Artykuł metodologiczny

Mechanizmy leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych przy użyciu izolowanego perfuzji jelita cienkiego szczura

DOI:

10.3791/58533

⸱

26 lutego 2019

 , 
1Department of Biomedical Sciences and NNF Centre for Basic Metabolic Research, The Panum Institute, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy potężny i fizjologiczny model do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wydzielania hormonów jelitowych i wchłaniania jelitowego - izolowane perfundowane jelito cienkie szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelito jest największym organem endokrynnym ciała, produkującym ponad 15 różnych hormonów peptydowych, które regulują apetyt i przyjmowanie pokarmu, trawienie, wchłanianie i dystrybucję składników odżywczych oraz poposiłkowe skoki glukozy. Zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących wydzielanie hormonów jelitowych ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia i przetłumaczenia fizjologii hormonów jelitowych. Tradycyjnie, mechanizmy leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych są badane in vivo (na zwierzętach doświadczalnych lub ludziach) lub przy użyciu pierwotnych kultur komórek błony śluzowej wydzielających hormony jelitowe lub linii komórkowych. Tutaj wprowadzamy izolowane perfundowane jelito cienkie szczura jako alternatywną metodę badania wydzielania hormonów jelitowych. Zaletą tego modelu jest to, że opiera się on na nienaruszonym jelicie, co oznacza, że podsumowuje większość fizjologicznie ważnych parametrów odpowiedzialnych za wydzielanie w badaniach in vivo, w tym polaryzację błony śluzowej, relacje parakrynne i drogi ekspozycji na perfuzję/bodziec. Ponadto, w przeciwieństwie do badań in vivo, izolowane perfundowane jelito cienkie szczura pozwala na prawie pełną kontrolę eksperymentalną i bezpośrednią ocenę wydzielania. W przeciwieństwie do badań in vitro, możliwe jest badanie zarówno wielkości, jak i dynamiki wydzielania oraz odpowiadanie na ważne pytania, takie jak to, jakie bodźce powodują wydzielanie różnych hormonów jelitowych, z której strony jelita (luminalnej lub naczyniowej) stymulowane jest wydzielanie, a także szczegółowa analiza czujników molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi wydzielniczej. Ponadto preparat jest potężnym modelem do badania wchłaniania jelitowego i szczegółów dotyczących dynamiki wchłaniania jelitowego, w tym odpowiedzialnych transporterów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelito jest największym organem endokrynnym ciała, produkującym ponad 15 różnych hormonów peptydowych, które regulują wchłanianie i dyspozycję składników odżywczych, wzrost jelit i modulują apetyt1. Hormony jelitowe są zatem zaangażowane w wiele podstawowych procesów fizjologicznych, a zrozumienie tych wzorców wydzielania i szczegółów molekularnych, które kontrolują wydzielanie odpowiednich hormonów, jest zatem ważne dla naszego podstawowego zrozumienia fizjologicznego i zajęcia się translacyjnymi aspektami działania hormonów jelitowych; Ale jak można badać mechanizmy wykrywania molekularnego leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych? Ogólnie rzecz biorąc, wydzielanie hormonów można badać w nienaruszonych organizmach (ludziach lub zwierzętach doświadczalnych), z izolowanych preparatów jelitowych lub z pierwotnych kultur komórkowych wydzielających hormony jelitowe lub unieśmiertelnionych kultur komórkowych2,3,4,5,6. Naszym preferowanym modelem jest izolowane perfundowane jelito cienkie szczura, które jest fizjologicznie istotnym modelem, który pozwala na szczegółowe badanie wydzielania hormonów jelitowych z optymalną rozdzielczością czasową (szybkość wydzielania można określić z dowolną podstawą czasową co do sekundy), a wyniki można prawdopodobnie przenieść do sytuacji in vivo7. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, jak wykonać tę procedurę, ale najpierw omówimy inne metody badania wydzielania hormonów jelitowych, w tym korzyści i ograniczenia tych modeli w porównaniu z izolowanym perfundowanym jelitem cienkim szczura.

