W pomiarach elektrofizjologicznych obecność potencjału dyfuzyjnego zakłóca precyzyjny pomiar potencjału odwrotnego poprzez zmianę potencjału elektrody. Za pomocą mostka solnego z mikro-agaru wpływ potencjału dyfuzyjnego jest zminimalizowany, co pozwala na bardziej precyzyjny pomiar liczby obrotów substratu odtworzonych rekombinowanych białek błonowych.
Artykuł metodologiczny
Mikroagarowa elektroda mostkowa solna do analizy szybkości wymiany protonów w rekombinowanych białkach błonowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Do tej pory, ponad 50% wszystkich leków farmakologicznych ukierunkowanych jest na kinetykę transportu białek błonowych. Elektrofizjologiczna charakterystyka błonowych białek nośnikowych odtwarzanych w błonach dwuwarstwowych lipidów jest potężną, ale delikatną metodą oceny ich właściwości fizykochemicznych i farmakologicznych. Liczba obrotu substratu jest unikalnym parametrem, który pozwala na porównanie aktywności różnych białek błonowych. W transporcie elektrogenicznym gradient translokowanego substratu tworzy potencjał błonowy, który jest bezpośrednio skorelowany z szybkością wymiany substratu białka. Dzięki zastosowaniu elektrod chlorku srebra indukowany jest potencjał dyfuzyjny, zwany również potencjałem złącza cieczy, który zmienia potencjał elektrody i znacznie zakłóca precyzyjne pomiary potencjału membrany. Potencjał dyfuzyjny można zminimalizować za pomocą mostka solnego, który równoważy potencjał elektrody. W tym artykule zaprojektowano mostek solny z mikroagarem w celu poprawy konfiguracji elektrofizjologicznej, która wykorzystuje mikropipety do tworzenia membrany. Roztwór soli jest wlewany do końcówki pipety mikrokapilarnej, stabilizowanej przez dodanie agarozy i może być łatwo zamontowany na standardowej elektrodzie. Potencjał elektrody z mikrosolą jest bardziej stabilny w porównaniu ze standardową elektrodą. Zastosowanie tego układu stabilizuje potencjał elektrody i pozwala na bardziej precyzyjne pomiary potencjału błonowego generowanego przez gradient pH. Korzystając z tego systemu, tempo wymiany protonów w mitochondrialnych nośnikach UCP1 i UCP3 jest ponownie badane i porównywane z wcześniejszymi pomiarami.
Wprowadzenie
Białka błonowe są celem do 60% wszystkich znanych leków farmaceutycznych1. Pomiary elektrofizjologiczne białek błonowych są potężnym, ale delikatnym narzędziem do analizy transportu elektrogenicznego substratów, w którym pośredniczą błonowe białka nośnikowe. Modulacja prądu transbłonowego poprzez zastosowanie stałych napięć lub ramp napięciowych pozwala na ocenę właściwości farmakologicznych i fizycznych nośników, na przykład aktywacji i hamowania przez substraty lub kinetykę transportu. Szczególnie interesująca jest liczba obrotu substratu, która wyświetla ilość substratu, która jest translokowana przez białko błonowe na jednostkę czasu. Jest to główny parametr przy porównywaniu kinetyki różnych białek błonowych. Ustalenie gradientu stężeń naładowanego substratu w poprzek membrany generuje siłę elektromotoryczną, z której wyprowadza się liczbę obrotów substratu.
Używając elektrody AgCl, obecność buforu wolnego od chlorków tworzy potencjał dyfuzyjny, który zmienia potencjał elektrody i prowadzi do przesunięcia w pomiarach prądu i napięcia2. Chociaż zawsze występuje, jest pomijalny dla standardowych pomiarów przewodności i pojemności, ponieważ parametry te są albo zależne od nachylenia zapisu prądowo-napięciowego (przewodność), albo są różnicą pojedynczego zapisu (pojemności), co znosi potencjał. Jednak zapis potencjału odwrotnego, który powstaje w wyniku transportu substratu, może być znacznie zakłócony przez potencjał dyfuzyjny. W związku z tym, aby uzyskać dokładne pomiary potencjału wstecznego, potencjały elektrod muszą być utrzymywane na stałym poziomie.
