Method Article

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

DOI:

10.3791/58542

⸱

January 18th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białkomocz wynika z przerwania filtra kłębuszkowego, który składa się z fenestrowanego śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i podocytów z ich szczelinowymi membranami. Delikatna struktura filtra kłębuszkowego, zwłaszcza membrany szczelinowej, opiera się na wzajemnym oddziaływaniu różnych białek powierzchniowych komórek. Badanie tych białek powierzchniowych komórek ograniczało się do tej pory do badań in vitro lub analizy histologicznej. W niniejszej pracy przedstawiono mysią metodę znakowania biotynylacji in vivo, która umożliwia badanie białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzji nerek myszy, izolowania kłębuszków nerkowych i przeprowadzania endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Częściowa ocena ilościowa liczebności komórek kłębuszków nerkowych jest łatwo dostępna dzięki tej nowatorskiej metodzie, a wszystkie białka dostępne do perfuzji biotyny i immunoprecypitacji mogą być badane. Ponadto izolacja kłębuszków nerkowych z biotynylacją lub bez biotynylacji umożliwia dalszą analizę kłębuszkowego RNA i białka, a także pierwotną hodowlę komórek kłębuszków nerkowych (tj. pierwotną hodowlę komórek podocytów).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białkomocz jest cechą charakterystyczną uszkodzenia kłębuszków nerkowych i zwykle towarzyszy przerwaniu działania filtra kłębuszkowego1. Filtr kłębuszkowy składa się z fenestrowanego śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i podocytów. Delikatna struktura molekularna filtra kłębuszkowego jest bardzo dynamiczna i podlega transportowi białek powierzchniowych komórek zarówno w zdrowych, jak i chorych nerkach2,3,4,5,6. Wykazano, że endocytoza białek powierzchniowych komórek jest niezbędna do przetrwania podocytów7. Nefryna i podokaliksyna są białkami transbłonowymi ulegającymi ekspresji na podocytach. Nefryna jest szkieletem membrany szczeliny kłębuszkowej kłębuszkowej, podczas gdy podokaliksyna jest sialoglykoproteiną pokrywającą wtórne procesy stopy podocytów8,9,10. Handel endocytarny został wcześniej pokazany dla nefryny i podokalixin3,11,12,13,14.

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, endocytoza białek powierzchniowych komórek nie została jeszcze opisana w literaturze w komórkach śródbłonka kłębuszków nerkowych. Jednak komórki śródbłonka na ogół wyrażają wszystkie niezbędne białka dla różnych typów endocytozy (tj. endocytozy zależnej od klatryny, zależnej od tratwy)15,16. W związku z tym transport powierzchniowy komórek śródbłonka może być badany za pomocą tej metody, na przykład kadheryny śródbłonka naczyniowego (VE) i wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej (ICAM-2) jako białka markerowego powierzchni komórki dla komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych17.

Niestety, nie ma dokładnego modelu in vitro dla delikatnego trójwarstwowego filtra kłębuszkowego, w którym można by badać transport białek na powierzchni komórki. Celem tej metody jest zatem zbadanie transportu białek kłębuszkowych in vivo. Ponadto protokół ten zawiera informacje o tym, jak izolować kłębuszki nerkowe, umożliwiając dalszą analizę kłębuszkowego RNA, białek lub komórek. Podobne techniki izolacji kłębuszków nerkowych zostały opisane przez różne grupy18,19.

Poprzednio, my i inni używaliśmy znakowania ex vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych za pomocą biotynylacji2,3,4,20,21. Jednak w tej metodzie ex vivo izolowane kłębuszki nerkowe były narażone na naprężenia mechaniczne, które mogą wpływać na transport endocytarny. Alternatywnie, znakowanie immunofluorescencyjne białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych jest szeroko stosowane w literaturze2,20,22. Jednak dzięki tej metodzie tylko niewielka liczba białek może być analizowana na jednym szkiełku, a kwantyfikacja obrazów immunofluorescencyjnych jest często trudna.

