Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/58545

⸱

4 czerwca 2019

 ,  ,  , 
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki obrazowania oparte na fluorescencji, w połączeniu z rozwojem mikroskopii świetlnej, zrewolucjonizowały sposób, w jaki biolodzy komórkowi prowadzą badania obrazowania żywych komórek. Metody wykrywania RNA znacznie się rozszerzyły od czasu, gdy badania powiązały lokalizację mRNA specyficzną dla miejsca z regulacją ekspresji genów. Dynamiczne procesy mRNA można teraz wizualizować za pomocą podejść wykrywających mRNA, w połączeniu z zestawami mikroskopowymi, które są wystarczająco szybkie, aby uchwycić dynamiczny zakres zachowania molekularnego. Technologia latarni molekularnej to podejście oparte na hybrydyzacji, zdolne do bezpośredniego wykrywania endogennych transkryptów w żywych komórkach. Latarnie molekularne to wewnętrznie wygaszone, dyskryminujące pojedyncze nukleotydy sondy kwasów nukleinowych, które fluoryzują tylko po hybrydyzacji z unikalną sekwencją docelową. W połączeniu z zaawansowaną mikroskopią fluorescencyjną i obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości umożliwiają one przestrzenne i czasowe śledzenie wewnątrzkomórkowego ruchu mRNA. Chociaż technologia ta jest jedyną metodą zdolną do wykrywania endogennych transkryptów, biolodzy komórkowi nie przyjęli jeszcze w pełni tej technologii ze względu na trudności w projektowaniu takich sond do obrazowania żywych komórek. Nowa aplikacja, PinMol, pozwala na ulepszone i szybkie projektowanie sond najlepiej nadających się do efektywnej hybrydyzacji z docelowymi regionami mRNA w żywej komórce. Ponadto akwizycja obrazów w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości i obecne oprogramowanie do analizy obrazów typu open source pozwalają na uzyskanie wyrafinowanych danych, co prowadzi do dokładniejszej oceny złożoności leżącej u podstaw dynamicznych procesów związanych z cyklem życia mRNA.

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół projektowania i dostarczania molekularnych latarni do komór jajowych Drosophila melanogaster. Bezpośrednie i wysoce specyficzne wykrywanie i wizualizacja endogennych matczynych mRNA odbywa się za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Dane obrazowe są przetwarzane i analizowane za pomocą wykrywania i śledzenia obiektów w oprogramowaniu Icy w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat dynamicznego ruchu mRNA, które są transportowane i lokalizowane w wyspecjalizowanych regionach oocytu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania biologii komórki, które wizualizują dynamiczne zdarzenia z rozdzielczością przestrzenną i czasową, stały się możliwe dzięki rozwojowi technik obrazowania żywych komórek opartych na fluorescencji. Obecnie wizualizację mRNA in vivo uzyskuje się za pomocą technologii opartych na interakcjach aptamer-białko RNA, indukowanej aptamerem RNA fluorescencji barwników organicznych i wyżarzaniu sondy kwasów nukleinowych1,2,3. Wszystkie oferują wysoką specyficzność, czułość i stosunek sygnału do tła. Jednak podejścia skoncentrowane na aptamerach RNA wymagają rozległej manipulacji genetycznej, w której transgen jest modyfikowany do ekspresji RNA ze sztucznymi motywami strukturalnymi, które są wymagane do wiązania białka lub barwnika organicznego. Na przykład system MS2/MCP wymaga koekspresji transgenu wyrażającego konstrukt RNA zawierający wiele tandemowych powtórzeń sekwencji wiążącej białko płaszcza MS2 bakteriofaga (MCP) oraz innego transgenu kodującego białko fluorescencyjne połączone z MCP4,5. Dodanie takich drugorzędowych motywów strukturalnych do RNA, wraz z masywnym, fluorescencyjnie znakowanym białkiem, wzbudziło obawy, że może to mieć wpływ na natywne procesy RNA6. Technologią, która rozwiązuje ten problem i oferuje dodatkowe unikalne korzyści, jest podejście oparte na kwasach nukleinowych, molekularne latarnie (MB). MB pozwalają na multipleksowe wykrywanie endogennych mRNA, rozróżnianie zmian pojedynczych nukleotydów i szybką kinetykę hybrydyzacji z docelowym mRNA7,8. MB to sondy oligonukleotydowe, które pozostają w wygaszonym fałdzie spinki do włosów przed poddaniem się fluorogenicznej zmianie konformacyjnej po hybrydyzacji do swoich celów (Rysunek 1C)9. Kilka grup odniosło sukces w użyciu MB do wykrywania zarówno niekodujących RNA (mikroRNA i lncRNA)10,11,12,13, retrowirusy RNA14, jak i dynamiczne interakcje DNA-białko15. Zostały one z powodzeniem wykorzystane do obrazowania w różnych organizmach i tkankach, takich jak zarodki danio pręgowanego16, neurons13, tumor tissue17, różnicowanie kardiomiocytów18 i Salmonella19.