Potencjał dyfuzyjny można zminimalizować na dwa sposoby: (i) w obecności dwuwarstwowej membrany, stężenie substratu musi być zwiększone po jednej stronie membrany3,4, lub (ii) most solny równoważy potencjał elektrody5. Pierwsza metoda jest w dużym stopniu zależna od stabilności pomiarów. Membrana musi przetrwać kilka minut, od dodania substratu przez mieszanie, aż substrat zostanie prawie równomiernie rozłożony w roztworze. Jeśli błona pęknie pomiędzy nimi, gradient substratu zostanie zmieniony przez swobodną wymianę naładowanych cząsteczek, a pomiary stają się niedokładne. Ta ostatnia metoda równoważy potencjał dyfuzyjny, ale jest ograniczona wielkością zestawu. Implementacja małego, ale działającego mostka solnego w mikrozakresie do konfiguracji elektrofizjologicznej jest wyzwaniem6. W przypadku tej drugiej metody roztwór soli jest umieszczany w końcówce mikrokapilarnej i stabilizowany przez dodanie agarozy, aby zapobiec dyfuzji roztworu soli do roztworu buforowego.
W tym protokole opisana jest prosta produkcja mostka solnego z mikro-agaru i implementacja do konfiguracji elektrofizjologicznej w oparciu o ustawienie pipety7. Końcówka mikrokapilarna jest dostosowana zarówno tak, aby zawierała 3 M roztwór KCl z 1% mol% (w/v) agarozy, jak i do mostkowania elektrody AgCl i roztworu buforowego. Zaletą mostka mikrosolnego są zapisy czasu przesunięcia potencjału elektrody oraz bardziej precyzyjne pomiary potencjału membranowego przy różnych gradientach pH. W modelowym systemie rekombinowanych białek odtworzonych do liposomów, tempo obrotu mitochondrialnych nośników UCP1 i UCP3 wytwarzanych w podobnych warunkach jest ponownie badane i porównywane z poprzednimi wynikami3,8.
Protokół
1. Produkcja rekombinowanych białek rozprzęgających (UCPs) i tworzenie płaskich błon lipidowych
- Wytworzyć rekombinowane białka UCP1 i UCP3 zgodnie z opisem Rupprecht et al.9 oraz Hilse et al.10
- Utworzyć płaskie błony lipidowe na końcówkach zwykłych jednorazowych plastikowych pipet zgodnie z opisem Beck et al.7
2. Przygotowanie mikro-agarowej elektrody z mostkiem solnym
- Dostosuj długość końcówki pipety mikrokapilarnej (patrz Tabela materiałów).
- Zaznacz na pustej końcówce miejsce, w którym zostanie przymocowana końcówka zawierająca bufor, a następnie za pomocą suwmiarki zmierz długość elektrody z mikroagarowym mostkiem solnym.
UWAGA: Końcówka mikrokapilarna musi być wystarczająco długa, aby zanurzyć się w roztworze buforowym podczas pomiarów. - Odetnij końcówkę mikrokapilarną ostrym nożem lub ostrzem i oczyść przeciętą powierzchnię etanolem i wodą.
- Zaznacz na pustej końcówce miejsce, w którym zostanie przymocowana końcówka zawierająca bufor, a następnie za pomocą suwmiarki zmierz długość elektrody z mikroagarowym mostkiem solnym.
- Przygotuj elektrodę powlekaną AgCl.
- Odetnij drut Ag o długości około 8 cm i oczyść go etanolem i wodą.
- Za pomocą papieru ściernego wygładź powierzchnię o długości 1 cm na końcu drutu, który będzie w kontakcie z roztworem soli.
- Zanurz wygładzony koniec w 3 M roztworze KCl i powlek go elektrochemicznie chlorkiem, używając zasilacza DC przy napięciu 1,5 V przez 10 s.