Ta nowatorska metoda in vivo oferuje niezawodne narzędzie do dokładnego badania obfitości białek na powierzchni komórek kłębuszkowych i transportu w zdrowych i chorych nerkach, i może być stosowana jako dodatek do testów immunofluorescencyjnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy zostały pozyskane jako rasa wewnętrzna z lokalnego zakładu opieki nad zwierzętami lub z Janvier Labs we Francji. Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywaniu (publikacja U.S. National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1996 r.). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi zezwoleniami instytucjonalnymi (rząd stanowy, numer referencyjny LANUV, AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. Przygotowanie instrumentów, rozwiązań i sprzętu

  1. Przygotować 1 l roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym uzupełnionym 1 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 0,1 mM chlorku wapnia (CaCl2) (PBSCM) i przefiltrować przez sterylny filtr.
  2. Przygotuj 5 ml sterylnego PBSCM na mysz do perfuzji i umieść na lodzie.
  3. Dla każdej myszy przygotuj 5 ml sterylnego PBSCM uzupełnionego 0,5 mg/ml biotyny.
  4. Dla każdej myszy należy przygotować 5 ml sterylnego PBSCM i dodać 0,8 x 108 kulek magnetycznych (np. 200 μl roztworu 4 x 108 kulek/ml, bez obróbki wstępnej) w celu embolizacji kłębuszków nerkowych. Przygotuj ten roztwór pod stołem do hodowli komórkowych, aby kulki magnetyczne w oryginalnej probówce były sterylne. Umieść ten roztwór na lodzie.
  5. Przygotuj roztwór hartujący, dodając 100 mM glicyny do PBSCM (5 ml na mysz) i trzymaj go na lodzie.
  6. Przygotować roztwór kolagenazy (0,378 j./ml kolagenazy A w sterylnym PBSCM). Na mysz odpipetuj 1 ml roztworu kolagenazy do probówki o pojemności 2 ml i umieść go na lodzie.
  7. Do mycia przygotować sterylny PBSCM (patrz krok 1.1) w probówce o pojemności 50 ml i umieścić go na lodzie.
  8. Do perfuzji należy użyć pompy strzykawkowej o przepływie 2,0 ml/min.
  9. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 21G. Umieść końcówkę igły w cewniku o długości 20-30 cm (średnica wewnętrzna, ID = 0,58 mm). Połącz cewnik (ID 0,58 mm) z cewnikiem o długości 10 cm (ID 0,28 mm) i odetnij końcówkę mniejszego cewnika skośnie, aby ułatwić wprowadzenie do aorty myszy.
  10. W przypadku zabiegów podwiązywania podczas operacji należy przeciąć trzy jedwabne nici o długości 5-7 cm (4-0 do 6-0) na mysz.
  11. Do operacji przygotuj 3 zaciski chirurgiczne, 2 nożyczki chirurgiczne, 2 pęsety, 2 cienkie pęsety, 1 cienkie nożyczki i waciki. Przygotuj znieczulenie (np. znieczulenie dootrzewnowe ketamina 100 mg/kg masy ciała i ksylazyna 5 mg/kg masy ciała).
  12. Do wyizolowania kłębuszków nerkowych dwóch nerek należy użyć sitka do komórek o średnicy 100 μm, dwóch probówek o pojemności 50 ml i łapacza magnesów.
  13. Przygotować bufor do lizy CHAPS: 20 mM 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS); 20 mM tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris) pH 7,5; 50 mM sodochordydu (NaCl); 50 mM fluorek sodu (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0,1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,0; 2 mM orthovanadan sodu; i 2 mM adenozynotrifosforan (ATP).
  14. Schłodzić wirówki do temperatury 4 °C.