Tutaj opisujemy podejście, podejście do projektowania, dostarczania i wykrywania endogennych mRNA w żywych komorach jajowych D. melanogaster w połączeniu z zestawem mikroskopowym, który jest wystarczająco szybki, aby uchwycić dynamiczny zakres aktywnego transportu molekularnego. Komora jajowa D. melanogaster posłużyła jako idealny wielokomórkowy system modelowy dla szerokiego zakresu badań rozwojowych, od wczesnego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej i ekspresji genów matki po generowanie segmentalnego planu ciała 20,21. Komory jajowe są łatwe do odizolowania, duże i przezroczyste oraz są w stanie wytrzymać wielogodzinne analizy ex vivo, co czyni je bardzo podatnymi na eksperymenty obrazowe. Wiele prac koncentrowało się na asymetrycznej lokalizacji matczynych transkryptów w dyskretnych regionach subkomórkowych przed aktywną translacją. W szczególności lokalizacja mRNA oskar i jego późniejsza translacja na tylnym biegunie oocytu musi odbywać się w ściśle regulowany sposób, aby uniknąć śmiertelnego dwuogonowego fenotypu zarodka22. mRNA oskar jest transkrybowane w 15 komórkach linii rozrodczej, zwanych komórkami pielęgniarskimi, i aktywnie transportowane przez mostki cytoplazmatyczne, zwane kanałami pierścieniowymi, do oocytu, komórki linii rozrodczej, która staje się dojrzałą komórką jajową i ostatecznie zostaje zapłodniona (Figura 1A). Znaczna ilość dostępnych już informacji na temat dynamicznej rekrutacji i wymiany czynników białkowych do i z oskar mRNP, wraz z jego dalekimi podróżami wewnątrzkomórkowymi, sprawiają, że oskar jest preferowanym kandydatem do badania wielu procesów cyklu życiowego mRNA. MB odegrały kluczową rolę w ujawnieniu szczegółów dotyczących procesu lokalizacji mRNA oraz rozszyfrowaniu regulacji i funkcji czynników białkowych, które kontrolują transport mRNA podczas oogenezy Drosophila. W szczególności, poprzez mikrowstrzykiwanie MB do komórek pielęgniarskich i przeprowadzanie eksperymentów obrazowania żywych komórek, możliwe jest śledzenie endogennych mRNA8,23.

Przedstawiona tutaj mapa drogowa oferuje etapy kompletnego procesu, od przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą MBs, pozyskiwania danych obrazowania, do przeprowadzenia analizy danych w celu śledzenia endogennego mRNA w jego naturalnym środowisku komórkowym. Kroki mogą być modyfikowane i dalej optymalizowane, aby sprostać potrzebom badaczy pracujących z innymi typami tkanek/komórek w ich własnych warunkach laboratoryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie MB do obrazowania żywych komórek