- Oczyść elektrodę wodą, osusz ją i dostosuj długość elektrody AgCl od strony niepowlekanej tak, aby wniknęła jak najgłębiej do końcówki mikrokapilarnej.
Uwaga: W tym miejscu protokół można przerwać.
- Przygotuj 3 M roztwór soli KCl z 1% (v/v) agaroza.
- Odważ 4,47 g KCl i rozpuść w 20 mL wody, mieszając w kolbie.
- Wyjmij mieszadło, odważ 0,2 g agarozy i dodaj do kolby.
- Podgrzej roztwór do 100 °C, aby roztopić agarozę i zapobiec jej grudkowaniu.
UWAGA: Kolba będzie bardzo gorąca. Nie dotykaj jej gołymi rękami. Do obsługi używaj rękawiczek.
- Wypełnij końcówkę mikrokapilarną agarowym roztworem soli.
UWAGA: Roztwór jest gorący. Chroń dłonie i pracuj ostrożnie, aby uniknąć rozprysków.- Jeśli agaroza zacznie grudkować, podgrzej roztwór soli, aby ponownie całkowicie roztopić agarozę.
- Naciągnij 10 µL agarowego roztworu soli do końcówki mikrokapilarnej. Rób to powoli i ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w końcówce.
- Zdejmij końcówkę z pipety i wsuń elektrodę AgCl od szerszej strony końcówki. Upewnij się, że elektroda penetruje roztwór soli.
- Ostudź elektrodę do temperatury pokojowej i podłącz ją do wzmacniacza.
- Przygotuj bufor do pomiarów.
- Odważ 0,710 g Na2SO4, 0,195 g MES, 0,121 g TRIS i 0,023 g EGTA, następnie dodaj 100 mL wody destylowanej do zlewki i wymieszaj roztwór.
- Sprawdź wartość pH buforu za pomocą elektrody pH i dostosuj pH do wartości 7,32.
- Upewnij się, że elektroda odniesienia i elektroda z agarowym mostkiem solnym są w kontakcie elektrycznym.
- Dodaj 1 mL buforu do plastikowego pojemnika.
- Zanurz elektrodę odniesienia oraz elektrodę z agarowym mostkiem solnym i sprawdź odpowiedź sygnału. Jeśli odpowiedź sygnału jest prawidłowa, przejdź do kroku 2.7.
- Jeśli odpowiedź sygnału jest błędna lub brak jest kontaktu elektrycznego, przeprowadź następujące czynności naprawcze.
- Sprawdź, czy elektroda styka się z roztworem soli, i dociśnij elektrodę do roztworu.
Uwaga: Jeśli roztwór jest już zbyt lepki, usuń mikroagarowy mostek solny i przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną. - Sprawdź, czy w roztworze soli nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli tak, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
- Sprawdź, czy roztwór soli styka się z roztworem buforowym. Jeśli nie, odetnij kolejne 1 mm końcówki rurki.
UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest nadal wystarczająco długa, aby penetrować końcówkę zawierającą bufor. Jeśli nadal brak jest kontaktu, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną. - Jeśli żadna z tych czynności nie pomoże, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
- Sprawdź, czy elektroda styka się z roztworem soli, i dociśnij elektrodę do roztworu.
- Do przechowywania zanurz elektrodę z agarowym mostkiem solnym w 3 M roztworze KCl.
Uwaga: W tym miejscu protokół można zakończyć. W przypadku przerwy na noc przechowuj elektrodę w 3 M roztworze soli KCl w temperaturze 4 °C. - Przygotuj plastikową końcówkę zawierającą bufor.
Uwaga: Jeśli elektroda była przechowywana przez noc, wyjmij ją i pozostaw do ogrzania do temperatury pokojowej przez 30 min.- Weź końcówkę mikrokapilarną i zagnij rurkę pod kątem około 90 stopni, 2 cm od krawędzi wąskiej części, używając drutu grzejnego.