2. Operacja pod mikroskopem

  1. Znieczulić mysz (np. ketaminą/ksylazyną dootrzewnowo, patrz krok 1.11). Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie.
  2. Zdezynfekuj brzuszną stronę myszy za pomocą 70% izopropanolu.
  3. Wykonaj środkowe cięcie przez skórę od miednicy do mostka i usuń skórę z powięzi brzusznej za pomocą pęsety. Przetnij skórę po obu stronach na środku brzucha nożyczkami chirurgicznymi.
  4. Zmień narzędzia chirurgiczne. Zastosuj środkowe cięcie od mieczykowatego do pęcherza moczowego przez warstwę mięśni brzucha i podziel je na cztery ćwiartki za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych. Przymocuj dwie górne części na bok za pomocą zacisków w kierunku szyi myszy za pomocą dwóch zacisków chirurgicznych.
    UWAGA: Brzuch jest teraz otwarty.
  5. Narządy trzewne odłożyć na bok sterylnym wacikiem i przeciąć więzadło wątrobowo-przeponowe cienkimi nożyczkami.
  6. Przygotuj podwiązanie (jedwabną nicią 4-0 do 6-0) wokół aorty proksymalnej tętnic nerkowych na wysokości nadnerczy za pomocą dwóch cienkich pęset. Zaciśnij bliższe podwiązanie aorty, aby znieść przepływ krwi za pomocą pęsety.
  7. Uwolnij dystalną aortę od powięzi, tłuszczu i innych tkanek i przygotuj podwiązanie wokół tętnicy wątrobowej/krezkowej tętnic nerkowych za pomocą cienkiej pęsety chirurgicznej.
  8. Przygotować podwiązanie (jedwabną nicią 4-0 do 6-0) wokół aorty dystalnej tętnic nerkowych i zacisnąć żyłę główną i aortę na wysokości rozwidlenia.
  9. Wytnij mały otwór w aorcie dystalnie do tętnic nerkowych, tak aby otwór miał połowę średnicy aorty. Umieść cewnik w aorcie i przymocuj go za pomocą przygotowanej ligatury.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków w systemie perfuzyjnym, aby zapobiec zatorowości powietrznej.
  10. Rozpocznij perfuzję za pomocą lodowatego PBSCM przy natężeniu przepływu 2 ml/min.
  11. Wytnij otwór w żyle nerkowej na poziomie tętnic nerkowych cienkimi nożyczkami chirurgicznymi i zaciśnij podwiązanie wokół tętnic wątrobowych i krezkowych.
    UWAGA: Nerki powinny zblednąć po rozpoczęciu perfuzji.

3. Biotynylacja in vivo

  1. Zmienić strzykawkę bez pęcherzyków powietrza na lodowaty PBSCM uzupełniony 0,5 mg/ml biotyny do znakowania powierzchniowego i przelać nerki na 5 ml przy natężeniu przepływu 2 ml/min.
    UWAGA: Roztwory PBSCM należy delikatnie wymieszać (np. obracając probówki o pojemności 50 ml), aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Po zasysaniu roztworu ze strzykawki należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub powietrze ze strzykawki. Użyj dodatkowej kaniuli (21G) na strzykawce, aby wypełnić przestrzeń w kaniuli, która jest podłączona do systemu cewnika. Na koniec wbij strzykawkę do kaniuli z cewnikiem bez pęcherzyków.
  2. Zmienić strzykawkę bez pęcherzyków na lodowatą PBSCM uzupełnioną 100 mM glicyny w celu ugaszenia kłębuszków nerkowych i perfuzji 5 ml przy przepływie 2 ml / min.
  3. Zmień strzykawkę bez pęcherzyków powietrza na lodowatą PBSCM uzupełnioną 200 μl kulkami magnetycznymi/ml i perfuzją nerkową w ilości 2 ml/min.
    UWAGA: Na powierzchni nerki widoczna będzie embolizacja kłębuszków nerkowych z brązowymi kulkami magnetycznymi.

4. Izolacja kłębuszków nerkowych od dwóch nerek

  1. Usunąć nerki na wnęce i wyjąć kapsułkę. Umieść nerki na lodzie w 15 ml PBSCM w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Poddaj mysz eutanazji z zwichnięciem szyjki macicy w znieczuleniu po pobraniu nerek. Zabiegi chirurgiczne i perfuzyjne trwają około 20-22 min.
  2. Pokrój nerki na najmniejsze możliwe kawałki za pomocą nowego ostrza o podwójnej krawędzi. Przenieść tkankę do probówki o pojemności 2 ml z 1 ml kolagenazy A (patrz krok 1.6) i trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przed i po trawieniu delikatnie wymieszać za pomocą pokrojonej pipety o pojemności 1000 μl.
  3. Przepłukać strawioną tkankę przez sitko o wielkości 100 μm za pomocą lodowatego PBSCM. Delikatnie użyj skrobaka do komórek, aby zmielić pozostałą tkankę przez sitko do komórek, a następnie spłucz ją lodowatym PBSCM do całkowitej objętości 50 ml.
  4. Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z nieco mniejszą ilością niż 1,5 ml lodowatego PBSCM podczas wirowania osadu. Następnie umieścić zawiesinę kłębuszkową w nowej probówce o pojemności 2 ml.