  1. Złóż docelową sekwencję RNA, aby przewidzieć drugorzędową strukturę celu mRNA za pomocą "formy RNA" z serwera mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Wklej/prześlij sekwencję docelową w formacie FIPSA, wybierz 5 lub 10% podoptymalności (struktury o swobodnej energii składania w granicach odpowiednio 5 lub 10% wartości MFE) i odpowiednio dostosuj maksymalną liczbę obliczanych zagięć (np. większą dla 10% nieoptymalnej atrybucy).
      Uwaga: Włączenie suboptymalnych struktur drugorzędowych podczas projektowania MB pozwala na identyfikację regionów w docelowym mRNA, które mogą być bardziej elastyczne lub sztywniejsze niż przewidywano dla samej struktury minimalnej energii swobodnej (MFE), co poprawia ogólny projekt MB nadających się do obrazowania żywych komórek.
    2. Wybierz "zadanie natychmiastowe" dla celów mRNA zawierających 800 nukleotydów (nt) lub "zadanie wsadowe" dla długości mRNA od 801 do 8,000 nt. Zapisz plik "ss-count" jako prosty plik tekstowy.
    2. Użyj pliku "ss-count" uzyskanego w kroku 1.1 jako danych wejściowych dla programu PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) z żądanymi parametrami, aby zaprojektować kilka MB dla celu mRNA (zobacz samouczki opisujące użycie programu PinMol 24 na https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. Określ swoistość wybranych MB, wykonując analizę BLAST: użyj "blastn" z odpowiednią bazą danych (np. dla MB specyficznych dla mRNA oskara użyj bazy danych "refseq-rna" i organizmu Drosophila melanogaster).
    2. Zidentyfikuj dowolną specyficzną tkankowo ekspresję docelowego mRNA (np. dla oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray lub modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) i porównaj z dowolnymi pozytywnymi trafieniami BLAST. Wyeliminuj sondy, które wykazują >50% homologii krzyżowej z innymi mRNA, które również ulegają ekspresji w tkance/komórce będącej przedmiotem zainteresowania.
  3. Wybierz parę fluoroforów i wygaszacza odpowiednią dla dostępnego zestawu mikroskopowego do obrazowania żywych komórek (np. Cy5/BHQ2)25.

2. Synteza, oczyszczanie i charakterystyka MB

  1. Użyj własnej syntezy i oczyszczania, jak opisano wcześniej7, lub usług od dostawców komercyjnych, aby zsyntetyzować i oczyścić od jednego do pięciu MB (patrz powyższa uwaga), używając następującego schematu etykietowania: [5'(Fluorofor)-(C3 lub C6 linker)-(sekwencja 2'-O-metylu MB)-(Quencher)3']. Oczyszczanie MB za pomocą HPLC z odwróconą fazą, we własnym zakresie lub korzystając z usług komercyjnego dostawcy.
    nuta: Fosforamidyty stosowane do automatycznej syntezy sondy muszą mieć modyfikację rybonukleotydu 2'-O-metylowego. Można również użyć chimer naprzemiennych modyfikacji zablokowanego kwasu nukleinowego (LNA) i 2'-O-metylu, aby zwiększyć stabilność hybrydy między krótszym MB a jej docelowym mRNA26.
  2. Zsyntetyzuj oligonukleotydy DNA, które pasują do sekwencji docelowego regionu RNA, a zatem są komplementarne do regionu sondy MB, do wykorzystania w charakterystyce in vitro (patrz kroki od 2.3 do 2.5; powyższa uwaga). Zmaksymalizuj hybrydyzację MB z naśladowcą docelowego oligonukleotydu DNA, umieszczając na każdym końcu celu DNA cztery dodatkowe nukleotydy, jak stwierdzono w docelowej sekwencji mRNA.
    Uwaga: Bardziej rygorystyczną charakterystykę skuteczności MB w wykrywaniu docelowej sekwencji można przeprowadzić przy użyciu zsyntetyzowanych in vitro celów RNA zamiast komplementarnych oligonukleotydów DNA8.
  3. Przeprowadzić denaturację termiczną samego MB, zmierzyć jego temperaturę topnienia (Tm) i potwierdzić, że MB przyjmuje pożądany kształt spinki do włosów w temperaturze fizjologicznej. Zaobserwowaliśmy wartości Tm w zakresie od 60 do 90 °C.
  4. Przeprowadzić termiczną denaturację MB w obecności celu oligonukleotydu DNA i zmierzyć Tm hybrydy docelowej MB:DNA, jak opisano wcześniej7. Dla hybrydy MB:DNA pożądana jest temperatura Tm między 55 a 60 °C.
  5. Przeprowadź reakcje hybrydyzacji in vitro z odpowiednim celem oligonukleotydowym DNA i określ efektywność tworzenia hybrydy MB:DNA w temperaturze fizjologicznej, jak opisano wcześniej7. Pożądana jest szybka kinetyka hybrydyzacji z naśladownictwem docelowego DNA, jednak MB, które nie wykazują wysokiej skuteczności hybrydyzacji z celami DNA, mogą mieć lepszą wydajność z docelowym mRNA in vitro i / lub in vivo.

