Artykuł metodologiczny

Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA

DOI:

10.3791/58527

⸱

6 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odwracalna polimeryzacja łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT) łączy zalety polimeryzacji rodnikowej i polimeryzacji żywej. W pracy przedstawiono otrzymanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych funkcjonalizowanych metioniną metodą polimeryzacji RAFT. Po pierwsze, N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakrylamid-b-N-(3-aminopropylo)metakryloamid (BNHEMA-b-APMA, BA) zsyntetyzowano poprzez polimeryzację RAFT przy użyciu 4,4'-azobis(kwasu 4-cyjanoalerynowego) (ACVA) jako czynnika inicjującego i ditiobenzoesanu kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) jako czynnika przenoszącego łańcuch. Następnie otrzymano N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakrylamid-b-N-(3-guanidynopropylo)metakryloamid (metionina szczepiona BNHEMA-b-GPMA, mBG) poprzez modyfikację grup aminowych w APMA grupami metioniny i guanidyny. Dla porównania zsyntetyzowano trzy rodzaje polimerów blokowych, mBG1, mBG2 i mBG3. Do ilościowego określenia zawartości APMA zastosowano reakcję ninhydryny; mBG1, mBG2 i mBG3 miały odpowiednio 21%, 37% i 52% APMA. Wyniki chromatografii żelowej (GPC) wykazały, że kopolimery BA mają masę cząsteczkową 16 200 (BA1), 20 900 (BA2) i 27 200 (BA3) g/mol. Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA (pDNA) otrzymanych nośników genów kopolimeru blokowego. Współczynniki ładunków (N / P) wynosiły 8, 16 i 4, gdy pDNA było całkowicie skompleksowane odpowiednio z mBG1, mBG2, mBG3. Gdy stosunek N/P polipleksów mBG/pDNA był wyższy niż 1, potencjał Zeta mBG był dodatni. Przy stosunku N/P między 16 a 32 średnia wielkość cząstek polipleksów mBG/pDNA wynosiła od 100 do 200 nm. Ogólnie rzecz biorąc, praca ta ilustruje prosty i wygodny protokół syntezy nośnika kopolimeru blokowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach pojawiła się terapia genowa dla terapeutycznego dostarczania kwasów nukleinowych jako leków do leczenia wszelkiego rodzaju chorób1. Rozwój leków genowych, w tym plazmidowego DNA (pDNA) i małego interferującego RNA (siRNA), opiera się na stabilności i wydajności systemu dostarczania leków (DDS)2. Spośród wszystkich DDS, kationowe nośniki polimerowe mają zalety dobrej stabilności, niskiej immunogenności oraz łatwego przygotowania i modyfikacji, co daje kationowym nośnikom polimerowym szerokie perspektywy zastosowań3,4. Do praktycznych zastosowań w biomedycynie naukowcy muszą znaleźć kationowy nośnik polimerowy o wysokiej wydajności, niskiej toksyczności i dobrej zdolności celowania5. Spośród wszystkich nośników polimerowych, kopolimery blokowe są jednym z najczęściej stosowanych systemów dostarczania leków. Kopolimery blokowe są intensywnie badane pod kątem ich właściwości samoorganizacji i zdolności do tworzenia miceli, mikrosfer i nanocząstek w dostarczaniu leków5. Kopolimery blokowe mogą być syntetyzowane za pomocą żywej polimeryzacji lub metod chemii klik.

