Mikroagarowa elektroda mostkowa solna do analizy szybkości wymiany protonów w rekombinowanych białkach błonowych

Podsumowanie

W pomiarach elektrofizjologicznych obecność potencjału dyfuzyjnego zakłóca precyzyjny pomiar potencjału odwrotnego poprzez zmianę potencjału elektrody. Za pomocą mostka solnego z mikro-agaru wpływ potencjału dyfuzyjnego jest zminimalizowany, co pozwala na bardziej precyzyjny pomiar liczby obrotów substratu odtworzonych rekombinowanych białek błonowych.

Streszczenie

Do tej pory, ponad 50% wszystkich leków farmakologicznych ukierunkowanych jest na kinetykę transportu białek błonowych. Elektrofizjologiczna charakterystyka błonowych białek nośnikowych odtwarzanych w błonach dwuwarstwowych lipidów jest potężną, ale delikatną metodą oceny ich właściwości fizykochemicznych i farmakologicznych. Liczba obrotu substratu jest unikalnym parametrem, który pozwala na porównanie aktywności różnych białek błonowych. W transporcie elektrogenicznym gradient translokowanego substratu tworzy potencjał błonowy, który jest bezpośrednio skorelowany z szybkością wymiany substratu białka. Dzięki zastosowaniu elektrod chlorku srebra indukowany jest potencjał dyfuzyjny, zwany również potencjałem złącza cieczy, który zmienia potencjał elektrody i znacznie zakłóca precyzyjne pomiary potencjału membrany. Potencjał dyfuzyjny można zminimalizować za pomocą mostka solnego, który równoważy potencjał elektrody. W tym artykule zaprojektowano mostek solny z mikroagarem w celu poprawy konfiguracji elektrofizjologicznej, która wykorzystuje mikropipety do tworzenia membrany. Roztwór soli jest wlewany do końcówki pipety mikrokapilarnej, stabilizowanej przez dodanie agarozy i może być łatwo zamontowany na standardowej elektrodzie. Potencjał elektrody z mikrosolą jest bardziej stabilny w porównaniu ze standardową elektrodą. Zastosowanie tego układu stabilizuje potencjał elektrody i pozwala na bardziej precyzyjne pomiary potencjału błonowego generowanego przez gradient pH. Korzystając z tego systemu, tempo wymiany protonów w mitochondrialnych nośnikach UCP1 i UCP3 jest ponownie badane i porównywane z wcześniejszymi pomiarami.

Wprowadzenie

Białka błonowe są celem do 60% wszystkich znanych leków farmaceutycznych¹. Pomiary elektrofizjologiczne białek błonowych są potężnym, ale delikatnym narzędziem do analizy transportu elektrogenicznego substratów, w którym pośredniczą błonowe białka nośnikowe. Modulacja prądu transbłonowego poprzez zastosowanie stałych napięć lub ramp napięciowych pozwala na ocenę właściwości farmakologicznych i fizycznych nośników, na przykład aktywacji i hamowania przez substraty lub kinetykę transportu. Szczególnie interesująca jest liczba obrotu substratu, która wyświetla ilość substratu, która jest translokowana przez białko błonowe na jednostkę czasu. Jest to główny parametr przy porównywaniu kinetyki różnych białek błonowych. Ustalenie gradientu stężeń naładowanego substratu w poprzek membrany generuje siłę elektromotoryczną, z której wyprowadza się liczbę obrotów substratu.

Używając elektrody AgCl, obecność buforu wolnego od chlorków tworzy potencjał dyfuzyjny, który zmienia potencjał elektrody i prowadzi do przesunięcia w pomiarach prądu i napięcia². Chociaż zawsze występuje, jest pomijalny dla standardowych pomiarów przewodności i pojemności, ponieważ parametry te są albo zależne od nachylenia zapisu prądowo-napięciowego (przewodność), albo są różnicą pojedynczego zapisu (pojemności), co znosi potencjał. Jednak zapis potencjału odwrotnego, który powstaje w wyniku transportu substratu, może być znacznie zakłócony przez potencjał dyfuzyjny. W związku z tym, aby uzyskać dokładne pomiary potencjału wstecznego, potencjały elektrod muszą być utrzymywane na stałym poziomie.