3. Preparacja i przygotowanie indywidualnych komór na jajka do mikroiniekcji

  1. Karm nowo wyklute, kryte samice przez 2-3 dni świeżą pastą drożdżową.
  2. Znieczulij muchy na podkładce CO2 i za pomocą cienkiej pęsety (Dumont #5) przenieś 1-2 samice do kropli oleju Halocarbon 700 na szklanym szkiełku nakrywkowym.
  3. Za pomocą pęsety zorientuj muchę grzbietową stroną do góry pod mikroskopem stereoskopowym. Wypreparuj żeński brzuch, wykonując małe nacięcie na tylnym końcu i delikatnie ściśnij parę jajników w oleju.
  4. Umieść jajniki na kropli oleju na nowym szkiełku nakrywkowym. Delikatnie przytrzymaj jeden jajnik jedną pęsetą, jednocześnie ściskając najmłodsze stadia jajnika drugą pęsetą. mRNA oskara jest aktywnie zlokalizowane w połowie oogenezy i po niej (etapy > 7), a młodsze komory jajowe (etapy < 7) są trudniejsze do wstrzyknięcia i nie przeżywają tak długo. Powoli przeciągnij szkiełko nakrywkowe (ruchem w dół), aż poszczególne jajniki lub komory jajowe zostaną odizolowane i wyrównane w pionie. Następnie oddziel komory pojedynczego jaja, przesuwając niepożądane etapy z łańcucha jajowego jajnika.
    nuta: Upewnij się, że indywidualnie drażnione komory na jajka nie unoszą się w oleju i przylegają do szkiełka nakrywkowego. Jest to ważne zarówno dla udanej mikroiniekcji, jak i akwizycji obrazu.

4. Mikroiniekcja MB do komórek pielęgniarskich komór jajowych

  1. Przygotuj roztwór MB, używając jednej latarni molekularnej (np. osk2216Cy5) lub mieszanki dwóch MB, które celują w różne mRNA i które są znakowane spektralnie różnymi fluoroforami (np. osk2216Cy5 i drongo1111Cy3). Użyj stężenia 200-300 ng/μL na każdy MB w HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 i 100 mM NaCl). Dla koktajlu czterech MB znakowanych tym samym fluoroforem, które są ukierunkowane na ten sam mRNA w ilości 200 ng/μL każdy w HybBuffer (np. osk82, osk1236, osk2216). Odkręcić roztwór MB bezpośrednio przed załadowaniem igły do mikrowstrzyknięcia.
  2. Wybierz cel. Obiektyw z olejkiem 40x jest zalecany do znalezienia odpowiedniej komory na jajka i wykonania mikroiniekcji.
  3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z wypreparowaną komorą na jaja na stoliku mikroskopu. Ustawić obiektyw w pozycji ostrości i zidentyfikować komorę jajową w średnim lub późnym stadium rozwoju, która jest prawidłowo zorientowana do mikroiniekcji (tj. z osią AàP prostopadłą do końcówki igły, aby umożliwić łatwe wstrzyknięcie w komórkę pielęgniarską proksymalną do oocytu).
  4. Załaduj igłę (dostępną w handlu lub przygotowaną we własnym zakresie27) roztworem ~1 μL MB (patrz krok 4.1) i podłącz ją do mikrowtryskiwacza. W przypadku mikroiniekcji w komorach jajowych D. melanogaster należy ustawić igłę (patrz tabela materiałów) pod kątem <45° do stolika mikroskopu (np. 30°), aby uniknąć przebicia kilku komórek pielęgniarskich.
  5. Ustawić wtryskiwacz z ciśnieniem wtrysku 500-1 000 hPa i ciśnieniem kompensacyjnym 100-250 hPa (patrz tabela materiałów).
  6. Powoli przesuwaj stolik, aby wprowadzić w pole widzenia obszar kropli oleju pozbawiony komór na jajka.
  7. Za pomocą joysticka mikromanipulatora delikatnie opuść igłę do kropli oleju i ustaw jej końcówkę w kierunku obrzeży pola widzenia.
  8. Wykonać funkcję "czyszczenia", aby usunąć powietrze z końcówki igły i upewnić się, że jest przepływ z igły.
  9. Ustaw igłę w pozycji wyjściowej i skup się na komorze na jaja, która ma być mikrowstrzyknięta, a następnie ustaw igłę z powrotem w ostrości i umieść ją w pobliżu krawędzi komory na jaja.
  10. Wykonaj precyzyjną regulację położenia Z obiektywu, tak aby błona oddzielająca komórki pęcherzykowe od komórek pielęgniarskich była ostra.
  11. Wprowadzić igłę do komórki pielęgniarskiej i wykonywać wstrzyknięcie przez 2-5 sekund.
  12. Delikatnie wyjąć igłę i cofnąć ją do pozycji wyjściowej.
  13. Zmień obiektyw na żądane powiększenie do akwizycji obrazu (60-63x lub 100x), ustaw ostrość na komorze jaja i rozpocznij akwizycję.