Jeśli ktoś chce ustalić, czy dany związek reguluje wydzielanie pewnych hormonów jelitowych, ostatecznym celem są badania na ludziach. Tak więc, jeśli związek wykazuje duży wpływ na wydzielanie jednego lub kilku hormonów jelitowych u gryzoni (in vivo lub perfuzje) lub z komórek wydzielających hormony (linie komórkowe lub komórki pierwotne), efekt ten ma znaczenie dla medycyny i fizjologii człowieka tylko wtedy, gdy można go potwierdzić u ludzi. Istnieją jednak wyraźne ograniczenia co do rodzaju badań, które można przeprowadzić na ludziach, a zatem badania in vivo na zwierzętach doświadczalnych są często drugą najlepszą opcją dla takich badań. Myszy i szczury są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami doświadczalnymi, prawdopodobnie ze względu na ich dogodne rozmiary, niski koszt i możliwość genetycznej modyfikacji genów podejrzanych o udział w konkretnych pytaniach badawczych (np. wybicie określonego transportera lub receptora). Ogólnie rzecz biorąc, modele in vivo czerpią korzyści z tego, że są fizjologicznie nienaruszone, ale mają również kilka ograniczeń. Co najważniejsze, mały rozmiar gryzoni, zwłaszcza myszy, jest czynnikiem ograniczającym, ponieważ większość testów do oznaczania ilościowego hormonów jelitowych wymaga co najmniej 20 μl osocza (a często znacznie więcej), co oznacza, że co najmniej 100 μl krwi musi zostać pobrane, aby dokonać podwójnej kwantyfikacji. W związku z tym możliwe jest uzyskanie tylko bardzo niewielu próbek odpowiadających próbkom wyjściowym i jednej lub dwóm próbkom po stymulacji (całkowita objętość krwi u myszy 20 g wynosi ~1,4 ml). W związku z tym potencjalne reakcje wydzielnicze (np. szybkie lub późno występujące reakcje) mogą zostać pominięte.

W modelu perfuzji ten problem jest przezwyciężany, ponieważ uzyskuje się duże objętości próbek (szybkość przepływu: 7,5 mL/min), a interwały pobierania mogą być dostosowywane w razie potrzeby, aby zapewnić, że szybkie i krótkotrwałe odpowiedzi nie zostaną pominięte (zbieramy próbki co min)7. Innym problemem związanym z badaniami in vivo na gryzoniach jest to, że większość hormonów jelitowych jest jeszcze szybciej eliminowana lub metabolizowana niż u ludzi8,9,10, co może komplikować późniejszą analizę biochemiczną. Na przykład wykazaliśmy, że GLP-1 jest metabolizowany u myszy w jeszcze szybszym tempie niż u ludzi (gdzie T1/2 wynosi 1-2 min11) i, co ważniejsze, że rozszczepienie GLP-1 u myszy obejmuje, oprócz N-końcowego rozszczepienia przez dipeptydylo-peptydazę-4 (DPP4) (która jest głównym enzymem rozkładającym GLP-1 u ludzi), dalsze rozszczepienie przez enzym neutralną endopeptydazę 24.1112. W związku z tym obecne komercyjne testy do oznaczania ilościowego GLP-1, które są oparte na nienaruszonej izoformie GLP-1 (7-36amid) lub rozszczepionej izoformie DPP-4 (9-39amid), znacznie zaniżają wydzielanie GLP-1 u myszy i skutkują mylącymi wynikami12. W izolowanym perfundowanym jelicie cienkim szczura większość metabolizmu wydzielanych hormonów jest eliminowana lub znacznie zmniejszona, ponieważ unika się degradacji za pośrednictwem osocza i zapobiega ekstrakcji/degradacji wątroby/nerek/płuc (ponieważ perfuzat jest zbierany, gdy opuszcza jelito).

Oczywiście, ważne informacje można uzyskać za pomocą genetycznie modyfikowanych zwierząt, np. myszy z nokautem transportera sodowo-glukozowego-113, ale szczegółowa ocena czujników molekularnych zaangażowanych w wydzielanie często wymaga uwzględnienia wielu miejsc molekularnych, począwszy od transporterów molekularnych do kanałów jonowych i od różnych receptorów sprzężonych z białkiem G do białek wewnątrzkomórkowych. Na przykład, skupiliśmy się na aktywności dziewięciu różnych miejsc molekularnych podczas odkrywania czujników molekularnych odpowiedzialnych za stymulowane glukozą wydzielanie GLP-17. Podobne badanie nie byłoby możliwe in vivo, ponieważ niektóre z zastosowanych związków mają niespecyficzne lub szkodliwe/śmiertelne działanie. Na przykład, korzystając z perfundowanego jelita, można było ocenić rolę wewnątrzkomórkowego metabolizmu glukozy w wydzielaniu GLP-1 i neurotensyny poprzez blokowanie tworzenia ATP za pomocą 2-4-dinitrophenolu7,14, a także rolę kanałów wapniowych bramkowanych napięciem dla stymulowanego kwasami żółciowymi wydzielania GLP-1, NT i PYY3. Rzeczywiście, wysoce toksyczny tetrodotoksyna blokująca kanał sodowy może być z powodzeniem stosowana w badaniach perfuzji. Wreszcie, w modelu perfuzji można bezpośrednio ocenić, gdzie w jelicie określony związek stymuluje wydzielanie określonego hormonu, ponieważ badacz może po prostu wybrać i przygotować pożądany obszar do perfuzji, a jednocześnie można zbadać, czy bodziec powoduje wydzielanie poprzez aktywację czujników molekularnych od strony światła lub naczynia jelita3, 15,16.

Mechanizmy wydzielnicze leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych mogą być również badane za pomocą fragmentów tkanek jelitowych (w tym tkanki ludzkiej), pierwotnych kultur jelitowych (zwykle od myszy), unieśmiertelnionych linii komórkowych wydzielających hormony (pochodzenia mysiego lub ludzkiego), przez tkankę jelitową zamontowaną w komorach Ussing lub przez organoidy (oba najczęściej od myszy)2,3,4,5,6,17,18. W porównaniu z perfuzjami jelitowymi, badania nad fragmentami ludzkich jelit, pierwotnymi hodowlami komórkowymi i liniami komórkowymi są technicznie łatwiejsze do przeprowadzenia i są szybszym i tańszym sposobem generowania danych, ale oczywiście badanie fragmentów jelit wymaga dostępu do świeżych próbek jelit ludzkich. Jednak w tych modelach normalna polaryzacja komórek jelitowych jest z natury utracona, co oznacza, że modele te nie mogą być używane do oceny normalnej aktywacji czujników molekularnych, a procesy wchłaniania również nie mogą być badane. Co więcej, w takich badaniach zwykle stosuje się inkubacje statyczne (trwające do kilku godzin), które są wysoce niefizjologiczne i nie mają nic wspólnego z normalną dynamiką wydzielniczą komórek, ponieważ wydzielany produkt nie jest usuwany, a zatem może wpływać na wydzielanie hormonów. Natomiast w jelicie perfundowanym wydzielane i wchłaniane cząsteczki są skutecznie usuwane przez mikrokrążenie błony śluzowej, tak jak są in vivo, zapewniając utrzymanie gradientów przezbłonkowych, dzięki czemu wchłanianie i wydzielanie może zachodzić w normalnym tempie. Co więcej, hodowle komórkowe mogły ulec dedyferencji od swojego natywnego pochodzenia z komórek enteroendokrynnych, co oznacza, że nie są już reprezentatywne dla komórek natywnych pod względem zawartości peptydów i ekspresji czujników molekularnych, chociaż mogą nadal wydzielać dany hormon. Tak jest na przykład w przypadku linii komórkowych wydzielających GLP-119.

Dlatego uważamy, że pierwotne hodowle komórek lub badania linii komórkowych są najbardziej odpowiednie do celów przesiewowych i do przeprowadzania eksperymentów typowych, które nie mogą być przeprowadzone in vivo lub w izolowanym perfundowanym jelicie. Na przykład, prawdziwą siłą pierwotnych kultur komórkowych i hodowli linii komórkowych jest to, że wewnątrzkomórkowe wtórne przekaźniki (np. Ca2+, cAMP, NAD(P)H) mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym i można badać sygnalizację elektryczną komórek wydzielających hormony20,21,22. Ponadto można przeprowadzić knockdown siRNA, co jest szczególnie przydatne, jeśli określone inhibitory nie są dostępne20,21,22,23,24. Tkanka jelitowa myszy zamontowana w komorach Ussing została ostatnio wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw stymulowanego wydzielaniem GLP-1 przez kwasy żółciowe, podczas gdy organoidy jelitowe (od myszy) i fragmenty ludzkiego jelita zostały również wykorzystane do badania szczegółów molekularnych wydzielania hormonów jelitowych17,25. Podczas gdy ten pierwszy korzysta z polaryzacji2, wszystkie te modele obejmują inkubacje statyczne. Badania nad ludzkimi fragmentami jelit czerpią jednak korzyści z wykorzystania tkanki ludzkiej, a nie gryzoni, co jest ważne, ponieważ różnice gatunkowe w ekspresji tkankowej receptorów 7TM i transporterów molekularnych mogą skutkować różnymi szlakami wykrywania molekularnego między gatunkami. W rzeczywistości większość danych w tej dziedzinie została wygenerowana przez badania na świniach, myszach lub szczurach i pozostaje nieuchwytne, czy te odkrycia można przenieść na ludzi. Pocieszające jest jednak to, że mechanizmy wykrywania molekularnego, które leżą u podstaw stymulowanego glukozą wydzielania GLP-1, wydają się być podobne u myszy, szczurów, ludzi, a profilowanie transkryptomiczne i peptydomiczne mysich i ludzkich komórek L ujawniło silne globalne podobieństwa między tymi dwoma gatunkami7,18,26,27.

Izolowane perfuzjonowane jelito cienkie szczura ma jednak również pewne ograniczenia, które powinny być brane pod uwagę. Co najważniejsze, niemożliwe jest ustalenie, czy dana odpowiedź wydzielnicza wynika z bezpośredniej aktywacji przez substancję badaną docelowych komórek produkujących hormony, czy też jest spowodowana mechanizmem pośrednim. Na przykład, KCl natychmiast zwiększa wydzielanie GLP-1 z perfundowanego jelita7, ale nie wiadomo, czy jest to konsekwencja bezpośredniej depolaryzacji limfocytów L, czy też wynika z depolaryzacji neuronów w pobliżu komórek L, czy też z efektów jednocześnie uwalnianych stymulatorów/inhibitorów parakrynnych. Dane pochodzące z badań z wykorzystaniem perfundowanego jelita, które mają na celu wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wydzielania, powinny być zatem zawsze umieszczane w kontekście danych uzyskanych z innych, bardziej szczegółowych modeli, aby zwiększyć zdolność do ustalenia związku przyczynowego. Na przykład stymulowane glukozą wydzielanie GLP-1 z linii komórkowej wydzielającej GLP-1 GLUTag28,29 oraz z pierwotnych mysich komórek L zależy od aktywności transporterów glukozy (SGLT1 i GLUT2). Zablokowanie tych transporterów w perfundowanym jelicie cienkim szczura również osłabia wydzielanie20, co oznacza, że jest prawdopodobne, że stymulowane glukozą wydzielanie GLP-1 jest w dużej mierze pośredniczone przez bezpośrednie działanie glukozy na komórkę L. Innym ważnym ograniczeniem izolowanego perfundowanego jelita jest to, że niektóre lipidy są trudne do zbadania ze względu na ich hydrofobowość. Chociaż możliwe jest zbadanie końcowych produktów trawienia lipidów (kwasów tłuszczowych, gliceroli diacylowych, lizofosfatydylogliceroli itp.) i chociaż preparat może być w stanie ponownie estryfikować lipidy wewnątrzkomórkowo i być może pakować je w chylomikrony, transport chylomikronów z komórek i ich późniejszy wychwyt przez mleczan kosmków jest zakłócony, ponieważ przepływ limfy w izolowanym jelicie nie może być zabezpieczony. Najprawdopodobniej zatem wchłanianie lipidów zostaje zatrzymane, gdy wchłonięte produkty zaczynają gromadzić się w komórkach. Systemy komórkowe in vitro są jeszcze mniej odpowiednie do badań lipidowych ze względu na brak polaryzacji. Oczywiście to ograniczenie dotyczy tylko lipidów, które są wchłaniane i transportowane przez mleczaki, podczas gdy te wchłaniane przez naczynia krwionośne jelit prawdopodobnie będą obsługiwane normalnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą Duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach (2013-15-2934-00833) i lokalnej komisji etycznej, zgodnie z wytycznymi duńskiego ustawodawstwa regulującego eksperymenty na zwierzętach (1987) i National Institutes of Health (numer publikacji 85-23).

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Zdobądź samce szczurów rasy Wistar (250 g) i trzymaj 2 sztuki w klatce, z dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody, i utrzymuj w cyklu 12:12 godzin światła i ciemności. Nasze zwierzęta wykorzystują nieuzdatnioną wodę i karmę dla gryzoni Alrtromin (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Dania).
    Uwaga: Pozwól zwierzętom na co najmniej tydzień aklimatyzacji.

2. Przygotowania przedoperacyjne

  1. Przygotuj bufor perfuzyjny: bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera uzupełniony 0,1% BSA (frakcja V), 5% dekstranu T-70, 3,5 mmol/L glukozy i 5 mmol/L pirogronianu, fumaranu i glutaminianu (w razie potrzeby); pH 7,4.
  2. Przygotować odpowiednią ilość buforu perfuzyjnego, filtrując go przez filtr o odpowiedniej wielkości i dostosować pH do ~7,5 przez stopniowe dodawanie 5 M HCl.
  3. Dodać 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX) (w razie potrzeby) bezpośrednio do buforu w dniu badania do końcowego stężenia 10 μM,
    UWAGA: IBMX jest inhibitorem fosfodiesterazy, który zwiększa [cAMP]i, a tym samym przywraca wrażliwość i reaktywność jelit w zakresie wydzielania hormonów na bodziec wydzielniczy.
  4. Przygotować roztwór (roztwory) testowy(-e). Przygotuj bodźce naczyniowe o stężeniu 20 razy wyższym niż pożądane stężenie końcowe w przefiltrowanym i dostosowanym pH buforze perfuzyjnym. Przygotować bodźce do badania światła w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej w końcowym stężeniu.
  5. Niełatwo rozpuszczalne związki rozpuścić w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) i rozcieńczyć dalej w buforze perfuzyjnym lub soli fizjologicznej. W przypadku bodźców naczyniowych utrzymuj końcowe stężenie DMSO na poziomie 1% lub niższym, ponieważ stężenia powyżej tego uszkadzają jelito i mogą prowadzić do niespecyficznego wydzielania hormonów jelitowych. Zmierz pH i w razie potrzeby dostosuj do ~7,5.

3. Działanie i perfuzja

UWAGA: Ilustracja konfiguracji perfuzji znajduje się w Rysunek 1.