- Używając bardzo ostrego noża lub ostrza, odetnij rurkę około 5 mm od zagięcia.
- Oczyść powierzchnię na końcu etanolem i wodą, a następnie zmierz średnicę otworu końcówki. Na tej podstawie oblicz powierzchnię przekroju.
- Powlek powierzchnię końcówki mieszaniną heksan:heksadekan 85:15 (v:v).
- Naciągnij 3 µL rozpuszczalnika i usuń go z końcówki.
- Odczekaj 1 min, aż cały pozostały w końcówce rozpuszczalnik odparuje.
- Wypełnij końcówkę pomiarową 3 µL buforu i nałóż ją na elektrodę mostka solnego.
UWAGA: Ponownie sprawdź, czy elektroda mostka solnego i elektroda odniesienia są w kontakcie elektrycznym, wykonując krok 2.5.3. - Jeśli brak kontaktu elektrycznego, sprawdź następujące kwestie:
- Sprawdź, czy elektroda mostka solnego styka się z roztworem buforowym. Jeśli nie, zwiększ objętość buforu w końcówce lub przygotuj dłuższą końcówkę mikrokapilarną.
- Jeśli pojawił się pęcherzyk powietrza, zdejmij końcówkę z mikroelektrody mostka solnego, ponownie wypełnij końcówkę buforem i ponownie nałóż ją na elektrodę.
3. Pomiar parametrów elektrycznych błony zrekonstytuowanej z białkiem rekombinowanym
- Przyłożymy trójkątny sygnał napięcia zmiennego o maksymalnym napięciu Umax = 50 mV i ΔTramp = 50 ms, co generuje prostokątną odpowiedź prądu zmiennego. Na podstawie średnich wartości prądów dodatnich i ujemnych (I+ oraz I-) obliczymy pojemność błony zgodnie z następującym wzorem:
- Przyłożymy rampę napięcia w zakresie od -50 mV do +50 mV i zarejestrujemy prąd. Do danych dopasujemy funkcję liniową – jej nachylenie stanowi przewodnictwo – a następnie obliczymy punkt przecięcia dopasowania z osią x.
- Opróżnimy roztwór z plastikowej końcówki i napełnimy nową końcówkę buforem zawierającym zwiększone stężenie substratu.
- Jeśli błona nie utworzy się w ciągu pierwszych 20 - 30 s, opróżnimy objętość i napełnimy ją ponownie. Gwarantuje to, że gradient stężeń w poprzek błony nie ulegnie znaczącej zmianie podczas jej formowania.
- Po utworzeniu błony ponownie wykonamy kroki 3.1 i 3.2, aby zweryfikować prawidłowe sformowanie błony i wyznaczyć punkt przecięcia z osią x.
4. Obliczanie szybkości obrotu substratu
UWAGA: Szczegóły znajdują się w poprzednich pracach3,7.
- Oszacuj ilość białka w błonie na podstawie masy cząsteczkowej lipidów i białek (MLipid i MProtein), pola powierzchni błony oraz jednego oddzielnego ładunku polarnego lipidu (AMembrane i ALipid) oraz stosunku masy białka do lipidów (r).
- Oblicz potencjał Nernsta dla transportowanego substratu. R to stała gazowa, T to temperatura, z to ładunek transportowanego substratu, F to stała Faradaya, a c1 i c2 to stężenia substratu po obu stronach błony.
- Z pomiarów prądowo-napięciowych wyznacz potencjał odwrócenia, obliczając różnicę punktów przecięcia osi x dla dopasowań liniowych w obecności i przy braku gradientu substratu.
- Oblicz udział przewodnictwa substratu, GSubstrate, w całkowitym przewodnictwie błony, Gtotal, poprzez stosunek potencjału odwrócenia do potencjału Nernsta11.
- Oblicz liczbę obrotów substratu ΔNSubstrate na jednostkę czasu ΔT na podstawie przewodnictwa substratu (GSubstrate), przyłożonego napięcia U oraz ładunku substratu z:
- Z zależności liczby transportowanego substratu w jednostce czasu od liczby białek oblicz szybkość obrotu κ.
