Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

DOI:

10.3791/58532

⸱

1 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Physiology, University of Neuchatel, 2Institut fur Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biogeneza chloroplastów wymaga importu tysięcy białek kodowanych przez jądro do plastydu. Import tych białek zależy od translokonu na zewnętrznej (TOC) i wewnętrznej (TIC) błonie chloroplastowej. Kompleksy TOC i TIC są multimeryczne i prawdopodobnie zawierają jeszcze nieznane składniki. Jednym z głównych celów w tej dziedzinie jest stworzenie pełnej inwentaryzacji składników TOC i TIC. W celu wyizolowania kompleksów TOC-TIC i identyfikacji nowych składników, receptor prebiałkowy TOC159 został zmodyfikowany N-końcowy przez dodanie znacznika tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP), w wyniku czego powstaje TAP-TOC159. Znacznik TAP jest przeznaczony do dwóch sekwencyjnych etapów oczyszczania powinowactwa (stąd "powinowactwo tandemowe"). Znacznik TAP stosowany w tych badaniach składa się z N-końcowej domeny wiążącej IgG pochodzącej z białka A Staphylococcus aureus (ProtA), po której następuje peptyd wiążący kalmodulinę (CBP). Pomiędzy tymi dwoma znacznikami powinowactwa uwzględniono miejsce rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Dlatego proteaza TEV może być stosowana do delikatnej elucji kompleksów zawierających TOC159 po związaniu się z kulkami IgG. W przedstawionym tutaj protokole pominięto drugi etap oczyszczania z powinowactwem do kalmoduliny. Protokół oczyszczania rozpoczyna się od przygotowania i rozpuszczenia całkowitych błon komórkowych. Po poddaniu działaniu detergentu, rozpuszczone białka błonowe są inkubowane z kulkami IgG w celu immunoizolacji kompleksów zawierających TAP-TOC159. Po związaniu i intensywnym płukaniu kompleksy zawierające TAP-TOC159 są rozszczepiane i uwalniane z kulek IgG za pomocą proteazy TEV, za pomocą której usuwana jest domena wiążąca IgG S. aureus. Western blot wyizolowanych kompleksów zawierających TOC159 może być wykorzystany do potwierdzenia obecności znanych lub podejrzewanych białek TOC i TIC. Co ważniejsze, kompleksy zawierające TOC159 zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji nowych składników kompleksów TOC i TIC za pomocą spektrometrii mas. Protokół, który prezentujemy, potencjalnie pozwala na efektywną izolację dowolnego kompleksu białkowego związanego z błoną, który można wykorzystać do identyfikacji nieznanych jeszcze składników za pomocą spektrometrii mas.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny są zależne od chloroplastów do fotosyntezy i wzrostu fotoautotroficznego1. Zdecydowana większość białek chloroplastowych jest kodowana w jądrze, syntetyzowana w cytozolu i importowana do chloroplastu przez kompleksy TIC i TOC w błonach otoczki2. Rdzeń kompleksu TOC składa się z kanału przewodzącego białko Toc75 i dwóch GTPaz receptora: Toc33 i Toc1593,4,5. TOC159 jest niezbędny do biogenezy chloroplastów i pośredniczy w masowej akumulacji białek związanych z fotosyntezą6. Kompleks TIC składa się z kanału przewodzącego białko TIC20 oraz TIC110 i TIC407,8. Niedawno wyizolowano kompleks translokacji białka 1MD na wewnętrznej błonie otoczki, który zawierał wcześniej niezidentyfikowane składniki9, z których jednym był TIC56. Niedawno wspólnie wyizolowaliśmy TIC56 kompleksu 1 MDa przy użyciu protokołu oczyszczania powinowactwa TAP-TOC159. Dane wskazują na strukturalne nakładanie się "kanonicznych" kompleksów TOC/TIC i 1 MDa complex10. Wcześniej nieznane komponenty, takie jak KOC1, zostały również zidentyfikowane jako nowi partnerzy interakcji kompleksów TOC i TIC przy użyciu metody TAP opisanej tutaj10,11.

Tak więc, oczyszczanie znacznika TAP jest skuteczną metodą izolacji kompleksów białkowych i identyfikacji oddziałujących partnerów poprzez późniejszą analizę spektrometryczną mas12. Znacznik TAP składa się z dwóch powtórzeń wiązania IgG oddzielonych od peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP) przez miejsce rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Pierwotna metoda, składająca się z etapu oczyszczania z powinowactwem IgG, po którym następuje rozszczepienie TEV, a następnie chromatografia z powinowactwem do kalmoduliny, pozwoliła na natywne oczyszczanie dużych i wysoce czystych kompleksów białkowych13,14. Uprościliśmy procedurę i wykazaliśmy, że kompleksy białkowe zawierające TOC159 mogą być również skutecznie oczyszczane przy użyciu tylko etapu oczyszczania powinowactwa IgG, po którym następuje rozszczepienie TEV w celu elucji15. Z naszego doświadczenia wynika, że pominięcie etapu powinowactwa do kalmoduliny skutkowało wyższymi plonami i dlatego może być odpowiednie dla białek o niskiej obfitości.

Krótko mówiąc, zaprojektowaliśmy stabilne transgeniczne linie A. thaliana wyrażające TAP-TOC159 w tle ppi2 (mutant toc159 KO) i ustaliliśmy je jako wiarygodne źródło do oczyszczania kompleksów TOC-TIC. Protokół izolacji kompleksu TOC-TIC rozpoczyna się od homogenizacji materiału roślinnego w buforze wolnym od detergentów. Po odwirowaniu supernatant jest odrzucany. Osad zawierający całkowitą frakcję membranową jest rozpuszczany przy użyciu buforu zawierającego detergent. Po etapie ultra-wirowania, supernatant zawierający rozpuszczone kompleksy TOC-TIC nakłada się na żywicę IgG w celu oczyszczenia powinowactwa. Po kilku etapach płukania elucję przeprowadza się przy użyciu buforu zawierającego proteazę TEV w celu selektywnego rozszczepienia domen wiążących IgG i delikatnego uwolnienia natywnych kompleksów zawierających TOC159. Eluat TEV może być analizowany bezpośrednio za pomocą Western blot lub spektrometrii mas w celu identyfikacji partnerów interakcji TOC15910,11,15. Metoda ta została również wykorzystana do identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych TOC15915. W przyszłości natywne kompleksy zawierające TOC159 mogą być wykorzystywane do badań strukturalnych z wykorzystaniem mikroskopii krioelektronowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roślin Arabidopsis

  1. Przygotować 1 l pożywki o połowie objętości pożywki Murashige i Skoog (MS) zawierającej witaminy z 1% sacharozą i dostosować pH do 5,7 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Dodać 0,8% fitoagaru i autoklaw przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
  2. Wlać 75 ml pożywki MS na płytkę Petriego (średnica 14,5 cm, wysokość 3 cm) i pozostawić do zestalenia na 1 godzinę.
  3. Dodać 30 mg nasion Arabidopsis thaliana do probówki do mikrokrówki o pojemności 1,5 ml i sterylizować powierzchnię 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% (v/v) Triton X-100 przez 5 minut, a następnie 100% (v/v) etanolem przez 10 min. Usunąć etanol.
  4. Przenieś nasiona na sterylną bibułę filtracyjną w celu wysuszenia. Wysterylizowane nasiona rozsyp równomiernie na płytce MS (każdy genotyp wymaga co najmniej 8-10 płytek) i zaklej każdą płytkę taśmą chirurgiczną.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez dwa dni w ciemności, aby zsynchronizować kiełkowanie nasion. Przenieść do komory wzrostowej z następującym cyklem świetlnym: 8 godzin światła 120 μmol m−2 s−1 i 16 godzin ciemności w temperaturze 22–20 °C.

2. Przygotowanie koralików agarozowych HsIgG

  1. Zawiesić kulki agarozy aktywowane CNBr (4 g) w 100 ml 1 mM HCl i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przenieś kulki agarozy do filtra ze szkła spiekanego, umyj w próżni 100 ml 100 mM HCl i powtórz 2-3 razy.
    UWAGA: Wstępnie schłodzić roztwór myjący do temperatury 4 °C.
  3. Zawiesić kulki agarozy w 1 ml zimnego 100 mM HCl i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyć filtr ze szkła spiekanego 3 ml 100 mM HCl i przenieść ciecz do tej samej probówki.
  4. Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.
    UWAGA: Nie dekantować probówki.
  5. Zawiesić kulki w 50 ml buforu sprzęgającego (tabela 1); krótko wymieszać, a następnie wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Rozpuścić 50 mg liofilizowanej Homo sapiens IgG (Hs-IgG) w 10 ml buforu sprzęgającego, delikatnie wymieszać kulki agarozy i inkubować w wytrząsarce obrotowej przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  8. Przemyć kulki IgG-agarozy 50 ml buforu sprzęgającego i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  9. Zawiesić kulki IgG-agarozy w 50 ml buforu blokującego (Tabela 1) i wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć raz.
  10. Zawiesić ponownie kulki IgG-agarozy w 50 ml buforu blokującego, obracać mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki IgG-agarozy w 200 ml buforu sprzęgającego NaCl (Tabela 1).
  12. Aby zablokować wszelkie pozostałe sieciujące grupy CNBr, przemyj kulki IgG-agarozy 100 ml 0,1 M glicyny-HCl, pH 2,8. Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Przemyć 0,2 M glicyny-HCl o pH 2,8, wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Na koniec umyj kulki IgG-agarozy 200 ml ultraczystej wody.
  13. Przemyć kulki IgG-agarozy 200 ml ultraczystej wody, a następnie 200 ml buforu PBS (Tabela 1).
  14. Zawiesić kulki IgG-agarozy w 20 ml buforu PBS z 0,01% NaN3 (azydek sodu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Izolacja i solubilizacja frakcji membranowej

  1. Zmielić 10 g trzytygodniowych sadzonek A. thaliana w ciekłym azocie za pomocą zimnego moździerza i tłuczka z piaskiem.
  2. Dodać 20 ml zimnego buforu do mielenia (Tabela 1) do 10 g zmielonej tkanki, dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie.
  3. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy materiału do szybkiej filtracji do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przed filtracją namocz materiał do szybkiej filtracji buforem do mielenia.
  4. Odwirować filtrat przez 10 minut w temperaturze 1 500 × g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, powtórzyć ten sam krok jeszcze raz i zebrać supernatant. Zachować próbkę "frakcji całkowitej" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy
  5. Przenieść supernatant do zimnych probówek ultrawirówek o pojemności 38,50 ml i uzupełnić do 35 ml zimnym buforem do mielenia. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce.
  6. Przenieść sklarowany osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zachować próbkę "frakcji rozpuszczalnej" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  7. Ponownie zawiesić zielony granulat za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego, w buforze mielącym. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce i odrzucić supernatant.
  8. Ponownie zawiesić zielony granulat w 18,75 ml 1x buforu do mielenia za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego i dodać 9,375 ml 1x buforu do mielenia.
  9. Dodać 9,375 ml 4-krotnego roztworu do solubilizacji (Tabela 1) (zawierającego detergent TX-100), aby uzyskać 37,5 ml i inkubować przez 30 minut na "obrotowym wytrząsarce" w temperaturze 4 °C.
  10. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce. Przenieść sklarowany osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zachować próbkę supernatantu o objętości 200 μl (przyszła "frakcja obciążeniowa") i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  11. Zawiesić osad w 37,5 ml bufora do mielenia. Zachować próbkę części nierozpuszczalnej i przechowywać w temperaturze -80 °C

4. Immunoprecypitacja

  1. Zrównoważyć 100 μl upakowanej żywicy IgG-agarozy w buforze A (tabela 1) i wirować w temperaturze 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić żywicę IgG-agarozy w 100 μl buforu A w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść przemytą żywicę IgG-agarozy do 37,5 ml rozpuszczonych membran i inkubować przez noc na obracającej się wytrząsarce w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.
  4. Osadzać żywicę IgG-agarozy w stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety. Zachować 200 μl próbki "przepływowej" i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  5. Przemyć żywicę IgG-agarozy w 37,5 ml buforu A i inkubować przez 10 minut na obrotowej wytrząsarce.
  6. Osadzać żywicę IgG-agarozy w temperaturze 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant za pomocą pipety, dodać 5 ml buforu A do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 100 × g, 4 °C, 5 min. Zachować próbkę "Wash 1" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  7. Powtórz etap płukania 5 ml trzy razy z buforem A.
  8. Przeprowadzić dwa ostatnie etapy płukania bez inhibitorów (NaF, inhibitor proteazy i PMSF)
    UWAGA: Na tym etapie inhibitory nie są już wymagane i pominięte w celu obniżenia kosztów. Zatrzymać próbkę o objętości 200 μl z ostatniego etapu prania "pranie końcowe (W6)" i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  9. Przenieść żywicę IgG-agarozy do kolumny wirowej o pojemności 500 μl z filtrem 35 μm i przepłukać kulki dwukrotnie 300 μl buforu elucyjnego TEV (tabela 1) (niezawierającego AcTEV) w celu zrównoważenia. Zamknij kolumnę wirowania.
  10. Dodać 300 μl buforu elucyjnego TEV zawierającego 50 jednostek (10 μl) AcTEV. Przygotuj mieszankę w tubie przed dodaniem do żywicy.
  11. Inkubować kolumnę wirową z kulkami w termomikserze w temperaturze 16 °C, 350 obr./min przez 2 godziny. Delikatnie odwracać kolumnę kilka razy co 30 minut.
  12. Otworzyć kolumnę wirową, umieścić ją w nowej, czystej probówce o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania eluatu.
  13. Wysuszyć (na przykład) 10% (v/v) eluowanej próbki (~25 μL) w parowniku odśrodkowym i użyć do spektrometrii mas lub innej dalszej analizy.
  14. Pozostałą część eluatu (~275 μl) podzielić na jedenaście probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (każda po 25 μl), wysuszyć w parowniku odśrodkowym i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  15. Analizować próbki zatrzymane przez cały czas trwania procedury, jak również eluaty za pomocą standardowej SDS-PAGE, a następnie immunoblotting. W celu przygotowania próbki należy wytrącić 50 μg całkowitej (T), ładunku (L), przepływu (FT), przepłukania 1 (W1) i 200 μl przepłukania 6 (W6) przez ekstrakcję chloroformem/metanolem16.
  16. Dodać 10 μl buforu ładującego 2x SDS-PAGE (Tabela 1) do wytrąconych próbek i 25 μl eluowanej wysuszonej próbki. Wirować i gotować przez 10 minut w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.
  17. Przeanalizować całkowitą (T), ładunek (L), przepływ (FT), płukanie 1 (W1), płukanie 6 (W6) i elucję (E) przez immunoblotting przy użyciu przeciwciał anty-TOC159 w celu określenia skuteczności procedury izolacji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy tutaj protokół oczyszczania kompleksu białek otoczki chloroplastowej z transgenicznych roślin A. thaliana oznaczonych znacznikiem TAP. Jak pokazano w Rysunek 1A, rośliny wyrażające konstrukt 35S:NTAP-TOC159 zostały użyte do wyizolowania tego kompleksu, podczas gdy rośliny wyrażające konstrukt 35S:NTAP zostały użyte jako kontrola. Rysunek 1B pokazuje szczegółowe etapy oczyszczania kompleksów białkowych TAP-TOC159, a następnie spektrometrię mas, aby umożliwić identyfikację oddziałujących białek. Analiza immunoblot (Rysunek 2, prawa strona) potwierdza, że wyizolowany TAP-TOC159 oddziałuje z TOC75 i TOC33 kompleksu TOC. Kinaza błony zewnętrznej chloroplastu KOC1, o której wiadomo, że fosforyluje TOC159, jest również współizolowana z kompleksem TAP-TOC159 (Rysunek 2B, prawa strona). Obecność TIC110 ujawnia, że wyizolowany kompleks TAP-TOC159 zawiera również składniki kompleksu TIC. Przeciwciało FBN1A podniesione przeciwko białku plastoglobuli niezwiązane z importem białka nie rozpoznało kompleksu TAP-TOC159, co wskazuje na brak zanieczyszczeń. W kontroli ujemnej immunoprecypitowane białko NTAP nie izolowało się jednocześnie z żadnym z białek TOC-TIC (Figura 2, lewa strona) i potwierdza specyficzność oczyszczania TAP-TOC159.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat konstruktów i procedura oczyszczania powinowactwa. (A). Konstrukt 35S:NTAP-TOC159, kodujący NTAP-TOC159, był stabilnie wyrażany w Arabidopsis thaliana. Zakłady kontroli ujemnej wyrażały konstrukt 35S:NTAP, kodując sam znacznik TAP. (B). Protokół stopniowego oczyszczania powinowactwa składa się z izolacji i solubilizacji błony, immunooczyszczania agarozy IgG, płukania, rozszczepienia proteazy TEV i elucji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Tandemowe oczyszczanie białka TOC159 z powinowactwem. N-terminalnie znakowany TAP-TOC159 oczyszczono z roślin rzodkiewnika NTAP-TOC15:ppi2, a białko TAP oczyszczone z roślin TAP: WT zastosowano jako kontrolę ujemną. Całkowite ekstrakty białkowe (T), rozpuszczone białka błonowe = frakcja ładunkowa (L), przepływ (FT), frakcje pierwszego i ostatniego płukania (W1 i W6) oraz 10% eluatu TEV analizowano metodą Western blot. Błonę sondowano przeciwciałami przeciwko TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) i FBN1A (AT4G04020). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela Bufor sprzęgający NaHCO3
Dostosuj do pH 8,5 dostosuj pH za pomocą 0,1 M Na2CO3 100 mM
  Bufor blokujący Tris–HCl
Dostosuj do pH 8 za pomocą HCl. 100 mM
  Bufor PBS Na2HPO4
KH2PO4
NaCl
KCl
Dostosuj do pH 7,3 za pomocą HCl. 4,3 mM
1,4 mM
137
2.7
  Bufor sprzęgający NaCl Zderzak sprzęgający
Zawartość NaCl
1 mln 2X bufor do mielenia Tris-HCl, pH 7,5 z HCl.
NaCl
NaF
PMSF
Koktajl inhibitorów proteazy roślinnej 100 mM
200 mM
5 mM
1 mM
0,20% 4-krotny roztwór solubilizacyjny Glicerol
Tryton-X100 40%
3 proc. Bufor A
2X bufor do mielenia
1X bufor do mielenia
4-krotny roztwór solubilizacyjny 100 ml
50 ml
25 ml
25 proc. Bufor elucyjny TEV Tris-HCl, pH 8 z HCl
EDTA, pH 8 z HCl
NaCl
Glicerol
Triton-X100
Naziemna telewizja cyfrowa 50 mM
0,5 mM
100 mM
10%
0.75%
1 mM 2x bufor ładowania SDS-PAGE Tris-HCl pH 6,8 z HCl
SDS
Glicerol
Błękit bromofenolowy
Naziemna telewizja cyfrowa 0,1 mln
4%
20%
0.20%
0,2 mln

Tabela 1. Receptury buforowe.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy, że jednoetapowe oczyszczanie znaczników TAP jest specyficzną i skuteczną metodą oczyszczania kompleksu Arabidopsis TOC-TIC. Chociaż znacznik TAP pozwoliłby na dwa kolejne etapy oczyszczania (IgG-, a następnie oczyszczanie powinowactwa kalmoduliny po rozszczepieniu proteazy TEV), uważamy, że w wielu przypadkach pierwszy etap powinowactwa, po którym następuje rozszczepienie proteazy TEV, będzie wystarczający. Nasz cel, TOC159, jest mało obfity, a włączenie drugiego etapu powinowactwa do kalmoduliny nadmiernie zmniejszyło wydajność białka, co było głównym powodem wykluczenia go z naszego obecnego protokołu. Elucja TEV sama w sobie jest wysoce specyficznym i delikatnym etapem oczyszczania, który uwolni tylko cel oznaczony TAP wraz z powiązanymi partnerami interakcji, podczas gdy białka przylegające niespecyficznie do żywicy IgG pozostaną tam. Tak więc, w połączeniu z etapem powinowactwa IgG, elucja TEV skutkuje wystarczająco skutecznym oczyszczaniem dla naszych i prawdopodobnie wielu innych celów.

Należy zadbać o to, aby konstrukt oznaczony TAP był w pełni funkcjonalny in vivo. Znakowanie TAP może mieć potencjalnie szkodliwy wpływ na aktywność, stabilność lub lokalizację białek. TOC159 składa się z trzech domen, N-końcowej domeny kwasowej, centralnej domeny wiążącej GTP i C-końcowej domeny błonowej, która zakotwicza TOC159 w zewnętrznej błonie chloroplastowej2. Aby uniknąć potencjalnych zakłóceń we wprowadzaniu membrany, połączyliśmy znacznik TAP z N-końcem TOC159. Fuzja z N-końcem jest raczej wyjątkiem niż regułą. Wiele białek zawiera N-końcową informację o celowaniu i dlatego powinny być oznaczone na C-końcu. Zapewniliśmy, że TOC159 działa in vivo poprzez uzupełnienie mutanta ppi2 (mutanta albinosa pozbawionego TOC159) TAP-TOC159. Uratowanie zielonego, dzikiego fenotypu wykazało, że TAP-TOC159 był funkcjonalny15.

Protokół oczyszczania wykorzystano do identyfikacji nowych partnerów interakcji TOC159, w tym KOC1 i TIC5610,11. W sumie około 30 białek było związanych z kompleksem, co sugeruje, że w niedalekiej przyszłości zostaną wyizolowani i scharakteryzowani nowi partnerzy interakcji. Chociaż zdecydowanie zalecamy TAP-tag do kompleksowego oczyszczania, nadal chcielibyśmy zwrócić uwagę, że istnieją dodatkowe wersje do przedstawionej tutaj i mogą być bardzo przydatne dla niektórych zastosowań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (31003A_156998 i 31003A_176191) oraz przez Uniwersytet w Neuchâtel.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaHCO3PanReac  AppliChemA0384
TrisBiosolve0020092391BS
Na2HPO4SigmaS7909
KH2PO4PanReac  AppliChemA2946
NaClPanReac  AppliChemA2942
NaFSigmaS1509Toksyczny
PMSFPanReac  AppliChemA0999Toksyczny
koktajl inhibitorów proteazy roślinnejSigmaP9599
GlicerolPanReac  AppliChemA0970
Triton X100Roche10789704001
GlycinePanReac  AppliChemA1067
EDTACarl Roth8043
Dithiothreitol (DTT)PanReac  AppliChemA1101
SDSPanReac  AppliChemA0675
Błękit bromofenolowySigmaB0126
HClVWR20252-290
sacharozaPanReac  AppliChemA3935
Pożywka Murashige and Skoog z witaminamiDuchefa BiochemieM0222
FitoagarDuchefa BiochemieP1003
Płytka PetriegoGreiner Bio-one639102
1,5 ml probówki do mikrofugeSarstedt72.706
Etanolchemiczny FisherE/0600DF/15
Bibuła filtracyjna Whatman10311804
Taśma chirurgiczna3M1530-1
Kulki agarozy aktywowane CNBr (sefaroza 4B)GE Healthcare17-0430-01
Filtr ze szkła spiekanegoDURAN2515703
Probówka wirówkowa 50 mlTPP91050
Oczyszczona immunoglobulina G (HsIgG)MP Biomedicals855908
Wytrząsarka obrotowaIKA4016000
NaN3 (azydek sodu)Sigma71290Toksyczny
materiał do szybkiej filtracji (Miracloth)Merk-Millipore475855
Ultrawirówka XNP-80Redlica BeckmanA99839
Rotor SW 32 TiRedlica Beckman369650
Probówki ultrawirówkoweBeckman Coulter326823
Szklany homogenizator teflonowy (Potter)Wheaton357426
Kolumna wirowa (Mobicol)Mo Bi TecM1003
Filtr 35µ m dla kolumny wirującej (Mobicol)Mo Bi TecM513515
AcTEVInvitrogen12575-015
Parownik odśrodkowy (Speed Vac)Eppendorf5305000100
FBN1A(PGL35) przeciwciałoAgriSeraAS06 116RRID:AB_2247012
Piasek, FontainebleauVWR27460.295

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
  3. Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
  4. Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
  5. Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
  6. Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
  7. Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
  8. Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
  9. Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
  10. Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
  11. Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
  12. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  13. Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
  14. Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685(2009).
  15. Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
  16. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chloroplast TransloconTOC TIC ComplexesTAP Tag PurificationAffinity PurificationMembrane SolubilizationIgG Beads IncubationTEV Protease ElutionWestern Blot AnalysisMass Spectrometry IdentificationArabidopsis Thaliana

Powiązane artykuły