  1. Znieczulenie szczurów za pomocą schematu znieczulającego, który może utrzymać znieczulenie chirurgiczne i analgezję przez 30-40 minut za pomocą Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g masy ciała, na ml: Hypnorm: 0,08 mg fentanylu, 2,5 mg fluanizonu, 0,45 mg parahydroksybenzoesanu metylu, 0,05 mg parahydroksybenzoesanu propylu, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Dania)
  2. Sprawdź, czy nie ma odruchów (szczypanie palca u nogi), połóż szczura na podgrzewanym stole operacyjnym i wykonaj nacięcie skóry, aby odsłonić jelito.
  3. Odsłoń końcową część okrężnicy, odsuwając jelito cienkie na bok tak bardzo, jak to możliwe. Wiązanie ukrwienia do okrężnicy i wycinanie go stopniowo, zaczynając od końcowej części jelita grubego, przesuwając się w kierunku jelita cienkiego.
    1. Jeśli do perfuzji potrzebna jest tylko pewna część jelita cienkiego (górna połowa), po związaniu zaopatrujących naczyń krwionośnych należy wyciąć niepotrzebne segmenty. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanek, nawilż jelito solą fizjologiczną i użyj wacików do usunięcia tkanki łącznej.
  4. Włóż plastikową rurkę (długość: ~15 cm, średnica zewnętrzna: ~0,4 cm) do światła jelita (w części proksymalnej) i zawiąż ją odpowiednio za pomocą szwów. Ostrożnie przepłukać solą fizjologiczną (temperatura pokojowa), aby opróżnić światło z treści pokarmowej.
  5. Ukrwić światło solą fizjologiczną z izotonicznym roztworem soli fizjologicznej o przepływie 0,25 ml/min, używając strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do pompy strzykawkowej.
  6. Odsuń jelito na bok, aby górna tętnica krezkowa była dostępna i usuń tkankę łączną i tłuszczową, aby odsłonić tętnicę.
  7. Umieść dwa szwy pod tętnicą krezkową za pomocą cienkich kleszczy; jeden ze szwów służy do podnoszenia tętnicy w celu zatamowania krwawienia po przecięciu tętnicy, a drugi służy do zabezpieczenia cewnika, który ma zostać umieszczony w tętnicy. Uważaj, aby nie przebić tętnicy.
  8. Umieść dwa szwy pod żyłą wrotną, aby zabezpieczyć metalowy cewnik, który ma zostać umieszczony w żyle w celu zebrania ścieków perfuzyjnych.
  9. Przed wycięciem otworu w tętnicy krezkowej upewnij się, że cewnik, który ma zostać wprowadzony do tętnicy, jest wypełniony buforem perfuzyjnym, aby zapobiec tworzeniu się zatoru powietrznego.
  10. Wytnij mały otwór w tętnicy krezkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i natychmiast po tym włóż plastikowy cewnik.
  11. Natychmiast po zamocowaniu cewnika należy rozpocząć perfuzję jelita, uruchamiając pompę rolkową (natężenie przepływu = 7,5 ml/min).
  12. Upewnij się, że naczynia krwionośne w jelitach bledną w ciągu kilku sekund, a żyła wrotna staje się blada.
  13. Natychmiast po ustaleniu prawidłowej perfuzji należy wyciąć otwór w żyle wrotnej, wprowadzić metalowy cewnik i zabezpieczyć go szwem.
    UWAGA: Założenie cewnika może być trudne, ale pomaga podniesienie żyły do góry poprzez ostrożne pociągnięcie najbardziej proksymalnego szwu.
  14. Gdy cewniki są już na miejscu, a wydajność perfuzji jest zadowalająca, zabij szczura przez perforację przepony, uważając, aby nie wyrwać cewników.
  15. Zbieraj dane perfuzyjne przez 1 minutę i zmierz objętość. Rozpocznij akwizycję/zapisy ciśnienia perfuzji, klikając przycisk Wykonaj eksperyment w programie do rejestrowania ciśnienia.
  16. Przykryj jelito zwilżoną tkanką, aby zapobiec jego wyschnięciu podczas eksperymentu.
  17. Upewnij się, że dystalny koniec jelita nie jest zablokowany, aby ściek świetlny mógł wyjść, w przeciwnym razie jelito spuchnie, rozwinie się obrzęk, wzrośnie ciśnienie perfuzji, a wydajność perfuzji spadnie.
  18. Pozostaw preparat na około 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Wydzielanie hormonów jelitowych jest bardzo niestabilne przez pierwsze 15 minut perfuzji, więc ten krok równowagi jest potrzebny, aby uzyskać stałą linię bazową.

4. Eksperyment

  1. Po około 30 minutach perfuzji rozpocznij eksperyment od pobrania pierwszej próbki podstawowej za pomocą kolektora frakcji. Pobieraj próbki w żądanym odstępie czasu (np. co minutę zwykle pobiera się 6,5-7,5 ml) i umieść je na lodzie w ciągu kilku minut.
  2. Regularnie sprawdzaj pułapkę bąbelkową i, jeśli zostanie opróżniona, napełnij ją buforem perfuzyjnym.
    1. Pobrać bufor przez trójdrożną zastawkę kropelkową bezpośrednio przed jej wejściem do narządu oraz z cewnika wprowadzonego do żyły wrotnej (po jego perfuzji przez narząd), aby potwierdzić, że narząd jest metabolicznie aktywny. Zbierz próbki na początku i na końcu eksperymentu, aby ocenić żywotność przez cały czas trwania eksperymentu.
    2. Szybkie pomiary próbek za pomocą automatycznego analizatora parametrów krytycznych krwi, ponieważ większość plastikowych pojemników/strzykawek nie jest całkowicie szczelna, co powoduje wymianę z powietrzem atmosferycznym.
  3. Po 10-15 minutach od pobrania linii bazowej, stymulować pierwszą substancją badaną. Stymulacje dotętnicze należy podawać za pomocą pompy strzykawkowej przez zawór trójdrogowy (przepływ = 0,350 ml/min).
  4. Przeprowadzić stymulację światła poprzez początkowe wstrzyknięcie bolusa (2,5 ml/min w ciągu pierwszych 5 minut), w celu zastąpienia izotonicznego roztworu soli fizjologicznej, który jest już w świetle, a następnie podać roztwór testowy o mniejszym natężeniu przepływu (0,5 ml/min).
  5. Aby zapewnić, że światło zostanie szybko opróżnione z substancji badanej po zakończeniu okresu stymulacji świetlnej, przepłukać światło jelita izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, stosując takie same prędkości przepływu jak powyżej.
  6. Pobierać próbki wyjściowe przez 15-30 minut przed podaniem następnej substancji badanej. W zależności od protokołu, w jednym eksperymencie można zwykle uwzględnić 2-3 bodźce testowe. Jeżeli protokół eksperymentalny obejmuje aktywację/inhibicję danego miejsca molekularnego jednocześnie z podaniem danego leku wydzielającego, należy zawsze wstępnie stymulować aktywatorem/inhibitorem na 10-15 minut przed podaniem leku wydzielającego, aby upewnić się, że miejsce molekularne jest zahamowane na samym początku infuzji wydzielania.
  7. Na zakończenie protokołu należy podać (5-10 min) odpowiednią kontrolę pozytywną w celu zbadania reakcji preparatu i pobrać 10-15 minutowe próbki wyjściowe po okresie stymulacji.
    UWAGA: Kilka badanych substancji może być stosowanych jako kontrola pozytywna, np. bodźce zwiększające [cAMP]i (np. foskolina lub IBMX), [Ca2 + ]i (np. bombozyna lub neuromedyna C), środki depolaryzujące (np. 30-50 mM KCl) lub bardziej fizjologicznie istotne bodźce, takie jak makroskładniki odżywcze: glukoza, peptony, aminokwasy itp. Wybór kontroli pozytywnej zależy jednak od wyniku eksperymentu. Glukoza jest na przykład słabym wydzielaniem cholecystokininy (CCK), podczas gdy bombozyna nie jest silnym wydzielaniem glukozależnych peptydów insulinotropowych (GIP)30.
  8. Po zakończeniu eksperymentu należy wyciąć perfundowane jelito, zważyć je i zmierzyć jego długość. Umieścić go w paraformaldehydzie i przechowywać (4 °C) w celu ewentualnej późniejszej analizy histochemicznej integralności/uszkodzenia tkanki, na przykład przez barwienie H&E.

5. Pomiary biochemiczne

  1. Określić ilościowo stężenia wydzielanych peptydów w ściekach żylnych za pomocą własnych lub dostępnych na rynku testów radioimmunologicznych (RIA) lub testów ELISA. W przypadku badań, które dotyczą wchłaniania jelitowego, należy określić ilościowo cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, np. glukozę lub aminokwasy, w ściekach żylnych.
    UWAGA: Perfuzat jest zwykle dobrym buforem podstawowym dla większości analiz, w tym testów opierających się na reakcjach enzymatycznych (takich jak oznaczanie ilościowe glukozy metodą oksydazy glukozowej).

6. Analiza danych

  1. Przedstaw dane na różne sposoby, na przykład jako wykres czasowo-koncentracyjny przedstawiający rzeczywistą produkcję wydzielniczą (przepływ x stężenie) oraz jako wykres kolumnowy przedstawiający całkowitą produkcję wydzielniczą w okresie wyjściowym i okresach odpowiedzi (zwykle 10-15 punktów czasowych).
  2. Wykreślić rzeczywiste zmierzone stężenie odpowiednich hormonów jako jednostki stężenia. (pmol/L),
    UWAGA: Zamiast tego preferowane jest wyrażanie danych jako danych wyjściowych (fmol/min), ponieważ w tym modelu, w przeciwieństwie do badań in vivo, uzyskane wartości są rzeczywistą wydajnością wydzielniczą (ze względu na stały odbiór ścieków perfuzyjnych).
  3. W zależności od liczby grup, które mają być analizowane statystycznie, należy użyć dwustronnego sparowanego testu t (dwie grupy) lub jednoczynnikowej ANOVA do powtarzanych pomiarów (więcej niż dwie grupy), a następnie odpowiedniego testu post-hoc do wielokrotnych porównań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do określenia, czy dany bodziec powoduje wydzielanie hormonu jelitowego, zależy od stałego wydzielania wyjściowego. Ponadto, jeżeli nie zaobserwuje się żadnej reakcji na bodziec, musi być wyraźna silna reakcja wydzielnicza na kontrolę dodatnią, aby wykluczyć, że brak reakcji na bodziec badany nie odzwierciedla ogólnego braku reakcji. Rysunek 2A i 2B pokazuje przykład danych dobrej jakości; Wydzielanie GLP-1 z izolowanego perfundowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolowane perfundowane jelito cienkie szczura jest potężnym narzędziem badawczym, które pozwala na szczegółowe zbadanie dynamiki i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wydzielania hormonów jelitowych. Najważniejszym krokiem dla pomyślnego wytworzenia danych za pomocą tego modelu jest operacja chirurgiczna. Obchodzenie się z jelitami nieuchronnie spowoduje pewne uszkodzenie jelita i dlatego powinno być ograniczone do absolutnego minimum. Co ważniejsze, kluczowa jest szybkość operacji, szczególnie w odniesieniu do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy niniejszej pracy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów mających związek z niniejszym artykułem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta nieograniczonym grantem dla Prof. Jensa Juula Holsta z Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research (Novo Nordisk Foundation, Dania), oddzielnym grantem od Novo Nordisk Foundation na prowadzenie badań nad perfuzją gryzoni (grant nr. NNF15OC0016574), stypendium dla prof. Holsta od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr 695069) oraz Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej w zakresie badań, rozwoju technologicznego i demonstracji (grant nr 266408), a także stypendium podoktorskie dla Rune E. Kuhre z Fundacji Lundbeck (R264-2017-3492). Dziękujemy Jennie E. Hunt i Carolyn F. Deacon za staranną korektę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia do buforu perfuzyjnego
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Merck1.12018.0500
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2 x 2 H2O)Merck102382
Dextran 70Pharmacosmos40014
Sól disodowa kwasu fumarowego (C44H2Na2O4)Sigma AldrichF9642
Glukoza (C6H12O6)Merck108342
Siarczan magnezu hepatahydrat (MgSO4)Merck105886
Chlorek potasu (KCl)Merck104936
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Merck104873
Sól sodowa kwasu pirogronowego (C3H3NaO4)Merck106619
Sód wodorowęglan (NaHCO3)Merck
Chlorek sodu (NaCl)Merck106404
L-glutaminian sodu jednowodny (C5H8NNaO4 x H2O)Merck106445
Nazwa>Company< strong>Numer katalogowyKomentarze
>Perfusion equitment
Uniwersalny system perfuzyjnyHarvard Bioscience, Inc.
732316 JEDNOSTKA PODSTAWOWA UNIPER UP-100, TYP 834Harvard Bioscience, Inc.
Pompa rolkowa, z czterema kanałamiHarvard Bioscience, Inc.730100
WindkesselHarvard Bioscience, Inc.
Cyrkulator termostatyczny, pojemność wanny 3L, 230V/50HzHarvard Bioscience, Inc.
Stół operacyjny, podgrzewany na statywie, typ 873Harvard Bioscience, Inc.
Kaniula z osłoną, OD = 2,0 mm, ID = 1,0 mmHarvard Bioscience, Inc.
732068730125733776733313

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
  3. Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
  4. Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
  5. Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
  6. Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
  7. Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370(2014).
  8. Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
  9. Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
  10. Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
  11. Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
  12. Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
  13. Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
  14. Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
  15. Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
  16. Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
  17. Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
  18. Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
  19. Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11(2016).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
  22. Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
  23. Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
  24. Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
  25. Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
  26. Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
  27. Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
  28. Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
  29. Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
  30. Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
  31. Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
  32. Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wch anianie jelitowepomiar ci nienia perfuzyjnegostymulacja wiat a jelitastymulacja naczyniowasekrecja GLP 1sprz enie wch aniania hormon wbufor perfuzyjnykaniulacja chirurgiczna

Powiązane artykuły