Potencjał dyfuzyjny można zminimalizować na dwa sposoby: (i) w obecności dwuwarstwowej membrany, stężenie substratu musi być zwiększone po jednej stronie membrany^3,4, lub (ii) most solny równoważy potencjał elektrody⁵. Pierwsza metoda jest w dużym stopniu zależna od stabilności pomiarów. Membrana musi przetrwać kilka minut, od dodania substratu przez mieszanie, aż substrat zostanie prawie równomiernie rozłożony w roztworze. Jeśli błona pęknie pomiędzy nimi, gradient substratu zostanie zmieniony przez swobodną wymianę naładowanych cząsteczek, a pomiary stają się niedokładne. Ta ostatnia metoda równoważy potencjał dyfuzyjny, ale jest ograniczona wielkością zestawu. Implementacja małego, ale działającego mostka solnego w mikrozakresie do konfiguracji elektrofizjologicznej jest wyzwaniem⁶. W przypadku tej drugiej metody roztwór soli jest umieszczany w końcówce mikrokapilarnej i stabilizowany przez dodanie agarozy, aby zapobiec dyfuzji roztworu soli do roztworu buforowego.

W tym protokole opisana jest prosta produkcja mostka solnego z mikro-agaru i implementacja do konfiguracji elektrofizjologicznej w oparciu o ustawienie pipety⁷. Końcówka mikrokapilarna jest dostosowana zarówno tak, aby zawierała 3 M roztwór KCl z 1% mol% (w/v) agarozy, jak i do mostkowania elektrody AgCl i roztworu buforowego. Zaletą mostka mikrosolnego są zapisy czasu przesunięcia potencjału elektrody oraz bardziej precyzyjne pomiary potencjału membranowego przy różnych gradientach pH. W modelowym systemie rekombinowanych białek odtworzonych do liposomów, tempo obrotu mitochondrialnych nośników UCP1 i UCP3 wytwarzanych w podobnych warunkach jest ponownie badane i porównywane z poprzednimi wynikami^3,8.

Protokół

1. Produkcja rekombinowanych białek rozprzęgających (UCP) i tworzenie płaskich błon dwuwarstwowych

1. Wytwarzaj rekombinowane UCP1 i UCP3 zgodnie z opisem Rupprechta i wsp.⁹ oraz Hilse et al.¹⁰
2. Uformuj płaskie dwuwarstwowe membrany na końcówkach konwencjonalnych jednorazowych pipet z tworzywa sztucznego, jak opisano przez Becka i wsp.⁷

2. Przygotowanie mikro-agarowej elektrody mostkowej soli

1. Dopasuj końcówkę pipety mikrokapilarnej (patrz Tabela materiałów) do odpowiedniej długości.
   1. Zaznacz pozycję na pustej końcówce, w której zostanie przymocowana końcówka zawierająca bufor i użyj suwmiarki, aby zmierzyć długość elektrody mostkowej z solą mikroagarową.
      UWAGA: Końcówka mikrokapilarna musi być wystarczająco długa, aby wprowadzić się do roztworu buforowego w celu pomiarów.
   2. Przetnij końcówkę mikrokapilary ostrym nożem lub ostrzem i oczyść powierzchnię cięcia etanolem i wodą.
2. Przygotować elektrodę pokrytą AgCl.
   1. Odetnij drut Ag o długości około 8 cm i wyczyść go etanolem i wodą.
   2. Weź kawałek papieru ściernego i wygładź powierzchnię o długości 1 cm na końcu drutu, który powinien stykać się z roztworem soli.
   3. Zanurz wygładzony koniec w roztworze 3 M KCl i pokryj go elektrochemicznie chlorkiem, używając zasilania prądem stałym o napięciu 1,5 V przez 10 s.
   4. Oczyść elektrodę wodą, osusz ją i wyreguluj długość elektrody AgCl od strony niepowlekanej tak, aby wnikała w końcówkę mikrokapilary tak głęboko, jak to możliwe.
      Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. Przygotować 3 M roztwór soli KCl z 1% (v/v) agarozą.
   1. Odważyć 4,47 g KCl i rozpuścić go w 20 ml wody, mieszając w kolbie.
   2. Wyjąć mieszadło, odważyć 0,2 g agarozy i dodać do kolby.
   3. Podgrzej roztwór do 100 °C, aby stopić agarozę i zapobiec jej krzepnięciu.
      UWAGA: Kolba będzie bardzo gorąca. Nie dotykaj go gołymi rękami. Do obsługi używaj rękawic.
4. Napełnij końcówkę mikrokapilarną roztworem soli agarozy.
   UWAGA: Roztwór jest gorący. Chroń ręce i pracuj ostrożnie, aby uniknąć rozprysków.
   1. Jeśli agaroza zacznie krzepnąć, podgrzej roztwór soli, aby ponownie całkowicie stopić agarozę.
   2. Zanurzyć 10 μl roztworu soli agarowej w końcówce mikrokapilarnej. Namocz go powoli i ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w końcówce.
   3. Zdejmij końcówkę z pipety i wciśnij elektrodę AgCl z szerszej strony końcówki. Upewnij się, że elektroda przenika przez roztwór soli.
   4. Schłodzić elektrodę do temperatury pokojowej i podłączyć ją do amplifier.
5. Przygotuj bufor do pomiarów.
   1. Odważyć 0,710 g Na₂SO₄, 0,195 g MES, 0,121 g TRIS i 0,023 g EGTA, a następnie dodać 100 ml wody destylowanej do zlewki i wymieszać roztwór.
   2. Sprawdź wartość pH buforu za pomocą elektrody pH i dostosuj wartość pH do 7,32.
   3. Sprawdź, czy elektroda referencyjna i elektroda mostka solnego agaru są w kontakcie elektrycznym.
      1. Dodaj 1 ml buforu do plastikowego pojemnika.
      2. Zanurz elektrodę odniesienia i elektrodę mostka soli agarowej i sprawdź, czy jest odpowiedź sygnału. Jeśli odpowiedź sygnału jest poprawna, przejdź do kroku 2.7.
6. Jeśli występuje fałszywa odpowiedź sygnału lub w ogóle nie ma kontaktu elektrycznego, wykonaj następujące czynności związane z rozwiązywaniem problemów.
   1. Sprawdź, czy elektroda styka się z roztworem soli i wepchnij elektrodę do roztworu.
      Uwaga: Jeśli roztwór jest już zbyt lepki, usuń mostek solny z mikroagaru i przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
   2. Sprawdź, czy w roztworze soli nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli tak, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
   3. Sprawdź, czy roztwór soli styka się z roztworem buforowym. Jeśli nie, odetnij kolejny 1 mm końcówki rurki.
      UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest nadal wystarczająco długa, aby przebić końcówkę zawierającą bufor. Jeśli nadal nie ma kontaktu, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
   4. Jeśli żaden z tych kroków nie pomoże, przygotuj nową końcówkę mikrokapilarną.
7. Do przechowywania zanurz elektrodę mostka solnego agaru w roztworze 3 M KCl.
   Uwaga: W tym miejscu można zatrzymać protokół. Na przerwę w nocy przechowywać elektrodę w 3 M roztworze soli KCl w temperaturze 4 °C.
8. Przygotuj plastikową końcówkę zawierającą bufor.
   Uwaga: Jeśli elektroda była przechowywana przez noc, wyjmij ją i pozwól jej nagrzać się do temperatury pokojowej przez 30 minut.
   1. Weź końcówkę mikrokapilarną i zegnij rurkę 2 cm od krawędzi wąskiej części, około 90 stopni za pomocą drutu grzejnego.
   2. Użyj bardzo ostrego noża lub ostrza i odetnij rurkę około 5 mm od zagięcia.
   3. Oczyść powierzchnię na końcu etanolem i wodą i zmierz średnicę otworu końcówki. Na tej podstawie oblicz powierzchnię powierzchni.
   4. Pokryj powierzchnię końcówki heksanem:heksadekanem w proporcji 85:15 (v:v).
      1. Odmierzyć pipetą 3 μl rozpuszczalnika i zdjąć go z końcówki.
      2. Odczekaj 1 minutę, aby wszystkie pozostałości rozpuszczalnika w końcówce wyparowały.
   5. Napełnij końcówkę pomiarową buforem o pojemności 3 μl i podłącz ją do elektrody mostka solnego.
      UWAGA: Sprawdź ponownie, czy elektroda mostka solnego i elektroda odniesienia są w kontakcie elektrycznym, wykonując krok 2.5.3.
   6. Jeśli nie ma styku elektrycznego, sprawdź, czy są następujące elementy:
      1. Sprawdź, czy elektroda mostka solnego styka się z roztworem buforowym. Jeśli nie, to albo zwiększ objętość bufora w końcówce, albo przygotuj dłuższą końcówkę mikrokapilarną.
      2. Jeśli jest pęcherzyk powietrza, zdejmij końcówkę z elektrody mostka mikrosolnego, uzupełnij bufor w końcówce i ponownie podłącz go do elektrody.

3. Pomiar parametrów elektrycznych membrany odtworzonej z rekombinowanym białkiem

1. Zastosować trójkątny sygnał napięcia przemiennego o maksymalnym napięciu U_max = 50 mV i_rampie ΔT = 50 ms, który tworzy prostokątną odpowiedź prądu przemiennego. Na podstawie średnich wartości prądów dodatnich i ujemnych (I₊ i I_-) oblicz nośność membrany według następującego wzoru:
   
2. Zastosuj rampę napięcia w zakresie od -50 mV do +50 mV i zapisz prąd. Dopasuj funkcję liniową do danych - nachylenie jest przewodnością - i oblicz punkt przecięcia osi x pasowania.
3. Spuść roztwór do plastikowej końcówki i napełnij nową buforem zawierającym zwiększone stężenie substratu.
   1. Jeśli w ciągu pierwszych 20-30 s nie utworzy się membrana, opróżnij objętość i ponownie ją napełnij. Gwarantuje to, że gradient stężeń w poprzek membrany nie zmienia się znacząco podczas formowania membrany.
   2. Po uformowaniu membrany ponownie wykonaj kroki 3.1 i 3.2, aby sprawdzić, czy membrana jest prawidłowo uformowana i uzyskać punkt przecięcia osi x.

4. Obliczanie wskaźnika rotacji substratu

UWAGA: Zobacz poprzednie prace, aby uzyskać szczegółowe informacje^3,7.

1. Oszacuj ilość białka w błonie na podstawie masy cząsteczkowej lipidów i białek (M_Lipid i_{M Protein}), powierzchni błony i jednej grupy lipidowej (_{A membrana} i_{A Lipid}) oraz stosunku masowego białka do lipidu (r).
   
2. Obliczyć potencjał Nernst dla transportowanego podłoża. R jest stałą gazową, T temperaturą, z ładunkiem transportowanego substratu, F stałą Faradaya, a c₁ i c₂ stężeniami substratu po obu stronach membrany.
   
3. Z zapisów prądowo-napięciowych należy pobrać potencjał odwrotny obliczony na podstawie różnicy punktów przecięcia osi x od pasowań liniowych w obecności i braku gradientu podłoża.
4. Oblicz stosunek przewodności substratu, G_Substrat, do całkowitej przewodności membrany,_{G całkowitej}, przez stosunek potencjału odwrotnego do potencjału Nernsta¹¹.
   
5. Obliczyć liczbę obrotu substratu ΔN_Substrat na jednostkę czasu ΔT na podstawie przewodności podłoża (_{G, substratu}), przyłożonego napięcia U i ładunku podłoża z:
   
6. Na podstawie stosunku transportowanego substratu w czasie do liczby białek obliczyć szybkość obrotu κ,
   

Wyniki

Aby zweryfikować minimalizację potencjału dyfuzyjnego, zmierzono stabilność pomiarów prądu i napięcia nienaruszonej membrany. W Rysunek 2A, zapisy napięcia reprezentatywnego prądu są przedstawione w obecności (białe kropki) i braku (czarne kropki) gradientu pH. Zgodnie z równaniem Nernsta gradient pH indukuje zmianę napięcia. Na podstawie punktu przecięcia osi x dopasowania liniowego do danych obliczane jest przesunięcie potencjału. W celu przetestowania obu elektrod przeanalizowano przesunięcie punktu przecięcia osi x dla standardowej elektrody AgCl (Rysunek 2B; białe kropki) i mostka solnego z mikro-agaru (Rysunek 2B; czarne kropki). Rampa napięcia została zarejestrowana dziesięć razy z rzędu, a średnie przesunięcie w osi x jest przedstawione w funkcji czasu. Podczas gdy elektroda mostkowa z soli agarowej miała maksymalne przesunięcie mniejsze niż 5 mV nawet po 300 sekundach pomiaru, standardowa elektroda zmieniała się do 30 mV w nieprzewidywalnym, losowym zachowaniu.

Następnie, obie elektrody zostały przetestowane w różnych gradientach pH (Rysunek 3A). Dla elektrody standardowej wygenerowano gradient pH 0,35 i 1,0 (białe kropki); dla elektrody mostka solnego agarowego, gradienty pH 0,35, 0,7 i 1,0 (czarne kropki). Przesunięcie potencjału analizowano w trzech niezależnych pomiarach. W przeciwieństwie do gradientu 0,35, w którym zmierzone przesunięcie zmienia się tylko nieznacznie, przesunięcie napięcia zmienia się znacznie przy gradiencie pH 1,0 przy braku mostka solnego mikroagaru. Od dopasowania liniowego do danych, nachylenie funkcji wynosi 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH dla elektrody standardowej i 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH dla elektrody mostkowej z solą mikroagarową. Zgodnie z równaniem Nernsta obliczone przesunięcie potencjału wynosi 60,7 mV/ΔpH przy T = 32 °C.

Korzystając z mostka solnego mikro-agarowego, zmierzono liczbę obrotu protonów, κ, mitochondriów UCP1 i UCP3 i porównano ją z poprzednimi pomiarami (Rysunek 3B). Podobnie jak w przypadku Rysunek 3A, wygenerowano ΔpH = 1,0 i zmierzono potencjał odwrotny. Ilość białka w błonie oszacowano zgodnie ze wzorem podanym w sekcji 4 protokołu, przy stosunku białka do lipidów wynoszącym 4 μg/(mg lipidu), masie cząsteczkowej 33 000 i 750 Da dla białka i lipidu, powierzchni błony 3,53 x ^10-4 cm², i powierzchnia na lipid 7,8 x ^10-15 cm². Uzyskane κwynosiło 5,56 ± 0,38 ^s-1 i 4,10 ± 0,71 ^s-1 odpowiednio dla UCP1 i UCP3 (Rysunek 3B).

Rysunek 1: Konfiguracja elektrofizjologiczna z mostkiem solnym mikro-agarowym. (A) Ten panel pokazuje szkic ustawienia. Końcówka mikrokapilarna zawierająca roztwór soli agarowej (pokazana na pomarańczowo) umieszcza się między elektrodą () a końcówką zawierającą bufor (niebieska). Membrana jest tworzona na powierzchni na końcu końcówki zawierającej bufor (oznaczonej strzałką). (B) Ten panel pokazuje obraz konfiguracji elektrofizjologicznej z zastosowaniem mostka solnego z mikro-agarem. Strzałki wskazują elektrodę, mostek solny z mikroagaru, elektrodę odniesienia i pojemnik z roztworem buforowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Porównanie mostka solnego z mikro-agaru i standardowej elektrody AgCl. (A) Ten panel pokazuje reprezentatywny pomiar prądu i napięcia w obecności (szare kropki) i braku (białe kropki) gradientu pH 1. Linie reprezentują liniowe dopasowanie do danych, na podstawie których uzyskuje się wartości przewodności i przecięcia osi x. Przesunięcie napięcia jest oceniane na podstawie różnicy wartości przecięcia obu zapisów. (B) Ten panel pokazuje przesunięcie potencjału membranowego standardowej elektrody AgCl (białe kropki) do elektrody mostkowej z mikro-agarem solnym (czarne kropki) w czasie. Zarejestrowano dziesięć pomiarów prądu i napięcia z rzędu, a średnie przesunięcie napięcia przez potencjał dyfuzyjny jest wykreślane w czasie. We wszystkich eksperymentach membrana została wykonana z 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL rozpuszczonego w 15% molowym kwasie arachidonowym w stężeniu 1,5 mg/ml. Bufor zawierał 50 mM Na₂SO₄, 10 mM MES, 10 mM TRIS i 0,6 mM EGTA przy pH = 7,34 i T = 32 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Liczba obrotów protonów w UCP1 i UCP3 obliczona na podstawie potencjału odwrotnego w obecności gradientu pH. (A) Ten panel pokazuje przesunięcie potencjału membrany zawierającej UCP1 o różnych gradientach pH standardowej elektrody AgCl (białe kropki) i mikro-agarowej elektrody mostkowej soli (czarne kropki). Linie reprezentują liniowe dopasowanie do danych. (B) Ten panel pokazuje liczbę obrotów protonów UCP1 (pierwszy zestaw danych) i UCP3 (drugi zestaw danych) obliczoną na podstawie stosunku przesunięcia napięcia do potencjału Nernsta zgodnie ze wzorami w sekcji 4 protokołu. Pierwszy słupek każdego zestawu reprezentuje wskaźniki obrotu mierzone za pomocą mostka solnego z mikro-agarem. Drugi słupek każdego zestawu danych reprezentuje poprzednie pomiary przy użyciu standardowej elektrody AgCl. Wartości dla UCP1 i UCP3 zostały zaczerpnięte z Urbankovai wsp.³ oraz Macher et al.⁸. We wszystkich pomiarach membrana została wykonana z 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL rozpuszczonego z 15% mol% AA i UCP1/UCP3. Stężenie lipidów i białka wynosiło odpowiednio 1,5 mg/ml i 4 μg/mg lipidów. Bufor zawierał 50 mM Na₂SO₄, 10 mM MES, 10 mM TRIS i 0,6 mM EGTA przy pH = 7,34 i T = 32 °C. pH buforu do pomiarów gradientowych zwiększono do 7,66, 8,00 lub 8,33 poprzez dodanie TRIS i zmieniono je w pipecie zawierającej roztwór. Wartości te są średnią ± odchyleniem standardowym trzech niezależnych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zastosowanie mostka solnego mikro-agarowego z elektrodą minimalizuje jego potencjał dyfuzyjny i pozwala na bardziej precyzyjne pomiary potencjału błonowego generowanego przez gradient pH. W obecności różnych transbłonowych gradientów pH przesunięcie potencjału obu elektrod było dopuszczalne przy ΔpH = 0,35 w porównaniu z teoretyczną wartością potencjału równowagi Nernsta (Φ_Nernst =23,8 mV dla ΔpH = 0,4). Jednak przy bardziej fizjologicznych gradientach pH, jak na przykład w mitochondriach między matrycą a przestrzenią międzybłonową, standardowa elektroda AgCl nie była w stanie precyzyjnie zmierzyć przesunięcia potencjału przy ΔpH = 1 (ryc. 3A). Elektroda zmostkowana solą mikro-agarową dostarczała wartości, które były znacznie bardziej porównywalne z teorią.

Potencjał dyfuzyjny może również wystąpić na elektrodzie referencyjnej AgCl, jeśli roztwór buforowy zostanie zmieniony podczas doświadczenia. W eksperymentach użyto bezchlorkowego roztworu buforowego, ponieważ zasugerowano, że rozprzęganie białek transportuje jony chlorkowe, a pH dostosowano za pomocą Tris lub MES. Potencjał elektrody, przy braku znacznego stężenia chlorków, zależy przede wszystkim od zanieczyszczeń chlorkowych w roztworze buforowym. Ponieważ jego skład pozostaje niezmieniony podczas eksperymentów, spowoduje to po prostu stały potencjał offsetowy. Jednak do pomiaru bezwzględnej różnicy potencjałów między dwiema elektrodami można również zastosować prosty system mostków agarowych z solą (Ag/AgCl 3 M KCl) dla elektrody referencyjnej.

Mostek solny z mikro-agaru równoważy potencjał dyfuzyjny poprzez zrównoważenie potencjału elektrody. W celu ustabilizowania roztworu soli dodano 1% (w/v) agarozy, aby zapobiec mieszaniu się roztworu soli z roztworem buforowym. Jony soli K⁺ i Cl^- mają podobną ruchliwość w cieczy i równoważą potencjał elektrody. Aby prawidłowo zainstalować mostek solny, roztwór soli agarowej musi być wystarczająco podgrzany, aby wypełnić końcówkę mikrokapilarną bez pęcherzyków powietrza i zakryć elektrodę AgCl. Przed dalszym użyciem należy sprawdzić kontakt elektryczny między elektrodą mostka solnego a elektrodą odniesienia. W zależności od czasu użycia mostka solnego, roztwór soli musi być wystarczająco zżelowany, aby zapobiec mieszaniu się roztworu soli z buforem. Jest to szczególnie ważne, jeśli badane są transportery K⁺ lub Cl^-. Most solny był używany przez bardzo krótki czas, a wylewanie agarozy jest w tym przedziale czasowym znikome. Wyższe stężenie agarozy do 5% lub agaru (3% - 5%) pozwala na stosowanie mostka solnego przez dłuższy okres czasu ^6,12.

Metoda ta pozwala na określenie kinetyki transportu transportera błonowego (i) o niskich prędkościach obrotu oraz (ii) białek mitochondrialnych błony wewnętrznej, co trudno jest zbadać w standardowych konfiguracjach patch clamp¹³. Jego precyzja zależy głównie od pomiaru potencjału odwrotnego, którego dokładność zmniejsza się przy niskiej całkowitej przewodności membrany i małych gradientach stężeń, które indukują potencjał błony poniżej szumu nagrywania.

Korzystając z tej konfiguracji, zmierzono wskaźniki obrotu UCP1 i UCP3 wyprodukowanych w tych samych warunkach. Ze względu na wyższy gradient pH, uzyskane dawki wydają się być bardziej precyzyjne i niezakłócone artefaktami wynikającymi z niewielkiego przesunięcia potencjału elektrody. Może być wykorzystany do dalszej analizy i porównania transporterów błon mitochondrialnych wytwarzanych w podobnych warunkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242956.003	Końcówka do pipet mikrokapilarnych
Etanol 99%	AustrAlco Ö sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H	AAAH-5020-07025-230317
Chlorek Kaliumchlorid	Carl Roth GmbH + Co. Kg	6781.3
Zasilanie prądem stałym	Voltcraft	V10/CPG 1940 -01
Standard agarozy	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3810.2
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Heka
Probówka	Carl Roth GmbH + Co. Kg	5863.1
Na2SO4	Carl Roth GmbH + Co. Kg	8560.3
MES	Carl Roth GmbH + Co. Kg	4256.2
TRIS	Carl Roth GmbH + Co. Kg	AE15.2
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3054.1
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-100ML
Hexadecane	Sigma-Aldrich	296317-100ML
Przewód grzejny	Voltcraft	USPS-2250