuń je szpatułką lub igłą.
  4. Usuń pierwszy mózg z fiolki z 30% sacharozą za pomocą szpatułki. W tym momencie należy zamrozić mózg w całości lub przeprowadzić go w półsekcji, w zależności od projektu badania.
    1. W przypadku mózgów poddanych półsekcji użyj nowej żyletki, aby wykonać czyste cięcie w tkance w celu oddzielenia półkul. Jeśli nie jest to wymagane w badaniu, usuń móżdżek i opuszki węchowe na tym etapie. Jeśli móżdżek jest potrzebny do badania, sugeruje się wycięcie płaskiego obszaru na tylnym końcu mózgu, aby pomóc mózgowi stać prosto w formie. Jeśli badanie wymaga tylko tkanki z zlokalizowanego regionu, można użyć matrycy mózgu gryzonia do zablokowania mózgu na podstawie znanych współrzędnych.
  5. Daj mózgom numeryczny system nazewnictwa. Narysuj diagram, jak pokazano na Rysunek 1. Napisz numer pierwszego mózgu, który zostanie umieszczony w formie Megabrain w pozycji 2, pozostawiając pozycję 1 jako puste miejsce, aby pomóc w szybkiej identyfikacji orientacji, w której mózgi zostały zamrożone.
  6. Za pomocą kleszczy lub pęsety podnieś mózg, który ma zostać umieszczony w pozycji 1. Ustaw mózg tak, aby strona, która ma być przecięta, była skierowana do góry. Opuść mózg do OCT w odpowiednim miejscu, używając pęsety, aby dostosować jego położenie, aż stanie niezależnie.
  7. Powtórz kroki 2.3–2.5 dla pozostałych mózgów/półkul, które mają zostać zamrożone w pozycjach 3–10. Unikaj umieszczania mózgów/półkul w układzie symetrycznym.
  8. Przejrzyj wszystkie 9 mózgów w formie Megabrain. Gdy mózgi staną niezależnie, pionowo i są prawidłowo zorientowane w OCT (jak pokazano na Rysunek 2B), dodaj więcej OCT do formy (aż górna część mózgów zostanie pokryta). Ponownie upewnij się, że w KTZ nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.
  9. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać róg formy, upewniając się, że kleszcze nie zostaną częściowo zanurzone w OCT (Rysunek 3A). Uważając, aby forma była wypoziomowana, opuść formę do izopentanu (-45 °C do -50 °C) tak, aby dolna jedna trzecia formy była zanurzona. Przytrzymaj go tutaj, aby wszelkie pęcherzyki w OCT mogły unieść się na powierzchnię i odsunąć od tkanki (Rysunek 3B).
  10. Po 30 s opuść całą formę do izopentanu i uwolnij z kleszczy, pozostawiając Megabrain zanurzony na co najmniej 3 minuty (Rysunek 3C). Upewnij się, że pleśń jest utrzymywana na poziomie, aby mózgi pozostały wyprostowane i w równej odległości (Rysunek 3D).
  11. Po 3 minutach za pomocą kleszczy usuń z izopentanu pleśń zawierającą zamrożone, osadzone w OCT mózgi (Rysunek 3E).
  12. Natychmiast zawiń foremkę i jej zawartość w folię aluminiową i oznacz ją numerami zwierząt lub identyfikacją Megabrain. Dotykaj zamrożonego Megabrain tak oszczędnie, jak to możliwe, aby uniknąć rozmrożenia tkanki.
  13. Ten Megabrain można teraz przenieść do zamrażarki o temperaturze -20 °C i przechowywać przez co najmniej 24 godziny < br /> UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany, a Megabrain może być przechowywany w stanie zamrożonym do czasu kriosekcji.