5. Mycie

  1. Użyj łapacza magnesu, aby odciągnąć kłębuszki nerkowe na bok. Odczekaj 1 minutę, zanim kłębuszki przesuną się w kierunku magnesu.
  2. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, podczas gdy probówka o pojemności 2 ml pozostaje w chwytaczu magnesów. Podczas pierwszego i drugiego etapu płukania (patrz krok 5.3) w probówce pozostaje 250 μl supernatantu, aby uniknąć utraty kłębuszków nerkowych. Wykonaj tę procedurę szybko, aby uniknąć opadania konstrukcji rurowych na dno rury.
    UWAGA: W przeciwnym razie procedura prania potrwa dłużej.
  3. Wyjmij probówkę o pojemności 2 ml z łapacza magnesów i dodaj 1 ml PBSCM, pipetuj w górę iw dół (bardzo ważne), a następnie wiruj.
  4. Włóż rurkę z powrotem do łapacza magnesów i zacznij od kroku 5.2.
  5. Powtarzaj etapy mycia, aż czystość kłębuszków nerkowych osiągnie 90%. W tym celu należy zbadać reprezentatywną podwielokrotność supernatantu pod mikroskopem (40-100X).
    UWAGA: Kłębuszki pojawią się jako okrągłe struktury zawierające brązowe kulki magnetyczne. Wydłużone struktury to fragmenty rurowe, a swobodne koraliki magnetyczne pojawiają się jako brązowe okrągłe kropki. Szczątki komórkowe mogą wyglądać jak nieporęczne struktury.
  6. Jeśli zostanie osiągnięta czystość, oszacować liczbę kłębuszków nerkowych, rozpuszczając je w 1 ml PBSCM. Po wymieszaniu pobrać podwielokrotność 10 μl i policzyć kłębuszki nerkowe pod mikroskopem. Obliczyć liczbę kłębuszków nerkowych za pomocą następującego równania: końcowa liczba kłębuszków nerkowych = liczba kłębuszków w 10 μl podwielokrotności x 100.
  7. Udana izolacja kłębuszków nerkowych prowadzi do zasięgu 10 000-40 000 kłębuszków nerkowych.

6. Ekstrakcja białek i immunoprecypitacja (IP)

  1. Zebrać kłębuszki nerkowe przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 6800 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą łapacza magnesów i ponownie zawiesić osad w lodowatym buforze do lizy (np. 30 000 kłębuszków w 300 μl; CHAPS, patrz krok 1.11). Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora tkankowego z najwyższą prędkością przez 30 s i lizować je na lodzie przez 30 minut.
  2. Usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant zawierający lizat komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę.
  3. Zmierzyć stężenie białka w supernatantze za pomocą metody opartej na bicinchoninie (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Udana liza 30 000 kłębuszków nerkowych daje ilość białka kłębuszkowego 700-1 000 μg/ml. Dostosuj do równych ilości białka za pomocą buforu do lizy.
  4. Pobrać podwielokrotność 10% całkowitej objętości lizatu kłębuszkowego i dodać 2x Laemmli + ditiotreithol (DTT) przed inkubacją przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  5. W przypadku IP inkubować resztę lizatu z kulkami agarozy streptawidyny przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce nad głową.
  6. Odwirować kulki agarozowe przy 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i dodać 800 μl buforu do lizy w celu przepłukania kulek w celu niespecyficznego wiązania białka.
  7. Powtórz pranie 3 razy i całkowicie usuń supernatant.
  8. Dodać 30 μl 2x Laemmli + DTT i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  9. Załaduj sondy lizatu i IP na 10% żel SDS i uruchom żel SDS przy napięciu 70 V przez 30 minut, a następnie przy 20 mA na żel przez 1,5 godziny. Następnie osuszaj żel przez 2 godziny przy 200 mA na membranie nitrocelulozowej.
  10. Zablokować błonę nitrocelulozową na noc w temperaturze 4 °C za pomocą 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze do mycia.
  11. Inkubować błonę z badanym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. Przemywać buforem płuczącym 3 razy przez 5 minut na wytrząsarce i inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania.
  12. Wizualizacja sond lizatu i immunoprecypitacji na membranie za pomocą środka chemiluminescencyjnego o wysokiej rozdzielczości z kamerą CCD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby dokładnie wyizolować kłębuszki nerkowe, konieczne jest najpierw perfuzja mysich nerek za pomocą PBSCM. Perfuzja z PBSCM sprawia, że nerki bledną (Rysunek 1A). Embolizacja kłębuszków nerkowych za pomocą kulek magnetycznych będzie widoczna jako brązowe kropki na powierzchni nerki (Rysunek 1B). Izolacja kłębuszków nerkowych za pomocą łapacza magnesu może wskazywać na zanieczyszczenie kanalikami nerkowymi (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda umożliwia skuteczną izolację kłębuszków nerkowych w celu zbadania kłębuszkowego RNA lub białka. Ponadto z izolowanych kłębuszków nerkowych można przeprowadzić pierwotne hodowle komórek kłębuszków nerkowych. Jeśli biotyna zostanie zastosowana przed izolacją kłębuszków nerkowych, można przeprowadzić znakowanie białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych. Dzięki tej metodzie można badać in vivo transport białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych i możliwe jest częściowe określenie ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Blanki Duvnjak za wyjątkową pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 do M.W. i QU280/3-1 do I.Q. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji i przygotowaniu manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Motic SMZ168 BLMikroskop MoticSMZ168BLdo chirurgii myszy
KL1500LCDMikroskopia pulchowa i Lorenza150500światło do chirurgii myszy
Rompun (Xylazin) 2%BayerPZN:01320422znieczulenie
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rcienkie nożyczki do cięcia aorty
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rdo cięcia brzucha
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rdo operacji do momentu otwarcia jamy brzusznej
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rdo zabiegów chirurgicznych 
SeraflexSerag WiessnerIC108000nić jedwabna
Ketamina 10%znieczulenieMedistar
Rompun (Xylazin) 2%znieczulenieBayera
Rurka polietylenowa o drobnym otworze ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Cewnik
polietylenu o drobnym otworze ID 0,58 mm OD 0,96 mmCewnikPortex800/100/200
Aparat Harvard 11 PlusAparat Harvard70-2209pompa strzykawkowa
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotynaThermo Scientific21335biotyna
Dynabeads Nietknięte mysie limfocyty TInvitrogen11413Ddo embolizacji kłębuszków nerkowych
Kolagenaza ARoche10103578001do trawienia tkanki nerkowej
DynaMag-2Invitrogen123.21DŁapacz magnesów
100µ m Barwnik komórekGreiner-bio542000do izolacji kłębuszków nerkowych
Axiovert 40 CFLZeissniedostępnyw celu potwierdzenia czystości kłębuszków nerkowych
TissueRuptorQuiagen9002755Homogenizator tkankowy
CHAPSSigma-AldrichC3023do buforu do lizy
Tris-HCLSigma-AldrichT5941do buforu do lizy
NaClVWR chemicals27810295do buforu do lizy
NaFSigma-Aldrich201154do buforu do lizy
EDTASigma-AldrichE5134do buforu do lizy
ATPSigma-Aldrich34369-07-8do buforu do lizy
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta
Przeciwciało nefrynyProgenGP-N2dla
poliklonalnego kozła anty-podokaliksyna przeciwko westernblotR& D SystemsAF15556-SPdla żywicy agarozowej westernblot
StreptawidynaThermo Scientific20347do immunoprecypitacji
Sefaroza białka A CL-4BGE Healthcare17096303do immunoprecypitacji
poliklonalne królicze przeciwciało anty-p57SCBTsc-8298do immunohistochemii
mysie monoklonalne przeciwciało anty-beta aktyny, klon AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot kontrola ładowania
królika anty-p44/42komórkowa4695dla westernblot
Pierce Streptavidin-HRP o wysokiej czułościThermo Scientific21130
poliklonalnego przeciwciała ICAM-2 myszyR& D SystemsAF774dla
myszy poliklonalnej westernblot anty-VE-kadherynyR& D SystemsAF1002dla westernblot
z sygnalizacja dla westernblot

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

Related Articles