5. Pozyskiwanie danych za pomocą zestawu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów dla naszej konkretnej konfiguracji.

  1. Skonfiguruj protokół akwizycji, aby nagrać stos XYZCt obrazów 8-16-bitowych (XYZ = głośność, C = kanał, t = czas).
  2. Wybierz linie laserowe dla żądanych kanałów (np. laser 641 nm dla Cy5 i 491 nm dla GFP) i pobierz kanały sekwencyjnie: najpierw sygnał fluorescencyjny w każdym kanale, a następnie zmień pozycję Z, aby umożliwić prawidłową analizę kolokalizacji.
  3. Wybierz krok Z (np. 0,3 μm) oraz górną i dolną granicę Z (np. od -2 μm do 2 μm).
  4. Wprowadź czas akwizycji i częstotliwość próbkowania (np. co 15-30 s przez maksymalnie 1 godzinę).
  5. Zainicjuj przejęcie.

6. Przetwarzanie, analiza danych w celu uzyskania informacji o śledzeniu i kolokalizacji oraz przygotowanie plików wideo

  1. Przetwarzanie obrazu
    1. Pobierz, rozpakuj i otwórz Icy, otwartą platformę społecznościową dla informatyki bioobrazowej (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Otwórz stos XYZCt uzyskany w kroku 5: Obraz/Sekwencja >Plik>Otwórz.
    3. Konwertuj stos na ImageJ: Narzędzia ImageJ>> Konwertuj na IJ, mają włączony tryb odłączony.
    4. Utwórz podstos (wybór zakresu kroków Z i punktów czasowych do dalszej analizy): ImageJ>Image>Stacks>Tools>Make Substack...; wybierz żądane kanały, kroki Z i punkty czasowe.
    5. Zapisz substack jako plik TIFF: ImageJ>File>Save As>Tiff...; użyj tego pliku do kolejnych kroków.
    6. Podziel kanały: ImageJ>Image>Color>Split Channels.
    7. Odejmij tło, używając stosu tła: ImageJ>Process>Image Calculator..., lub korzystając z opcji Tocząca się kula: ImageJ>Process>Subtract Background..., wybierz promień toczącej się kuli. Wyświetl podgląd obrazu dla wybranego promienia przed wybraniem opcji "Akceptuj".
      Uwaga: Sygnał tła będzie wynikał głównie z niewłaściwego wygaszania fluroforu. Stosunek sygnału do tła (S:B) jest często używany jako wskaźnik "jasności" MB i jest mierzony na podstawie eksperymentów hybrydyzacji in vitro docelowego oligonukleotydu MB i DNA. Na przykład MB osk1236 i osk2216 mają S:B odpowiednio ~81 i ~120.
    8. Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału: ImageJ>Image>Adjust>Brightness/Contrast, wybierz Zastosuj.
    9. Zapisz każdy kanał jako osobny plik TIFF: ImageJ>File>Save As>Tiff....
    10. Scal dwa kanały: ImageJ>Image>Color>Merge Channels...; wybierz kanały. Zapisz nowy stos jako nowy plik TIFF (patrz krok 6.1.8).
  2. Wykrywanie i śledzenie miejsc
    1. Konwertuj z powrotem na Icy: ImageJ>Tools>Konwertuj na Icy.
    2. Podziałka liniowa jest automatycznie nakładana na stos po konwersji do formatu Icy, jeśli zainstalowana jest wtyczka podziałki liniowej [Search using Plugins>Setup>Online plugin]. W razie potrzeby edytuj podziałkę liniową za pomocą okna Inspektor (prawa strona ekranu)>zakładka Warstwa>Nazwa>Pasek skali.
    3. Odznacz/dezaktywuj ikonę "oka" dla paska skali na karcie Warstwa>Nazwa, aby usunąć podziałkę liniową z oryginalnego stosu. Można go ponownie aktywować na ostatnim stosie.
    4. Zapisz nowo przetworzony stos, wykonując zrzut ekranu za pomocą ikony "aparatu" z paska menu okna obrazu, "Zrób zrzut ekranu bieżącego widoku" i Plik>Zapisz jako>Tiff....
