Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58527

⸱

6 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.

Streszczenie

Odwracalna polimeryzacja łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT) łączy zalety polimeryzacji rodnikowej i polimeryzacji żywej. W pracy przedstawiono otrzymanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych funkcjonalizowanych metioniną metodą polimeryzacji RAFT. Po pierwsze, N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakrylamid-b-N-(3-aminopropylo)metakryloamid (BNHEMA-b-APMA, BA) zsyntetyzowano poprzez polimeryzację RAFT przy użyciu 4,4'-azobis(kwasu 4-cyjanoalerynowego) (ACVA) jako czynnika inicjującego i ditiobenzoesanu kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) jako czynnika przenoszącego łańcuch. Następnie otrzymano N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakrylamid-b-N-(3-guanidynopropylo)metakryloamid (metionina szczepiona BNHEMA-b-GPMA, mBG) poprzez modyfikację grup aminowych w APMA grupami metioniny i guanidyny. Dla porównania zsyntetyzowano trzy rodzaje polimerów blokowych, mBG1, mBG2 i mBG3. Do ilościowego określenia zawartości APMA zastosowano reakcję ninhydryny; mBG1, mBG2 i mBG3 miały odpowiednio 21%, 37% i 52% APMA. Wyniki chromatografii żelowej (GPC) wykazały, że kopolimery BA mają masę cząsteczkową 16 200 (BA1), 20 900 (BA2) i 27 200 (BA3) g/mol. Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA (pDNA) otrzymanych nośników genów kopolimeru blokowego. Współczynniki ładunków (N / P) wynosiły 8, 16 i 4, gdy pDNA było całkowicie skompleksowane odpowiednio z mBG1, mBG2, mBG3. Gdy stosunek N/P polipleksów mBG/pDNA był wyższy niż 1, potencjał Zeta mBG był dodatni. Przy stosunku N/P między 16 a 32 średnia wielkość cząstek polipleksów mBG/pDNA wynosiła od 100 do 200 nm. Ogólnie rzecz biorąc, praca ta ilustruje prosty i wygodny protokół syntezy nośnika kopolimeru blokowego.

Wprowadzenie

W ostatnich latach pojawiła się terapia genowa dla terapeutycznego dostarczania kwasów nukleinowych jako leków do leczenia wszelkiego rodzaju chorób1. Rozwój leków genowych, w tym plazmidowego DNA (pDNA) i małego interferującego RNA (siRNA), opiera się na stabilności i wydajności systemu dostarczania leków (DDS)2. Spośród wszystkich DDS, kationowe nośniki polimerowe mają zalety dobrej stabilności, niskiej immunogenności oraz łatwego przygotowania i modyfikacji, co daje kationowym nośnikom polimerowym szerokie perspektywy zastosowań3,4. Do praktycznych zastosowań w biomedycynie naukowcy muszą znaleźć kationowy nośnik polimerowy o wysokiej wydajności, niskiej toksyczności i dobrej zdolności celowania5. Spośród wszystkich nośników polimerowych, kopolimery blokowe są jednym z najczęściej stosowanych systemów dostarczania leków. Kopolimery blokowe są intensywnie badane pod kątem ich właściwości samoorganizacji i zdolności do tworzenia miceli, mikrosfer i nanocząstek w dostarczaniu leków5. Kopolimery blokowe mogą być syntetyzowane za pomocą żywej polimeryzacji lub metod chemii klik.

W 1956 roku Szwarc i in. poruszyli temat żywej polimeryzacji, definiując ją jako reakcję bez reakcji zrywania łańcuchów6,7. Od tego czasu opracowano wiele technik syntezy polimerów przy użyciu tej metody; W związku z tym żywa polimeryzacja jest postrzegana jako kamień milowy w nauce o polimerach8. Żywą polimeryzację można podzielić na żywą polimeryzację anionową, żywą polimeryzację kationową i odwracalną polimeryzację rodnikową z dezaktywacją (RDRP)9. Żywe polimeryzacje anionowe/kationowe mają ograniczony zakres zastosowania ze względu na ich surowe warunki reakcji10. Kontrolowana/żywa polimeryzacja rodnikowa (CRP) charakteryzuje się łagodnymi warunkami reakcji, wygodną dyspozycją i dobrą wydajnością, dlatego była głównym przedmiotem badań w ostatnich latach11. W CRP aktywne łańcuchy propagacyjne są odwracalnie pasywowane do uśpionych w celu zmniejszenia stężenia wolnych rodników i uniknięcia dwucząsteczkowej reakcji propagacji rodników łańcuchowych. Polimeryzacja addycyjna może być kontynuowana tylko wtedy, gdy nieaktywne uśpione łańcuchy rozmnożeniowe są odwracalnie ożywiane w rodniki łańcuchowe. Jako jedna z najbardziej obiecujących form polimeryzacji żywych rodników, polimeryzacja z odwracalnym przeniesieniem łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT) jest metodą mającą zastosowanie do otrzymywania polimerów blokowych o kontrolowanej masie cząsteczkowej i strukturze, wąskim rozkładzie masy cząsteczkowej i przenoszących grupy funkcyjne12. Kluczem do udanej polimeryzacji RAFT jest działanie środków przenoszących łańcuchy, zwykle ditioestrów, które mają bardzo wysoką stałą przenoszenia łańcucha.

W tym artykule, metoda polimeryzacji RAFT została zaprojektowana w celu przygotowania polimeru blokowego BNHEMA-b-APMA, przyjmując 4,4'-azobis(kwas 4-cyjanoalerynowy) (ACVA) jako czynnik inicjujący i ditiobenzoesan kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) jako czynnik przenoszący łańcuch. Polimeryzacja RAFT została użyta dwukrotnie w celu wprowadzenia BNHEMA do kationowych nośników polimerowych. Następnie grupy aminowe w łańcuchu APMA zmodyfikowano metioniną i odczynnikiem guanidynylowodorku chlorowodorku 1-amidinopirazolu. Dzięki wykorzystaniu ładunków dodatnich odczynnika guanidynylacji oraz struktury szkieletu polimeru metakryloamidu poprawiono efektywność wychwytu komórkowego otrzymanych nośników polimerów blokowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza polimeru BNHEMA (PBNHEMA)

  1. Rozpuść 1,87 g N, N-bis(2-hydroksyetyl)metakryloamidu (BNHEMA) w 1 mL wody destylowanej w butelce polimeryzacyjnej.
    UWAGA: Butelka polimeryzacyjna to kolba okrągłodenna z gumowym korkiem i mieszadłem magnetycznym.
  2. Rozpuść 0,03 g ditiobenzoianu kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) i 0,02 g 4,4’-azobis(kwasu 4-cyjanowalerianowego) (ACVA) w 0,5 mL 1,4-dioksanu w zlewce o pojemności 5 mL. Następnie dodaj roztwór CTP i ACVA do butelki polimeryzacyjnej z kroku 1.1.
  3. Odpowietrz układ reakcyjny w butelce polimeryzacyjnej azotem za pomocą trzech cykli zamrażania-pompowania-rozmrażania.
    1. Szczegółowo: zamroź roztwór w butelce polimeryzacyjnej przy użyciu pułapki kondensacyjnej, przymocuj butelkę polimeryzacyjną do statywu żelaznego, a następnie wytwórz próżnię i wpuść azot do mieszaniny reakcyjnej przez przewód zakończony igłą (igła nr 9, średnica wewnętrzna 0,65 mm, średnica zewnętrzna 0,9 mm). Zamknij butelkę polimeryzacyjną i rozmrażaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    2. Powtórz cykle zamrażania-pompowania-rozmrażania trzy razy.
  4. Umieść butelkę polimeryzacyjną w kąpieli olejowej o temperaturze 70 °C i pozostaw roztwór do reakcji na 24 h w atmosferze azotu.
  5. Ochłodź butelkę polimeryzacyjną do 0 °C i otwórz gumowy korek, aby przerwać proces polimeryzacji.
  6. Wstępnie ochłodź aceton w lodówce o temperaturze -20 °C przez 2 h, a następnie zmieszaj go z roztworem reakcyjnym z kroku 1.5 w stosunku 50:1 (v/v). Po tym czasie odwiruj próbkę przy 8 200 x g przez 10 min, aby usunąć aceton i zebrać osad.
  7. Aby oczyścić syntetyzowany PBNHEMA, rozpuść zebrany osad w 2 mL czystej wody, a następnie zmieszaj go ze 100 mL wstępnie ochłodzonego acetonu w stosunku 1:50 (v/v). Odwiruj roztwór przy 8 200 x g przez 10 min i zbierz osad. Powtórz ten proces trzy razy.
  8. Wysusz otrzymany PBNHEMA w suszarce próżniowej o temperaturze 50 °C. Po wysuszeniu zważ proszek na wadze. Oblicz wydajność zgodnie z Równaniem 1.
    Wzór na wydajność chemiczną, równanie: Wydajność (%) = masa PBNHEMA/masa BNHEMA × 100%. (1)
    UWAGA: W tym doświadczeniu uzyskana wydajność wyniosła 77,2%.

2. Synteza polimeru BNHEMA-b-APMA (BA)

  1. Rozpuścić 0,96 g chlorowodorku N-(3-aminopropyl)metakryloamidu (APMA) oraz 0,93 g PBNHEMA w 5 mL wody destylowanej w zlewce o pojemności 10 mL.
  2. Rozpuścić 0,01 g 4,4’-azobisu (kwasu 4-cyjanowalerianowego) (ACVA) w 0,5 mL 1,4-dioksanu i wymieszać z roztworem APMA-PBNHEMA z punktu 2.1.
  3. Przenieść mieszaninę do butelki polimeryzacyjnej i przedmuchać suchym azotem przez 1 h.
  4. Umieścić butelkę polimeryzacyjną w łaźni olejowej o temperaturze 70 °C i pozostawić do reakcji na 24 h w atmosferze azotu.
  5. Schłodzić butelkę polimeryzacyjną do 0 °C i otworzyć gumowy korek, aby przerwać proces polimeryzacji.
  6. Przenieść roztwór do schłodzonego acetonu z kroku 1.6, a następnie odwirować roztwór przy 8 200 x g przez 10 min w celu wytrącenia BA.
  7. Rozpuścić BA w 2 mL wody destylowanej i wytrącić polimer w schłodzonym acetonie. Powtórzyć czynność trzy razy.
  8. Wysuszyć otrzymany BA w suszarce próżniowej w temperaturze 50 °C i zważyć uzyskany proszek. Obliczyć wydajność zgodnie z Równaniem 2.
    Wzór na obliczanie wydajności polimeru; równanie chemiczne na schemacie badawczym, analiza wydajności masowej.
    UWAGA: W tym doświadczeniu wydajność obliczono na 82,0%.

3. Wyznaczenie procentowej zawartości molowej APMA w kopolimerze BA metodą ninhydrynową

UWAGA: Spektrofotometria jest wykorzystywana do oznaczania zawartości wieloskładnikowych aminokwasów. Zasada opiera się na reakcji barwnej ninhydryny z aminokwasem, w której absorbancja jest w pewnym stopniu skorelowana z zawartością aminokwasów13,14.

  1. Rozpuścić 5 g ninhydryny w 125 mL wrzącej wody destylowanej. Następnie rozpuścić 5 g witaminy C w 250 mL ciepłej wody destylowanej. Roztwór witaminy C (250 mL) dodawać kroplowo do roztworu ninhydryny podczas mieszania magnetycznego. Kontynuować mieszanie przez 15 min, a następnie schłodzić roztwór reakcyjny w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Wyjąć roztwór z lodówki i przefiltrować go metodą podciśnieniową przy użyciu lejka Büchnera w celu otrzymania ninhydryny zredukowanej. Zebrać osad i przechowywać go w dehydratorze z pięciotlenkiem fosforu.
  3. Rozpuścić 85 mg ninhydryny i 15 mg ninhydryny zredukowanej w 10 mL etylenglikolu monoetylotereu, aby przygotować roztwór barwiący z ninhydryną.
    UWAGA: Roztwór barwiący z ninhydryną może reagować z grupą α-amino w APMA i tworzyć fioletowy związek o strukturze opisanej w poprzednim badaniu15.
  4. Rozcieńczyć 1 mL roztworów monomeru APMA o stężeniach 0, 1, 10, 100, 1 000 mg/mL za pomocą 1 mL buforu octanowego (2 M, pH 5.4), a następnie dodać odpowiednio 1 mL roztworu barwiącego z ninhydryną.
  5. Ogrzewać mieszaniny przez 15 min w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia, a następnie schłodzić je pod bieżącą wodą. Pozostawić roztwory na 5-10 min, rozcieńczyć je 3 mL 60% alkoholu etylowego i dokładnie wymieszać. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru i wykreślić krzywą wzorcową (Równanie 3).
    Schemat równania spektrofotometrycznego do obliczania stężenia APMA na podstawie absorbancji przy 570 nm.
    UWAGA: Równanie 3 zostało wyprowadzone z dopasowania liniowego absorbancji przy 570 nm w funkcji stężenia APMA.
  6. Rozpuścić 0,01 g BA w 1 mL wody destylowanej; dodać 1 mL buforu octanowego (2 M, pH 5.4) i 1 mL roztworu barwiącego z ninhydryną. Obliczyć zawartość molową APMA na podstawie absorbancji przy 570 nm.
    Wzór na obliczanie masy molowej dla APMA w chemii, równanie dla stosunku stężenia i objętości.
    Wzór na masę molową BNHEMA w mmol; równanie z masami BA i APMA podzielonymi przez masę cząsteczkową. (5)
    Równanie stosunku molowego APMA w BA, zawierające wzór oparty na masie, edukacyjna treść wzoru.
    UWAGA: Formuły obliczeniowe są następujące (Równania 3-6).

4. Synteza polimeru BA szczepionego metioniną (mBA)

  1. Rozpuścić 8,9 mg Fomc-metioniny w 5 mL DMSO w kolbie do odzysku.
  2. Do kolby do odzysku dodać 6,92 mg chlorku 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDCl) oraz 4,86 mg 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) i prowadzić reakcję w temperaturze 0 °C przez 0,5 h.
  3. Rozpuścić 2,59 g BA w 5 mL roztworu DMSO, a następnie dodać 50 μL trimetyloaminy; dodać ten roztwór kroplami do kolby do odzysku (krok 4.2) i pozostawić roztwór do reakcji na 0,5 h w temperaturze pokojowej.
  4. Przeprowadzić dializę w celu usunięcia DMSO i trimetyloaminy z roztworu BA z kroku 4.3, używając worka do dializy (MWCO 10 kDa) w zlewce o pojemności 2 L przez 24 h; wymieniać wodę dejonizowaną co 6 h.
  5. Liofilizować otrzymane mBA i zważyć w celu obliczenia wydajności zgodnie z Równaniem 7.
    Wzór na wydajność do obliczeń bilansu masy; równanie dla oczyszczonego mBA w analizie chemicznej.
    UWAGA: W tym przypadku wydajność określono na poziomie 71%.
  6. Ilościowo oznaczyć mBA zawierające grupę NH2, mierząc absorbancję przy 570 nm, aby obliczyć ilość przeszczepionej metioniny. Obliczyć zawartość molową metioniny zgodnie z Równaniem 8.
    Równanie stosunku molowego; schemat dla metioniny w mBA; przydatne w analizie składu chemicznego.

5. Synteza polimeru BNHEMA-b-APMA guanidynowanego i sprzężonego z metioniną (mBG)

UWAGA: Zsyntetyzowano trzy różne kopolimery mBA1, mBA2 i mBA3. Kopolimer mBA3 został użyty jako przykład w poniższych krokach.

  1. Rozpuścić mBA zawierający 60 μmol grup aminowych w 5 mL czystej wody.
    UWAGA: Zawartość grup aminowych oznaczono metodą ninhydrynową, zgodnie z opisem w punkcie 3.5.
  2. Rozpuścić 40,6 mg (300 μmol) odczynnika do guanidynilacji, chlorowodorku 1-amidinopirazolu, w roztworach mBA.
  3. Dostosować pH do wartości 9,0 za pomocą nasyconego roztworu węglanu sodu i pozostawić do stabilizacji na 24 h w temperaturze pokojowej.
  4. Produkt mBG poddać dializie przeciwko wodzie dejonizowanej, używając worka dializacyjnego w zlewce (MWCO 10 kDa, 2 L), a następnie przechować w formie liofilizowanego proszku.
    Procentową wydajność obliczono na 85% zgodnie z Równaniem 8.
    Wzór na wydajność oczyszczania, masa oczyszczonego mBG podzielona przez masę mBA i odczynnika do guanidynilacji. (8)
  5. Rozpuścić proszek mBG w D2O w probówkach NMR i scharakteryzować go za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego 1H (1H NMR)16.

6. Przygotowanie i charakterystyka polipleksów mBG/pDNA

  1. Rozpuścić 50 μg pDNA w 50 μL wody wolnej od RNaz/DNaz.
  2. Rozpuścić 1 mg kopolimerów mBG w 1 mL wody wolnej od RNaz/DNaz.
  3. Dodać roztwór kopolimerów mBG bezpośrednio do roztworu pDNA zgodnie z różnymi stosunkami dozowania, tj. różnymi stosunkami N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 i 32:1).
    UWAGA: Stosunek N/P definiuje się jako stosunek molowy grup guanidynowych w polimerze do grup fosforanowych w pDNA, a konkretnie jako stosunek molowy łańcucha GPMA w polimerze do mononukleotydów w pDNA. Stosunek N/P oblicza się na podstawie mas cząsteczkowych azotu aminowego (N) w mBG i grupy fosforanowej (P) w pDNA.
  4. Wymieszać roztwory za pomocą mieszadła typu vortex i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie dyspergować mieszaninę w roztworze buforu fosforanowego (PBS, pH 7.4) i przechowywać otrzymane polipleksy mBG/pDNA w temperaturze 4 °C do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Średnią wielkość cząstek oraz potencjał Zeta mBG i kompleksów oznaczono metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)17.
  5. Rozcieńczyć 10 μL roztworów polipleksów mBG/pDNA w 1 mL PBS (pH 7.4) w kuwetach do pomiarów DLS i potencjału Zeta.
    UWAGA: Pomiary wielkości cząstek i potencjału Zeta przeprowadzono trzykrotnie, a następnie wyznaczono średnią z trzech wartości.

7. Eksperyment opóźnienia elektroforetycznego polipleksów mBG/pDNA

UWAGA: W celu określenia minimalnego stosunku ładunków przeprowadzono eksperyment z opóźnieniem elektroforetycznym.

  1. Przygotuj pięć grup poliplexów mBG/pDNA o różnych stosunkach N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 oraz 32:1) zawierających 50 μg pDNA .
  2. Do próbek poliplexów mBG/pDNA dodaj bufor do ładowania 6x do uzyskania stężenia końcowego 1x.
  3. Nanieś roztwory na żele agarozowe 1,5% i prowadź elektroforezę przy napięciu 90 mV przez 15 min, stosując pDNA jako kontrolę .
  4. Wykonaj zdjęcia żeli przy użyciu systemu obrazowania żeli.

8. Cytotoksyczność polipleksów mBG/pDNA

  1. Wysiać komórki MCF-7 na płytki 96-dołkowe z gęstością 104 komórek na dołek. Następnie hodować komórki przez 12 h w pożywce DMEM (10% FBS i 1% antybiotyku) w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2.
  2. Zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką DMEM bez antybiotyków, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz polipleksy mBG/pDNA o różnych stosunkach ładunku (N/P 4, 8, 16 i 32, n=6) na 6 h, przyjmując za kontrolę komórki z dodatkiem równych objętości roztworu PBS. Następnie zastąpić pożywkę hodowlaną 150 μL świeżej pożywki 1640 i kontynuować hodowlę komórek przez 24 h.
  3. Do płytek 96-dołkowych dodać roztwór 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolibromku (MTT) o stężeniu 5 mg/mL (20 μL/dołek) i dalej hodować komórki przez 4 h.
  4. Usunąć roztwór, dodać 150 μL DMSO do każdego dołka i wstrząsać płytkami 96-dołkowymi przez 30 s.
  5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia żywotności komórek. Obliczyć procentową żywotność komórek zgodnie z Równaniem 9.
    Żywotność komórek % = Wzór na stosunek OD dla polipleksów mBG/pDNA w analizie absorpcji komórkowej, przedstawiony jako równanie matematyczne. (9)

9. Efektywność transfekcji polipleksów mBG/ GFP-pDNA

  1. Rozpuścić 50 μg pDNA zawierającego gen reporterowy zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pDNA (GFP-pDNA) w 50 μL wody wolnej od RNaz/DNaz. Następnie rozpuścić 1 mg kopolimerów mBG w 1 mL wody wolnej od RNaz/DNaz. Wymieszać pDNA i roztwór mBG w stosunkach ładunku (N/P) 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 oraz 32:1 i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Rozproszyć roztwór polipleksów mBG/GFP-pDNA za pomocą fal ultradźwiękowych (30 s) i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Stosunek N/P oblicza się na podstawie masy cząsteczkowej azotu aminowego (N) w mBG oraz grupy fosforanowej (P) w pDNA.
  2. Zasiać komórki MCF-7 w zagęszczeniu 2 × 105 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i hodować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem przez 12 h.
  3. Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą polipleksy mBG/GFP-pDNA o różnych stosunkach N/P (4, 8, 16 i 32) na 6 h.
  4. Wymienić pożywkę na 2 mL świeżej pożywki RPMI1640 i hodować przez 48 h.
  5. Zebrać komórki i wykryć zieloną fluorescencję za pomocą cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

BNHEMA dozowano zgodnie z docelnym stopniem polimeryzacji przedstawionym w Tabeli 1; procedura syntezy mBG jest przedstawiona na Rysunku 1. W pierwszej kolejności przygotowano homopolimer BNHEMA metodą odwracalnego przeniesienia łańcucha z addycją i fragmentacją (RAFT) w układzie woda-dioksan, wykorzystując ditiobenzoesan kwasu 4-cyjanopentanowego jako czynnik przeniesienia łańcucha. Następnie PBNHEMA wykorzystano jako czynnik przeniesienia łańcucha do przygotowania polimeru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym wprowadzono serię blokowych polimerowych nośników genów kationowych BNHEMA-b-APMA. Te polimery blokowe zsyntetyzowano metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Segment hydrofilowy BNHEMA został wprowadzony w celu poprawy rozpuszczalności. Grupy metioniny i guanidyny zmodyfikowano w celu poprawy zdolności docelowej i skuteczności transfekcji5. Zwiększyła się zawartość łańcucha APMA, a guanidynyloacja w kopolimerze mBG zmniejszyła wielkość cząstek polipl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zaświadczają, że nie ma konfliktu interesów z żadną organizacją finansową w odniesieniu do materiału omawianego w tym artykule.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2016YFC0905900), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81801827, 81872365), Podstawowy Program Badawczy Prowincji Jiangsu (Fundacja Nauk Przyrodniczych, No. BK20181086) oraz Fundusz Badań Naukowych Szpitala Onkologicznego Jiangsu (nr ZK201605).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-hydroksybenzotriazolMacklin Biochemical Co., Ltd, ChinyH810970≥ 97,0%
1,4-dioksanOdczynnik chemiczny Sinopharm Co., Ltd, Chiny10008918
Chlorowodorek 1-amidinopirazoluAR Aladdin Co., Ltd., ChinyA10793598%
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu chlorowodorekAladdin Co., Ltd., ChinyE106172AR
4,4'-azobis(kwas 4-cyjanalerynowy)Aladdin Co., Ltd., ChinyA106307Odczynnik analityczny (AR)
4-cyjano-4-(fenylokarbomatiolotio)pentanowy KwasAladdin Co., Ltd., ChinyC132316>97% (HPLC)
Octanodczynnik chemiczny Sinopharm Co., Ltd, Chiny81014818AR
AcetonSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Chiny10000418AR
AgaroseAladdin Co., Ltd., ChinyA118881
Kwas askorbinowyAladdin Co., Ltd., ChinyA103533AR
DMSOAladdin Co., Ltd., ChinyD103272AR
Glikol etylenowyAladdin Co., Ltd., ChinyE103319AR
Chlorowodorek N-(3-aminopropylo)metakryloamiduAladdin Co., Ltd., ChinyN129096≥ 98,0% (HPLC)
N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakryloamidZaiQi Bio-Tech Co., Ltd, ChinyCF259748≥ 98,0% (HPLC)
NinhydrinAladdin Co., Ltd., ChinyN105629
bufor AR PBSAladdin Co., Ltd., ChinyP196986pH 7,4
Plazmidowe DNABIOGOT Co., Ltd, ChinypDNA-EGFPpDNA-EGFP
Plazmidowe DNABIOGOT Co., Ltd, ChinyPdnapDNA
Dekahydrat węglanu soduAladdin Co., Ltd., ChinyS112589AR
TrimethylamineAladdin Co., Ltd., ChinyT103285AR
o wysokiej rozdzielczości

Bibliografia

  1. Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
  2. Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
  3. Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
  4. Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
  5. Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969(2017).
  6. Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
  7. Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
  8. Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241(2015).
  9. Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
  10. Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
  11. Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
  12. Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
  13. Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
  14. Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
  15. Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
  16. Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
  17. Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioninąpolimeryzacja RAFTstosunek N/Ppotencjał zetawielkość cząstekcytometria przepływowatest MTTfluorescencja GFPłaźnia olejowa
Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.