Wyniki
Aby zweryfikować zminimalizowanie potencjału dyfuzyjnego, zmierzono stabilność pomiarów prądowo-napięciowych nienaruszonej membrany. Na Rysunku 2A przedstawiono reprezentatywne zapisy prądowo-napięciowe w obecności (białe kropki) i braku (czarne kropki) gradientu pH. Zgodnie z równaniem Nernsta, gradient pH indukuje przesunięcie napięcia. Przesunięcie potencjału oblicza się z punktu przecięcia osi x dopasowania liniowego do danych. W celu przetestowania obu elektrod przeanalizowano przesunięcie punktu przecięcia osi x dla standardowej elektrody AgCl (Rysunek 2B; białe kropki) oraz mikro-agarowego mostka solnego (Rysunek 2B; czarne kropki). Rampę napięcia rejestrowano dziesięć razy z rzędu, a średnie przesunięcie na osi x przedstawiono w funkcji czasu. Podczas gdy elektroda z agarowym mostkiem solnym wykazała maksymalne przesunięcie poniżej 5 mV nawet po 300 sekundach pomiaru, elektroda standardowa wykazywała nieprzewidywalne, losowe wahania sięgające 30 mV.
Następnie oba elektrody przetestowano przy różnych gradientach pH (Rysunek 3A). Dla elektrody standardowej wygenerowano gradient pH wynoszący 0,35 oraz 1,0 (białe kropki); dla elektrody z agarowym mostkiem solnym gradienty pH wynosiły 0,35, 0,7 oraz 1,0 (czarne kropki). Przesunięcie potencjału przeanalizowano w trzech niezależnych pomiarach. W przeciwieństwie do gradientu 0,35, w którym zmierzona zmiana różni się tylko nieznacznie, zmiana napięcia ulega istotnej modyfikacji przy gradiencie pH 1,0 w przypadku braku mikro-agarowego mostka solnego. Z dopasowania liniowego danych wynika, że nachylenie funkcji wynosi 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH dla elektrody standardowej oraz 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH dla elektrody z mikro-agarowym mostkiem solnym. Zgodnie z równaniem Nernsta, obliczone przesunięcie potencjału wynosi 60,7 mV/ΔpH przy T = 32 °C.
Wykorzystując mikro-agarowy mostek solny, zmierzono liczbę obrotów protonów, κ, dla mitochondrialnych białek UCP1 i UCP3, a następnie porównano ją z wcześniejszymi pomiarami (Rycina 3B). Podobnie jak w przypadku Ryciny 3A, wygenerowano ΔpH = 1.0 i zmierzono potencjał wsteczny. Ilość białka w błonie oszacowano zgodnie z wzorem podanym w sekcji 4 protokołu, przy stosunku białka do lipidów wynoszącym 4 µg/(mg lipidu), masie cząsteczkowej 33 000 Da dla białka oraz 750 Da dla lipidu, powierzchni błony 3,53 x 10-4 cm2 oraz powierzchni przypadającej na jeden lipid wynoszącej 7,8 x 10-15 cm2. Uzyskane wartości κ wyniosły odpowiednio 5,56 ± 0,38 s-1 dla UCP1 oraz 4,10 ± 0,71 s-1 dla UCP3 (Rycina 3B).