    5. Określ czułość plamki, jeśli parametry czułości plamki zostały już określone, przejdź do kroku 6.2.7.
    6. Wykryj spoty: wybierz okno z obrazem lub stosem do analizy, Detection&Tracking>Detection>Spot Detector i wypełnij parametry Ustawienia:
      1. W polu Dane wejściowe wybierz wartość "currentSequenceInputDetection" (domyślnie).
      2. W polu Przetwarzanie wstępne wybierz "Kanał 0" (domyślnie) lub żądany kanał, porównując numer w oknie Inspector (Inspektor) w oknie>Sekwencja karta.
      3. W polu Detektor wybierz "Wykryj jasny punkt na ciemnym tle; " użyj opcji "Wymuś użycie falek 2D dla 3D" tylko wtedy, gdy w stosach nie ma wystarczającej liczby warstw Z do przeprowadzenia analizy. Wybierz "Skala(e)" i "Czułość" dla każdej skali (dodaj więcej skal dla większych plam). Skala i czułość (im większa liczba, tym bardziej czułe jest wykrywanie, maksimum 140 jest sugerowane przez Icy) to zmienne metodą prób i błędów, które należy następnie sprawdzić wizualnie i zdecydować
        4. .
      4. W polu Region zainteresowania użyj wartości "ROIfromSequence" (ustawienie domyślne).
      5. W przypadku filtrowania użyj opcji "NoFiltering" (domyślnie) lub wybierz opcję "SizeFiltering", aby zdefiniować "Zakres akceptowanych obiektów (w pikselach)".
      6. Wyjście: wybierz ustawienie wyjściowe XLS lub XML (wybierz format XML w przypadku korzystania z MS Excel 2007 lub wcześniejszego i jest >65 000 miejsc). Jeśli wyniki detektora punktowego są używane do analizy śledzenia, wybierz również "Eksportuj do SwimmingPool".
      7. Powtarzaj wykrywanie plam przy użyciu różnych wartości skali/czułości, aż zostaną wykryte wszystkie lub większość plam. Zapisz wszystkie końcowe parametry.
      8. W celu analizy kolokalizacji powtórz wykrywanie punktowe dla drugiego kanału.
    7. Aby śledzić spoty, wybierz Detection&Tracking>Tracking>Spot Tracking>Uruchom Spot Detector z parametrami z kroku 6.2.6 lub użyj menu rozwijanego "Wybierz wyniki wykrywania tutaj", aby wybrać istniejący zestaw danych (w tym celu pozostaw otwarte okno Spot Detector z kroku 6.2.5). Naciśnij przycisk "Oszacuj parametry" i wybierz żądany ruch docelowy w wyskakującym oknie Estymacja parametrów (np. "jest zarówno dyfuzyjny, jak i skierowany"). Naciśnij przycisk "Uruchom śledzenie".
    8. Powtórz wykrywanie i śledzenie punktów dla innych kanałów podczas śledzenia spotów stosów wielokanałowych, wykonując kroki 6.2.6 i 6.2.7, zaczynając od stosu wygenerowanego od kroku 6.2.7.
    9. Aby zobrazować ścieżki, wybierz Detection&Tracking>Tracking>Track Manager – to okno otwiera się automatycznie po zakończeniu śledzenia. Dla opcji "Color Track Processor" (Procesor ścieżek kolorów) wybierz opcję "Enable" (Włącz) i wybierz żądaną reprezentację kolorów ścieżek. Dostęp do odpowiednich procesorów ścieżek można uzyskać za pomocą menu rozwijanego "dodaj procesor ścieżek..." (np. wybierz "Track Processor Time Clip", włącz okno "Track Clipper" i wybierz żądaną liczbę wykryć, które mają być wyświetlane przed i po bieżącym punkcie czasowym).
    10. Zapisz informacje o ścieżkach jako plik ścieżki XML: Wykrywanie i śledzenie>Śledzenie>Menedżer ścieżek>Plik>Zapisz jako....