W 1956 roku Szwarc i in. poruszyli temat żywej polimeryzacji, definiując ją jako reakcję bez reakcji zrywania łańcuchów6,7. Od tego czasu opracowano wiele technik syntezy polimerów przy użyciu tej metody; W związku z tym żywa polimeryzacja jest postrzegana jako kamień milowy w nauce o polimerach8. Żywą polimeryzację można podzielić na żywą polimeryzację anionową, żywą polimeryzację kationową i odwracalną polimeryzację rodnikową z dezaktywacją (RDRP)9. Żywe polimeryzacje anionowe/kationowe mają ograniczony zakres zastosowania ze względu na ich surowe warunki reakcji10. Kontrolowana/żywa polimeryzacja rodnikowa (CRP) charakteryzuje się łagodnymi warunkami reakcji, wygodną dyspozycją i dobrą wydajnością, dlatego była głównym przedmiotem badań w ostatnich latach11. W CRP aktywne łańcuchy propagacyjne są odwracalnie pasywowane do uśpionych w celu zmniejszenia stężenia wolnych rodników i uniknięcia dwucząsteczkowej reakcji propagacji rodników łańcuchowych. Polimeryzacja addycyjna może być kontynuowana tylko wtedy, gdy nieaktywne uśpione łańcuchy rozmnożeniowe są odwracalnie ożywiane w rodniki łańcuchowe. Jako jedna z najbardziej obiecujących form polimeryzacji żywych rodników, polimeryzacja z odwracalnym przeniesieniem łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT) jest metodą mającą zastosowanie do otrzymywania polimerów blokowych o kontrolowanej masie cząsteczkowej i strukturze, wąskim rozkładzie masy cząsteczkowej i przenoszących grupy funkcyjne12. Kluczem do udanej polimeryzacji RAFT jest działanie środków przenoszących łańcuchy, zwykle ditioestrów, które mają bardzo wysoką stałą przenoszenia łańcucha.

W tym artykule, metoda polimeryzacji RAFT została zaprojektowana w celu przygotowania polimeru blokowego BNHEMA-b-APMA, przyjmując 4,4'-azobis(kwas 4-cyjanoalerynowy) (ACVA) jako czynnik inicjujący i ditiobenzoesan kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) jako czynnik przenoszący łańcuch. Polimeryzacja RAFT została użyta dwukrotnie w celu wprowadzenia BNHEMA do kationowych nośników polimerowych. Następnie grupy aminowe w łańcuchu APMA zmodyfikowano metioniną i odczynnikiem guanidynylowodorku chlorowodorku 1-amidinopirazolu. Dzięki wykorzystaniu ładunków dodatnich odczynnika guanidynylacji oraz struktury szkieletu polimeru metakryloamidu poprawiono efektywność wychwytu komórkowego otrzymanych nośników polimerów blokowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza polimeru BNHEMA (PBNHEMA)

  1. Rozpuścić 1,87 g N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakryloamidu (BNHEMA) w 1 ml wody destylowanej w butelce do polimeryzacji.
    UWAGA: Butelka do polimeryzacji to kolba okrągłodenna z gumowym korkiem i mieszadłem magnetycznym.
  2. Rozpuścić 0,03 g ditiobenzoesanu kwasu 4-cyjanopentanowego (CTP) i 0,02 g 4,4'-azobis (kwasu 4-cyjanowalerycznego) (ACVA) w 0,5 ml 1,4-dioksanu w zlewce o pojemności 5 ml. Następnie dodaj roztwór CTP i ACVA do butelki polimeryzacyjnej z kroku 1.1.
  3. Przewietrzyć układ reakcyjny w butelce do polimeryzacji azotem za pomocą trzech cykli zamrażania, pompowania i rozmrażania.
    1. Szczegółowo zamroź roztwór w butelce polimeryzacyjnej za pomocą pułapki kondensatu, przymocuj butelkę do polimeryzacji do żelaznego wspornika, a następnie odkurz i wstrzyknij azot do mieszaniny reakcyjnej przez przewód zakończony igłą (igła #9, średnica wewnętrzna 0,65 mm, średnica zewnętrzna 0,9 mm). Zamknij butelkę do polimeryzacji i rozmrażaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Powtórz cykle zamrażania-pompy-rozmrażania trzy razy.
  4. Umieścić butelkę do polimeryzacji w łaźni olejowej o temperaturze 70 °C i pozostawić roztwór do reakcji przez 24 godziny w atmosferze azotu.
  5. Schłodzić butelkę do polimeryzacji w temperaturze 0 °C i otworzyć gumowy korek, aby zakończyć proces polimeryzacji.
  6. Wstępnie schłodzić aceton w lodówce o temperaturze -20 °C przez 2 godziny, a następnie wymieszać go z roztworem reakcyjnym z kroku 1.5 w stosunku 50:1 (v/v). Następnie odwirować przy 8 200 x g przez 10 minut, aby usunąć aceton i zebrać osad.
  7. Aby oczyścić zsyntetyzowany PBNHEMA, należy rozpuścić zebrany osad w 2 ml czystej wody, a następnie wymieszać go ze 100 ml wstępnie schłodzonego acetonu w stosunku 1:50 (v/v). Odwirować roztwór o stężeniu 8 200 x g przez 10 minut i zebrać osad. Powtórz ten proces trzy razy.
  8. Wysuszyć wyprodukowaną PBNHEMĘ za pomocą suszarki próżniowej o temperaturze 50 °C. Po wysuszeniu zważ proszek za pomocą wagi. Obliczyć współczynnik uzysku zgodnie z równaniem 1.
    figure-protocol-1 (1)
    UWAGA: W tym eksperymencie uzyskany plon wyniósł 77,2%.

2. Synteza polimeru BNHEMA-b-APMA (BA)

  1. Rozpuścić 0,96 g chlorowodorku N-(3-aminopropylo)metakryloamidu (APMA) i 0,93 g PBNHEMA w 5 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 10 ml.
  2. Rozpuścić 0,01 g 4,4'-azobis (kwasu 4-cyjanowalerynowego) (ACVA) w 0,5 ml 1,4-dioksanu i wymieszać z roztworem APMA-PBNHEMA z części 2.1.
  3. Przenieść mieszaninę do butelki polimeryzacyjnej i wietrzyć suchym azotem przez 1 godzinę.
  4. Umieścić butelkę polimeryzacyjną w łaźni olejowej o temperaturze 70 °C i pozostawić ją do reakcji przez 24 godziny w atmosferze azotu.
  5. Schłodzić butelkę do polimeryzacji w temperaturze 0 °C i otworzyć gumowy korek, aby zakończyć proces polimeryzacji.
  6. Przenieść roztwór do schłodzonego acetonu z kroku 1.6, a następnie odwirować roztwór o sile 8 200 x g przez 10 minut w celu wytrącenia BA.
  7. Rozpuścić BA w 2 ml wody destylowanej i wytrącić polimer w schłodzonym acetonie. Powtórz trzy razy.
  8. Wysuszyć wytworzony BA w suszarce próżniowej o temperaturze 50 °C i zważyć otrzymany proszek. Obliczyć współczynnik uzysku zgodnie z równaniem 2.
    figure-protocol-2
    UWAGA: W tym eksperymencie obliczono, że wskaźnik wydajności wynosi 82,0%.

3. Określ procent molowy APMA w kopolimerze BA za pomocą metody ninhydryny

UWAGA: Spektrofotometria służy do określania zawartości aminokwasów wieloskładnikowych. Zasada jest reakcją barwną ninhydryny i aminokwasu, w której absorbancja jest do pewnego stopnia skorelowana z zawartością aminokwasów13,14.

  1. Rozpuść 5 g ninhydryny w 125 ml wrzącej wody destylowanej. Rozpuść również 5 g witaminy C w 250 ml ciepłej wody destylowanej. Dodaj kroplami 250 ml roztworu witaminy C do roztworu ninhydryny, mieszając magnetycznie. Kontynuuj mieszanie przez 15 minut, a następnie schładzaj roztwór reakcyjny w lodówce o temperaturze 4 °C.
  2. Wyjmij roztwór z lodówki i przefiltruj przez odsysanie za pomocą lejka Buchnera, aby uzyskać zredukowaną ilość ninhydryny. Zebrać osad i zachować go w odwadniaczu pięciotlenku fosforu.
  3. Rozpuścić 85 mg ninhydryny i 15 mg zredukowanej ninhydryny w 10 ml eteru monometylowego glikolu etylenowego, aby przygotować roztwór barwiący ninhydrynę.
    UWAGA: Roztwór barwiący ninhydrynę może reagować z α-aminą w APMA i tworzyć fioletowy związek o strukturze opisanej w poprzednim badaniu15.
  4. Rozcieńczyć 1 ml 0, 1, 10, 100, 1000 mg/ml roztworów monomeru APMA z 1 ml buforu octanowego (2 M, pH 5,4), a następnie dodać odpowiednio 1 ml roztworu barwiącego ninhydrynę.
  5. Podgrzewaj mieszaniny przez 15 minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie ostudź je pod bieżącą wodą. Pozostaw roztwory na 5-10 minut, rozcieńcz je 3 ml 60% alkoholu etylowego i dokładnie wymieszaj. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru i narysować krzywą wzorcową (równanie 3).
    figure-protocol-3
    UWAGA: Równanie 3 wyprowadzono z liniowego dopasowania absorbancji przy 570 nm w stosunku do stężenia APMA.
  6. Rozpuścić 0,01 g BA w 1 ml wody destylowanej; dodać 1 ml buforu octanowego (2 M, pH 5,4) i 1 ml roztworu barwiącego ninhydrynę. Obliczyć zawartość molową APMA zgodnie z absorbancją przy 570 nm.
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5 (5)
    figure-protocol-6
    UWAGA: Wzory obliczeniowe są następujące (równania 3-6).

4. Synteza polimeru BA szczepionego metioniną (mBA)

  1. Rozpuścić 8,9 mg metioniny FOMC w 5 ml DMSO w kolbie regeneracyjnej.
  2. Dodać 6,92 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodimidu (EDCl) i 4,86 mg 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) do kolby regeneracyjnej i reagować w temperaturze 0 °C przez 0,5 godziny.
  3. Rozpuścić 2,59 g BA w 5 ml roztworu DMSO, a następnie dodać 50 μl trimetyloaminy; dodać ten roztwór kroplami do kolby regeneracyjnej (krok 4.2) i pozostawić roztwór reagujący przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Dializować w celu usunięcia DMSO i trimetyloaminy z roztworu BA w kroku 4.3 za pomocą worka do dializy (MWCO 10 kDa) w zlewce o pojemności 2 l przez 24 godziny; wymieniać wodę dejonizowaną co 6 godzin.
  5. Otrzymany mBA należy liofilizować i zważyć, aby obliczyć wydajność zgodnie z równaniem 7.
    figure-protocol-7
    UWAGA: W tym przypadku uzysk został określony na 71%.
  6. Określić ilościowo NH2 zawierający mBA, mierząc absorbancję przy 570 nm w celu obliczenia ilości szczepionej metioniny. Obliczyć zawartość molową metioniny zgodnie z równaniem 8.
    figure-protocol-8

5. Synteza guanidynowego i sprzężonego z metioniną polimeru BNHEMA-b-APMA (mBG)

UWAGA: Zsyntetyzowano trzy różne kopolimery mBA1, mBA2 i mBA3. Kopolimer mBA3 jest używany jako przykład w następujących krokach.

  1. Rozpuścić mBA3 zawierający 60 μmol grupy aminowej w 5 ml czystej wody.
    UWAGA: Zawartość grup aminowych określono ilościowo przy użyciu metody ninhydryny, jak opisano w kroku 3.5.
  2. Rozpuścić 40,6 mg (300 μmol) odczynnika do guanidyniylacji chlorowodorku 1-amidinopirazolu w roztworach mBA.
  3. Dostosuj pH do 9,0 za pomocą nasyconego roztworu węglanu sodu i pozwól mu ustabilizować się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Produkt mBG należy dializować wodą dejonizowaną za pomocą worka dializacyjnego w zlewce (MWCO 10 kDa, 2 l) i zakonserwować w postaci liofilizowanego proszku.
    Procent plonów został obliczony na 85% za pomocą równania 8.
    figure-protocol-9 (8)
  5. Rozpuść proszek mBG w D2O w probówkach NMR i scharakteryzuj go za pomocą spektroskopii magnetycznegorezonansu jądrowego 1 H (1H NMR)16.

6. Przygotowanie i charakterystyka polipleksów mBG/pDNA

  1. Rozpuść 50 μg pDNA w 50 μl wody wolnej od RNazy/DNaz.
  2. Rozpuścić 1 mg kopolimerów mBG w 1 ml wody wolnej od RNazy/DNaz.
  3. Dodaj roztwór kopolimerów mBG bezpośrednio do roztworu pDNA zgodnie z różnymi proporcjami karmienia, to znaczy różnymi stosunkami N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 i 32:1).
    UWAGA: Stosunek N/P definiuje się jako stosunek molowy grupy guanidynowej w polimerze i grupy fosforanowej w pDNA, a mianowicie stosunek molowy łańcucha GPMA w polimerze i mononukleotydu w pDNA. Stosunek N/P oblicza się na podstawie masy cząsteczkowej azotu aminowego (N) w mBG i grupy fosforanowej (P) w pDNA .
  4. Wymieszaj roztwory za pomocą mieszalnika wirowego i odstaw na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdyspergować mieszaninę w roztworze buforu fosforanowego (PBS, pH 7,4) i zachować otrzymane polipleksy mBG/pDNA w temperaturze 4 °C do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Średnia wielkość cząstek i potencjał Zeta mBG i kompleksów zostały wykryte za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)17.
  5. Rozcieńczyć 10 μl roztworów polipleksu mBG/pDNA 1 ml PBS (pH 7,4) w próbkach komórek DLS i potencjału Zeta.
    UWAGA: Wykrywanie wielkości cząstek i potencjału Zeta przeprowadzono trzykrotnie i uzyskano średnią z tych trzech wartości.

7. Eksperyment z opóźnieniem elektroforetycznym polipleksów mBG/pDNA

UWAGA: Przeprowadzono eksperyment z opóźnieniem elektroforetycznym w celu określenia minimalnego współczynnika naładowania.

  1. Weźmy pięć grup polipleksów mBG / pDNA o różnych proporcjach N / P (1: 1, 4: 1, 8: 1, 16: 1 i 32: 1) zawierających 50 μg pDNA.
  2. Dodać 6-krotny bufor ładujący do próbek polipleksu mBG/pDNA do końcowego stężenia 1x.
  3. Dodaj roztwory do 1,5% żeli agarozowych i uruchom żel pod napięciem 90 mV przez 15 minut, używając pDNA jako kontroli.
  4. Zrób zdjęcia żeli za pomocą aparatu do obrazowania żeli.

8. Cytotoksyczność polipleksów mBG/pDNA

  1. Zasiaj komórki MCF-7 w 96-dołkowych płytkach o gęstości 10-4 komórek na dołek. Następnie hodować komórki przez 12 godzin przy użyciu pożywki DMEM (10% FBS i 1% antybiotyku) w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5%CO2.
  2. Zastąp pożywkę hodowlaną bezantybiotykową pożywką hodowlaną DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i polipleksy mBG / pDNA o różnych proporcjach ładunku (N / P 4, 8, 16 i 32, n = 6) przez 6 godzin, pobierając komórki dodane z równymi objętościami roztworu PBS jako kontrolę. Następnie zastąpić pożywkę hodowlaną 150 μl świeżej pożywki 1640 i kontynuować hodowlę komórek przez 24 godziny.
  3. Dodać 5 mg/ml roztworu bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) (20 μl/basenik) do 96-dołkowych płytek i dalej hodować komórki przez 4 godziny.
  4. Usunąć roztwór i dodać 150 μl DMSO do każdego dołka i wstrząsnąć 96-dołkowymi płytkami przez 30 sekund.
  5. Zmierz gęstość optyczną (OD) przy 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek, aby pokazać żywotność komórki. Obliczyć procent żywotności komórki zgodnie z równaniem 9.
    Żywotność komórki % = figure-protocol-10 (9)

9. Skuteczność transfekcji polipleksów mBG/ GFP-pDNA

  1. Rozpuścić 50 μg pDNA zawierającego gen reporterowy białka zielonej fluorescencji (GFP) pDNA (GFP-pDNA) w 50 μl wody wolnej od RNazy/DNazy. Następnie rozpuścić 1 mg kopolimerów mBG w 1 ml wody wolnej od RNazy/DNaz. Wymieszać roztwór pDNA i mBG w stosunku ładunku (N/P) 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 i 32:1 i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozproszyć roztwór polipleksów mBG/GFP-pDNA za pomocą fal ultradźwiękowych (30 s) i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Stosunek N/P oblicza się na podstawie masy cząsteczkowej azotu aminowego (N) w mBG i grupy fosforanowej (P) w pDNA .
  2. Komórki MCF-7 należy wysiać w gęstości 2 × 10 5 komórek na basenie na płytce 6-dołkowej i hodować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 12 godzin.
  3. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą polipleksy mBG/GFP-pDNA o różnych proporcjach N/P (4, 8, 16 i 32) na 6 godzin.
  4. Zastąp pożywkę 2 ml świeżej pożywki RPMI1640 i hoduj przez 48 godzin.
  5. Zbierz komórki i wykryj zieloną fluorescencję za pomocą cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BNHEMA była podawana zgodnie z obiektywnym stopniem polimeryzacji pokazanym w Tabeli 1; procedura syntezy mBG jest pokazana w Rysunek 1. W pierwszej kolejności homopolimer BNHEMA przygotowano metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT) w układzie woda-dioksan, wykorzystując ditiobenzoesan kwasu 4-cyjanopentanowego jako środek przenoszący łańcuch. Po drugie, PBNHEMA została wykorzystana jako środek do przenoszenia łańcucha do przygotowania polimer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym wprowadzono serię blokowych polimerowych nośników genów kationowych BNHEMA-b-APMA. Te polimery blokowe zsyntetyzowano metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Segment hydrofilowy BNHEMA został wprowadzony w celu poprawy rozpuszczalności. Grupy metioniny i guanidyny zmodyfikowano w celu poprawy zdolności docelowej i skuteczności transfekcji5. Zwiększyła się zawartość łańcucha APMA, a guanidynyloacja w kopolimerze mBG zmniejszyła wielkość cząstek polipl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zaświadczają, że nie ma konfliktu interesów z żadną organizacją finansową w odniesieniu do materiału omawianego w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2016YFC0905900), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81801827, 81872365), Podstawowy Program Badawczy Prowincji Jiangsu (Fundacja Nauk Przyrodniczych, No. BK20181086) oraz Fundusz Badań Naukowych Szpitala Onkologicznego Jiangsu (nr ZK201605).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-hydroksybenzotriazolMacklin Biochemical Co., Ltd, ChinyH810970≥ 97,0%
1,4-dioksanOdczynnik chemiczny Sinopharm Co., Ltd, Chiny10008918
Chlorowodorek 1-amidinopirazoluAR Aladdin Co., Ltd., ChinyA10793598%
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu chlorowodorekAladdin Co., Ltd., ChinyE106172AR
4,4'-azobis(kwas 4-cyjanalerynowy)Aladdin Co., Ltd., ChinyA106307Odczynnik analityczny (AR)
4-cyjano-4-(fenylokarbomatiolotio)pentanowy KwasAladdin Co., Ltd., ChinyC132316>97% (HPLC)
Octanodczynnik chemiczny Sinopharm Co., Ltd, Chiny81014818AR
AcetonSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Chiny10000418AR
AgaroseAladdin Co., Ltd., ChinyA118881
Kwas askorbinowyAladdin Co., Ltd., ChinyA103533AR
DMSOAladdin Co., Ltd., ChinyD103272AR
Glikol etylenowyAladdin Co., Ltd., ChinyE103319AR
Chlorowodorek N-(3-aminopropylo)metakryloamiduAladdin Co., Ltd., ChinyN129096≥ 98,0% (HPLC)
N,N-bis(2-hydroksyetylo)metakryloamidZaiQi Bio-Tech Co., Ltd, ChinyCF259748≥ 98,0% (HPLC)
NinhydrinAladdin Co., Ltd., ChinyN105629
bufor AR PBSAladdin Co., Ltd., ChinyP196986pH 7,4
Plazmidowe DNABIOGOT Co., Ltd, ChinypDNA-EGFPpDNA-EGFP
Plazmidowe DNABIOGOT Co., Ltd, ChinyPdnapDNA
Dekahydrat węglanu soduAladdin Co., Ltd., ChinyS112589AR
TrimethylamineAladdin Co., Ltd., ChinyT103285AR
o wysokiej rozdzielczości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
  2. Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
  3. Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
  4. Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
  5. Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969(2017).
  6. Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
  7. Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
  8. Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241(2015).
  9. Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
  10. Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
  11. Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
  12. Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
  13. Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
  14. Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
  15. Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
  16. Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
  17. Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioninpolimeryzacja RAFTstosunek N Ppotencja zetawielko cz stekcytometria przep ywowatest MTTfluorescencja GFPa nia olejowa

Powiązane artykuły