Rysunek 1: Układ elektrofizjologiczny z mikro-agarowym mostkiem solnym. (A) Ten panel przedstawia schemat układu. Końcówka mikrokapilarna zawierająca agarowy roztwór soli (zaznaczona na pomarańczowo) jest umieszczona pomiędzy elektrodą (czarna) a końcówką zawierającą bufor (niebieska). Membrana tworzy się na powierzchni na końcu końcówki z buforem (wskazana strzałką). (B) Ten panel przedstawia zdjęcie układu elektrofizjologicznego z zastosowaniem mikro-agarowego mostka solnego. Strzałki wskazują elektrodę, mikro-agarowy mostek solny, elektrodę odniesienia oraz pojemnik z roztworem buforowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Porównanie mikro-agarowego mostka solnego i standardowej elektrody AgCl. (A) Ten panel przedstawia reprezentatywny pomiar prądu i napięcia w obecności (szare kropki) i w przypadku braku (białe kropki) gradientu pH równego 1. Linie reprezentują dopasowanie liniowe do danych, z którego wyznaczono wartości przewodnictwa oraz punktów przecięcia z osią x. Przesunięcie napięcia oceniono na podstawie różnicy wartości punktów przecięcia obu pomiarów. (B) Ten panel przedstawia w czasie przesunięcie potencjału błonowego od standardowej elektrody AgCl (białe kropki) do elektrody z mikro-agarowym mostkiem solnym (czarne kropki). Wykonano dziesięć następujących po sobie pomiarów prądu i napięcia, a średnie przesunięcie napięcia wywołane potencjałem dyfuzyjnym naniesiono na wykres w funkcji czasu. we wszystkich eksperymentach błona składała się z 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL zrekonstytuowanej z 15 mol% kwasu arachidonowego przy stężeniu 1,5 mg/mL. Bufor zawierał 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS oraz 0,6 mM EGTA przy pH = 7,34 i T = 32 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Liczba obrotów protonów dla UCP1 i UCP3 obliczona z potencjału odwrotnego w obecności gradientu pH. (A) Ten panel przedstawia przesunięcie potencjału błony zawierającej UCP1 dla różnych gradientów pH dla standardowej elektrody AgCl (białe kropki) oraz elektrody z mikro-agarowym mostkiem solnym (czarne kropki). Linie reprezentują dopasowanie liniowe do danych. (B) Ten panel przedstawia liczbę obrotów protonów dla UCP1 (pierwszy zestaw danych) i UCP3 (drugi zestaw danych) obliczoną z stosunku przesunięcia napięcia do potencjału Nernsta zgodnie z wzorami w sekcji 4 protokołu. Pierwszy słupek każdego zestawu reprezentuje liczby obrotów zmierzone przy użyciu mikro-agarowego mostka solnego. Drugi słupek każdego zestawu reprezentuje wcześniejsze pomiary z użyciem standardowej elektrody AgCl. Wartości dla UCP1 i UCP3 zostały zaczerpnięte z Urbankovaet al.3 oraz Macher et al.8. We wszystkich pomiarach błona składała się z 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL zrekonstytuowanych z 15 mol% AA oraz UCP1/UCP3. Stężenie lipidów i białek wynosiło odpowiednio 1,5 mg/mL oraz 4 µg/mg lipidów. Bufor zawierał 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS oraz 0,6 mM EGTA przy pH = 7,34 i T = 32 °C. pH buforu dla pomiarów gradientu zwiększono do 7,66, 8,00 lub 8,33 poprzez dodanie TRIS w pipecie zawierającej roztwór. Wartości stanowią średnią ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Zastosowanie mostka solnego mikro-agarowego z elektrodą minimalizuje jego potencjał dyfuzyjny i pozwala na bardziej precyzyjne pomiary potencjału błonowego generowanego przez gradient pH. W obecności różnych transbłonowych gradientów pH przesunięcie potencjału obu elektrod było dopuszczalne przy ΔpH = 0,35 w porównaniu z teoretyczną wartością potencjału równowagi Nernsta (ΦNernst =23,8 mV dla ΔpH = 0,4). Jednak przy bardziej fizjologicznych gradientach pH, jak na przykład w mitochondriach między matrycą a przestrzenią międzybłonową, standardowa elektroda AgCl nie była w stanie precyzyjnie zmierzyć przesunięcia potencjału przy ΔpH = 1 (ryc. 3A). Elektroda zmostkowana solą mikro-agarową dostarczała wartości, które były znacznie bardziej porównywalne z teorią.
Potencjał dyfuzyjny może również wystąpić na elektrodzie referencyjnej AgCl, jeśli roztwór buforowy zostanie zmieniony podczas doświadczenia. W eksperymentach użyto bezchlorkowego roztworu buforowego, ponieważ zasugerowano, że rozprzęganie białek transportuje jony chlorkowe, a pH dostosowano za pomocą Tris lub MES. Potencjał elektrody, przy braku znacznego stężenia chlorków, zależy przede wszystkim od zanieczyszczeń chlorkowych w roztworze buforowym. Ponieważ jego skład pozostaje niezmieniony podczas eksperymentów, spowoduje to po prostu stały potencjał offsetowy. Jednak do pomiaru bezwzględnej różnicy potencjałów między dwiema elektrodami można również zastosować prosty system mostków agarowych z solą (Ag/AgCl 3 M KCl) dla elektrody referencyjnej.
Mostek solny z mikro-agaru równoważy potencjał dyfuzyjny poprzez zrównoważenie potencjału elektrody. W celu ustabilizowania roztworu soli dodano 1% (w/v) agarozy, aby zapobiec mieszaniu się roztworu soli z roztworem buforowym. Jony soli K+ i Cl- mają podobną ruchliwość w cieczy i równoważą potencjał elektrody. Aby prawidłowo zainstalować mostek solny, roztwór soli agarowej musi być wystarczająco podgrzany, aby wypełnić końcówkę mikrokapilarną bez pęcherzyków powietrza i zakryć elektrodę AgCl. Przed dalszym użyciem należy sprawdzić kontakt elektryczny między elektrodą mostka solnego a elektrodą odniesienia. W zależności od czasu użycia mostka solnego, roztwór soli musi być wystarczająco zżelowany, aby zapobiec mieszaniu się roztworu soli z buforem. Jest to szczególnie ważne, jeśli badane są transportery K+ lub Cl-. Most solny był używany przez bardzo krótki czas, a wylewanie agarozy jest w tym przedziale czasowym znikome. Wyższe stężenie agarozy do 5% lub agaru (3% - 5%) pozwala na stosowanie mostka solnego przez dłuższy okres czasu 6,12.
Metoda ta pozwala na określenie kinetyki transportu transportera błonowego (i) o niskich prędkościach obrotu oraz (ii) białek mitochondrialnych błony wewnętrznej, co trudno jest zbadać w standardowych konfiguracjach patch clamp13. Jego precyzja zależy głównie od pomiaru potencjału odwrotnego, którego dokładność zmniejsza się przy niskiej całkowitej przewodności membrany i małych gradientach stężeń, które indukują potencjał błony poniżej szumu nagrywania.
Korzystając z tej konfiguracji, zmierzono wskaźniki obrotu UCP1 i UCP3 wyprodukowanych w tych samych warunkach. Ze względu na wyższy gradient pH, uzyskane dawki wydają się być bardziej precyzyjne i niezakłócone artefaktami wynikającymi z niewielkiego przesunięcia potencjału elektrody. Może być wykorzystany do dalszej analizy i porównania transporterów błon mitochondrialnych wytwarzanych w podobnych warunkach.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Austriacki Fundusz Badawczy (P31559-B20 do E.E.P.). Autorzy dziękują Sarze Bardakji za doskonałą pomoc techniczną w produkcji i rekonstytucji mysich UCP1 i UCP3 w proteoliposomach.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Końcówki do mikroładowarek | Eppendorf | 5242956.003 | Końcówka do pipet mikrokapilarnych |
| Etanol 99% | AustrAlco Ö sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
| Chlorek Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
| Zasilanie prądem stałym | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
| Standard agarozy | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
| Wzmacniacz z zaciskiem krosowym | Heka | ||
| Probówka | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
| Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
| MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
| TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
| Przewód grzejny | Voltcraft | USPS-2250 |
Bibliografia
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).
- Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).
- Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).
- Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).
- Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).
- Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).
- Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).
- Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).
- Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).
- Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).
Przedruki i uprawnienia