    11. Zapisz wyniki, robiąc zrzut ekranu za pomocą ikony "aparatu" z paska menu okna obrazu, "Zrób zrzut ekranu bieżącego widoku". Zrzuty ekranu można robić z wykrytymi miejscami i/lub ścieżkami, po prostu aktywując/dezaktywując odpowiednie ikony oczu znajdujące się w oknie inspektora>zakładka warstwa>Nazwa>Opakowanie nakładki.
    12. Zainstaluj wtyczkę TimeStamp Overlay: Plugins>Setup>Online plugin>TimeStamp Overlay>Install.
    13. Dodaj znacznik czasu: Plugins>TimeStamp Overlay (nowy). Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w wyskakującym okienku (prawy dolny róg ekranu), aby uzyskać wskazówki dotyczące umieszczania i formatowania znacznika czasu. Przedział czasu można dodać/zmienić w oknie Inspektora>zakładka Sekwencja>Właściwości sekwencji>Edycja.
    14. Zapisz wyniki, robiąc kolejny zrzut ekranu. Zapisz obraz w formacie 1) Tiff i 2) w formacie AVI; dla formatu AVI najpierw przekonwertuj na renderowanie RGB (Obraz/Sekwencja>Renderowanie>Obraz RGB).
    15. Obróć obraz do żądanej orientacji: Okno inspektora>zakładka Sekwencja>Płótno>Obrót.
    16. Zapisz obrócony obraz za pomocą opcji "Zrób zrzut ekranu bieżącego widoku". Upewnij się, że ikona "oka" dla paska skali nie jest zaznaczona, ponieważ będzie ona również obracać się wraz z obrazem.
    17. Wybierz i przytnij ROI: wybierz Region zainteresowania > 2D ROI > Wybierz kształt ROI, a następnie utwórz/narysuj ROI na obrazie; Obraz/sekwencja>płaszczyzna (XY)>Szybkie przycinanie.
  3. Analiza kolokalizacji
    1. Przygotowanie protokołu kolokalizacji; kilka przykładów znajduje się na stronie internetowej Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (patrz Materiały Uzupełniające).
    2. Załaduj protokół kolokalizacji: Narzędzia>Skrypty>Protokoły>Załaduj i dostosuj parametry w współpracujących blokach (np. w bloku "Wykrywanie plam falkowych" użyj parametrów określonych w kroku 6.2.6.).
    3. Zmierz rozmiar cząstki w pikselach, określ odległość kolokalizacji i wprowadź ją do bloku "Kolokalizator" jako "Maksymalna odległość"
      nuta: Wielkość cząstki w pikselach zależy od systemu detekcji. Aby zmierzyć rozmiar, powiększ pojedynczą cząstkę i ręcznie policz piksele, które rozciągają się na szerokość sygnału. Uśrednij pomiary z co najmniej trzech cząstek. Maksymalna odległość, jaką należy ustawić dla kolokalizacji, to rozmiar cząstki w pikselach (reprezentuje maksymalną sumę promienia dwóch stykających się cząstek).
    4. W razie potrzeby wybierz jeden lub więcej ROI do analizy kolokalizacji: Region zainteresowania>2D ROI>Wybierz kształt ROI>Narysuj ROI na obrazie.
    5. Zwrot z inwestycji w kadrowanie: Obraz/sekwencja>płaszczyzna (XY)>Szybkie przycinanie.
    6. Wykonaj kolokalizację: Okno edytora protokołów>zakładka Wybrany protokół >Uruchom. Ostatni blok w oknie edytora protokołów będzie zawierał ogólny procent kolokalizacji oparty na wykryciu punktowym, podczas gdy informacje w każdym punkcie czasowym można znaleźć w oknie Inspektora> zakładka Wyjście.
    7. Śledź kolokalizowane i pojedyncze cząstki, wykonując krok 6.2.7 (Śledzenie plam).
    8. Zapisz zgodnie z opisem w kroku 6.2.16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z PinMol, można zaprojektować kilka MB dla jednego celu mRNA (Rysunek 1B-C). Po syntezie i oczyszczeniu wybrane MB są charakteryzowane i porównywane za pomocą analizy in vitro.