3. Przygotowanie megamózgu do sekcji na kriostacie

  1. Ustaw temperaturę w komorze kriostatu na -19 °C. Upewnij się, że ta temperatura została osiągnięta, zanim przejdziesz dalej. Podczas sekcji należy upewnić się, że temperatura w szafie utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C.
  2. Wyjmij Megabrain z zamrażarki w temperaturze -20 °C i umieść go w kriostacie. Umieść również uchwyt o odpowiednich wymiarach i dwa pędzle z cienką końcówką w kriostacie. Pozostaw zarówno Megabrain, jak i uchwyt w kriostacie na co najmniej 15 minut, aby osiągnąć temperaturę kriostatu.
  3. Odpowiednio oznacz slajdy numerem identyfikacyjnym Megabrain i numerem slajdu. Połóż te szkiełka na podgrzewaczu do szkiełek (35–45 °C).
  4. Rozpakuj Megabrain z folii aluminiowej. Użyj żyletki, aby pionowo przyciąć rogi formy, aby umożliwić łatwe wyjęcie bloku OCT z formy (Rysunek 4A).
  5. Naniec cienką warstwę (o grubości około 3 mm) OCT na uchwyt.
  6. Szybko, przy minimalnym kontakcie między palcami a OCT, umieść Megabrain na uchwycie w pożądanej orientacji. Na tym etapie można również użyć dużych kleszczy, aby zminimalizować rozmrażanie. Przed rozpoczęciem cięcia pozostaw uchwyt mocowany Megabrain w kriostacie na 15–20 minut, aby OCT całkowicie zamarzło.
  7. Gdy warstwa podstawowa OCT zamarznie, nałóż warstwę OCT o grubości 2 mm wokół boków Megabrain i pozwól, aby spływała z boków na uchwyt. Pomaga to przymocować Megabrain do uchwytu. Ponownie, zanim przejdziesz dalej, pozostaw uchwyt zamontowany na Megabrain w kriostacie na 15-20 minut, aby OCT mógł zamarznąć.
  8. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z boków lub spodu uchwytu (Rysunek 4B).

4. Kriosekcja megamózgu

  1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępna jest zlewka zawierająca co najmniej 20 ml 1x PBS.
  2. Umieść uchwyt, zamontowany za pomocą Megabrain, w głowicy uchwytu na kriostacie (Rysunek 4B).
  3. Ustaw kriostat tak, aby cięł na żądaną grubość. Obecna metodologia została zoptymalizowana dla przekrojów od 10 μm do 50 μm.
  4. Przytnij OCT i tkankę w razie potrzeby, aby dotrzeć do pożądanego obszaru mózgu do pobrania tkanki (Rysunek 4C).
  5. Gdy będziesz gotowy do pobrania tkanki, opuść płytkę zabezpieczającą, aż oprze się na stoliku i obróć uchwyt kriostatu, aby pobrać pojedynczą sekcję. Powoli zdejmij płytkę stabilizacyjną, uważając, aby podzielony na sekcje Megabrain nie był przymocowany do płyty stabilizacyjnej i nie spadł ze sceny Rysunek 4D).
  6. Delikatnie użyj pędzli, aby rozwinąć sekcję Megabrain, aż będzie leżeć płasko na stole kriostatycznym (Rysunek 5A). (W razie potrzeby trzymaj OCT płasko za pomocą pędzli, aby zapobiec toczeniu się).
  7. Wyjmij slajd z podgrzewacza slajdów i najedź na slajd etykietą do dołu nad sekcją Megabrain na scenie, pozwalając sekcji przykleić się do slajdu.
  8. Szybko nałóż kroplę 1x PBS na każdy fragment tkanki na szkiełku i nie pozwól im wyschnąć, dopóki nie zostaną wyszczotkowane na płasko (patrz krok 4.9).
  9. Użyj pędzla z cienką końcówką zanurzonego w 1x PBS, aby wyszczotkować wszelkie pęcherzyki w tkance i rozłóż chusteczkę tak, aby leżała płasko na szkiełku (Rysunek 5B). Należy uważać, aby nie zmienić położenia sekcji mózgu, a tym samym nie stracić względnej pozycji w stosunku do innych sekcji tkanki. Manipuluj tkanką ostrożnie, aby uniknąć rozdarć. Skrawki mózgu należy trzymać z dala od krawędzi szkiełka, ponieważ w niektórych protokołach barwienia wymagana jest przestrzeń obwodowa do nałożenia szkiełka nakrywkowego i długopisu PAP.
  10. Umieść szkiełko z powrotem na podgrzewaczu do szkiełek i susz przez 45 minut. Przykryj w razie potrzeby, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na chusteczce. Po wyschnięciu szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywnym wynikiem końcowym tej procedury jest tkanka, która leży płasko na szkiełku, bez pęcherzyków i rozdarć, w orientacji, w której została zamrożona. Sekcje tkanek są równomiernie rozmieszczone i łatwe do zidentyfikowania dzięki dobremu umieszczeniu mózgu w OCT i dobrej notacji, jak pokazano na Rysunek 1. Zakładając, że tkanka mózgowa została pobrana od zwierząt w podobnym wieku i że tkanka była prawidłowo wyrównana w OCT, skrawki zebrane na szkiełku powinny repr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas tej procedury należy wziąć pod uwagę, że temperatura Megabrain i jego otoczenia musi być stale monitorowana, aby zapobiec rozmrożeniu i ponownemu zamrożeniu tkanki. Mózg można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -20 °C tylko do 3 razy, ponieważ za każdym razem, gdy jest dotykany i pozostawiany w kriostacie, przy cieplejszej zmiennej temperaturze, tkanka rozmraża się i ponownie zamarza, powodując galaretowatą teksturę i nieprawidłową integralność tkanek10. Dlatego optymalne jest wycięcie Mega...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundusze Wsparcia Misji PCH wsparły badania opisane w tym manuskrypcie. Autorzy pragną podziękować Danielowi Griffithsowi za wykonanie zdjęć wykorzystanych w rysunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Związek CRIO OCT Andwin scientific tissue-tek (przypadek 12)Fisher Scientific14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Jednorazowe formy do zatapianiaFisher Scientific18-41
Fisherbrand Precyzyjna prosta, szeroka, mocna pęseta / kleszczeFisher Scientific12-000-128
Fisherbrand 20 ml HDPE Fiolki scyntylacyjne z Nakrętka polipropylenowaFisher Scientific03-337-23
Sacharoza, butelka foliowa 2,5 kgFisher ScientificS2-212uzupełnić zarówno stężenie 15%, jak i 30% sacharozy.
2-metylobutan (certyfikowany), Fisher ChemicalFisher ScientificO3551-4
Zlewki wysokie PYREXFisher Scientific02-546E
Fisherbrand Uniwersalne termometry do cieczy w szkle z częściowym zanurzeniem (-50 do +50 ° C)Fisher Scientific13-201-642
Fisherbrand  Szpatułka ScoopulaFisher Scientific14-357Q
STANLEY ŻyletkaGrainger4A807
Ostrza do mikrotomu Edge-RiteFisher Scientific14-070-60
(1" frost) - białeFisher Scientific22-034-979
Gibco  PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) 10x, pH 7,2Fisher Scientific70-013-032Rozcieńczyć do 1X  przed użyciem
15-częściowe drobne pędzle malarskieAmazonB079J12ZRV
Długopis PAPabcamab2601
Uchwyt wiertarski pokazany na rysunku 4 został wykonany na zamówienie przez technika laboratoryjnego, jednak podobne rozmiary są dostępne do zamówienia w innych firmach na rynku.Mikroskopia elektronowaEMS065
Należy Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
  2. Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
  3. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  4. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  5. Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
  6. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  7. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).
  8. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  9. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
  10. Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
  11. Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika Megabrainmontowanie tkanekimmunohistochemiazatapianie w OCTmro enie w izopentanieprzygotowanie szkie eksekcjonowanie m zguanaliza histologiczna

Powiązane artykuły