figure-results-1
Ryc. 1: Technika i opis tkanek do obrazowania żywych komórek endogennych mRNA. (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja na żywo transportu endogennego mRNA w komorach jajowych Drosophila opiera się na użyciu specyficznych, wydajnych i odpornych na nukleazy MB, które można teraz łatwo zaprojektować za pomocą oprogramowania PinMol . MB to specyficzne sondy przeznaczone do wykrywania unikalnych sekwencji w docelowym mRNA (najlepiej regionów wolnych od struktury drugorzędowej), co umożliwia wykrywanie transkryptu w wysokiej rozdzielczości. Jedynym ograniczeniem przy stosowaniu tej techniki/protokołu dla innych t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Salvatore A.E. Marras (Centrum Instytutu Badań nad Zdrowiem Publicznym, Uniwersytet Rutgers) za syntezę, oznakowanie i oczyszczanie molekularnych latarni morskich, oraz Danielowi St Johnstonowi (The Gurdon Institute, University of Cambridge) za transgeniczne muchy oskar-MS2/MCP-GFP. Prace te były wspierane przez National Science Foundation CAREER Award 1149738 oraz Professional Staff Congress-CUNY Award dla DPB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SpektrofluorometrFluoromax-4 Horiba-Jobin Yvonn/aSpektrofluorometr zliczania fotonów
Kuweta kwarcowaFireflysci (dawniej Precision Cells Inc.)Pęseta 701MFL
Dumont #5Precision Instruments501985Cienkie pęsety są bardzo ważne do oddzielenia poszczególnych komór na jajka
Olej halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898
Szkiełko nakrywkowe nr 1 22 mm x 40 mmVWR48393-048
Mikroskop preparacyjnyLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.nie dotyczy
CO2 podkładka anestezjologiczna dla muszek owocowychGenesee Scienific59-114
Tris-HCL pH 7,5Sigma-Aldrich1185-53-1
Chlorek magnezuSigma-Aldrich7791-18-6
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Mikroskopkonfokalny z wirującym dyskiemMikroskop odwrócony Leica DMI-4000B wyposażony w tarczę obrotową Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD kameraHamamatsun/a
PatchMan NP 2 MicromanipulatorEppendorf Inc.
Mikrowtryskiwacz FemtoJetEppendorf Inc.
Igła do wstrzykiwań: Femtotips IIEppendorf Inc.
Końcówka ładowania: 20 μ L MikroładowarkaEppendorf Inc.
Okulary Micro Cover nr 1 lub 1,5, 22 mm x 40 mmVWR48393-026; 48393-172
Suche drożdżeDowolny sklep spożywczynie dotyczy
Komputer, > 20 GB RAMChociaż przetwarzanie można przeprowadzić na większości komputerów, większe możliwości zwiększą szybkość przetwarzania
World 920000037920010504930000043930001007

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626(2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97(2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241(2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Molekularna sonda beacondetekcja mRNAobrazowanie ywych kom rekkonfokalna mikroskopia z dyskiem obrotowymkomora jajowa Drosophilaledzenie endogennego mRNAanaliza oprogramowaniem Icyledzenie detekcji punkt wtechnika mikroiniekcjimikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły