Artykuł metodologiczny

In vitro Metoda kontroli stężeń gazów halogenowych w hodowanych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58554

⸱

23 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Perioperative Medicine, CHU Clermont-Ferrand, 2Centre National de la Recherche Scientifique Unité Mixte de Recherche (CNRS UMR) 6293, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U1103, Laboratoire de Génétique, Reproduction et Développement (GReD), Université Clermont Auvergne, 3Department of Pharmacology, CHU Clermont-Ferrand, 4Nurse Anesthetist School, CHU Clermont-Ferrand

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy prosty protokół specjalnie zaprojektowany, aby osiągnąć precyzyjne i kontrolowane stężenia sewofluranu lub izofluranu in vitro, aby poprawić nasze zrozumienie mechanizmów związanych z nabłonkowym uszkodzeniem płuc i przetestować nowe terapie zespołu ostrej niewydolności oddechowej.

Streszczenie

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to zespół rozlanego uszkodzenia pęcherzyków płucnych z upośledzonym usuwaniem płynu pęcherzykowego i ciężkim stanem zapalnym. Stosowanie środków chlorowcowanych, takich jak sewofluran lub izofluran, do sedacji pacjentów na oddziale intensywnej terapii (OIOM) może poprawić wymianę gazową, zmniejszyć obrzęk pęcherzyków płucnych i złagodzić stan zapalny podczas ARDS. Brakuje jednak danych na temat stosowania leków wziewnych w ciągłej sedacji na OIT w leczeniu lub zapobieganiu uszkodzeniom płuc. Aby zbadać wpływ czynników chlorowcopochodnych na komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w warunkach "fizjologicznych", opisujemy prosty system hodowli komórek na granicy faz powietrze-ciecz i wystawiania ich na działanie czynników halogenowych, aby zapewnić precyzyjnie kontrolowane frakcje "powietrza" i "średnie" stężenia dla tych środków. Opracowaliśmy szczelną, hermetyczną komorę, w której płytki z unieśmiertelnionymi komórkami ludzkiego nabłonka pęcherzyków płucnych mogą być wystawione na działanie precyzyjnej, kontrolowanej frakcji sewofluranu lub izofluranu przy użyciu ciągłego przepływu gazu zapewnianego przez obwód maszyny anestezjologicznej. Komórki poddano działaniu 4% sewofluranu i 1% izofluranu przez 24 godziny. Przeprowadzono gazową spektrometrię mas w celu określenia stężenia środków chlorowcopochodnych rozpuszczonych w pożywce. Po pierwszej godzinie stężenia sewofluranu i izofluranu w podłożu wynosiły odpowiednio 251 mg/l i 25 mg/l. Krzywe reprezentujące stężenia zarówno sewofluranu, jak i izofluranu rozpuszczonego w pożywce wykazywały podobne przebiegi w czasie, z plateau osiągniętym po jednej godzinie od ekspozycji.

Ten protokół został specjalnie zaprojektowany, aby osiągnąć precyzyjne i kontrolowane stężenia sewofluranu lub izofluranu in vitro, aby poprawić nasze zrozumienie mechanizmów związanych z nabłonkowym uszkodzeniem płuc podczas ARDS i przetestować nowe terapie dla tego zespołu.

Wprowadzenie

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to kliniczny zespół charakteryzujący się rozlanym uszkodzeniem pęcherzyków płucnych, obrzękiem płuc i hipoksemiczną niewydolnością oddechową. Chociaż ARDS stanowi ponad 10% przyjęć na oddział intensywnej terapii (OIOM) i prawie 25% pacjentów OIOM wymagających wentylacji mechanicznej, nadal jest to niedoceniane wyzwanie dla klinicystów, ze śmiertelnością szpitalną wynoszącą 35-45%1. Pomimo intensywnych badań, do tej pory nie udało się zidentyfikować skutecznej terapii farmakologicznej lub profilaktyki ARDS. Dwie główne cechy przyczyniają się do śmiertelności w ARDS: upośledzony klirens płynu pęcherzykowego (AFC) (tj. zmieniona resorpcja płynu obrzękowego pęcherzyków płucnych z dystalnych przestrzeni powietrznych płuc) i ciężkie zapalenie2. Ponieważ śmiertelność z powodu ARDS pozostaje wysoka, obecne inicjatywy powinny również obejmować profilaktykę pierwotną; Kluczowym wyzwaniem jest jednak zidentyfikowanie pacjentów z grupy ryzyka, u których istnieje prawdopodobieństwo rozwoju ARDS i którzy odnieśliby korzyści, gdyby zapobiegano ARDS.

Lotne halogenkowe środki znieczulające, takie jak sewofluran i izofluran, są powszechnie stosowane do zapewnienia znieczulenia ogólnego na sali operacyjnej. Na całym świecie ponad 230 milionów pacjentów poddawanych poważnym zabiegom chirurgicznym każdego roku wymaga znieczulenia ogólnego i wentylacji mechanicznej3, a pooperacyjne powikłania płucne niekorzystnie wpływają na wyniki kliniczne i wykorzystanie opieki zdrowotnej4. Stosowanie sewofluranu zamiast propofolu wiązało się z poprawą stanu zapalnego płuc u pacjentów poddawanych operacji klatki piersiowej i znacznym zmniejszeniem zdarzeń niepożądanych, takich jak ARDS i pooperacyjne powikłania płucne5. Podobnie, wstępne leczenie izofluranem miało ochronny wpływ na mechanikę układu oddechowego, natlenienie i hemodynamikę w eksperymentalnych modelach zwierzęcych ARDS6,7. Chociaż uzasadnione są dalsze badania dotyczące wpływu środków wziewnych na wyniki w operacjach niekardiochirurgicznych, podobny spadek powikłań płucnych zaobserwowano ostatnio w metaanalizie, wykazując, że wziewne środki znieczulające - w przeciwieństwie do znieczulenia dożylnego - są istotnie związane ze zmniejszeniem śmiertelności w przypadku operacji kardiochirurgicznych8.

Brakuje konkretnych danych prospektywnych na temat stosowania środków lotnych do uspokojenia pacjentów OIT w celu zapobiegania lub leczenia uszkodzenia płuc. Jednak kilka badań potwierdza obecnie skuteczność i bezpieczeństwo wziewnego sewofluranu w sedacji pacjentów OIT, a badania przedkliniczne wykazały, że wziewny sewofluran i izofluran7,9 poprawiają wymianę gazową, zmniejszają obrzęk pęcherzyków płucnych i łagodzą stan zapalny w eksperymentalnych modelach ARDS. Dodatkowo, sewofluran łagodzi uszkodzenia komórek nabłonkowych typu II10, podczas gdy izofluran utrzymuje integralność bariery pęcherzykowo-kapilarnej poprzez modulację białka ścisłego połączenia11. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby zweryfikować, w jakim stopniu eksperymentalne dowody ochrony narządów przed wziewnym sewofluranem i izofluranem mogą zostać przeniesione na ludzi. Pierwsze jednoośrodkowe randomizowane badanie kontrolowane (RCT) z naszej grupy wykazało, że wczesne stosowanie wziewnego sewofluranu u pacjentów z ARDS wiązało się z poprawą natlenienia, obniżeniem poziomu niektórych markerów prozapalnych i zmniejszeniem uszkodzenia nabłonka płuc, co oceniano na podstawie poziomów rozpuszczalnej formy receptora dla zaawansowanych produktów końcowych glikacji (sRAGE) w osoczu i płynie pęcherzykowym12.

Razem wzięte, korzystne efekty sewofluranu i izofluranu na uszkodzenie płuc mogą wskazywać na wiele szlaków biologicznych lub procesów funkcjonalnych, które są zależne od szlaku RAGE, a mianowicie klirens płynu pęcherzykowego (AFC), uszkodzenie nabłonka, translokację czynnika jądrowego (NF)-κB i aktywację makrofagów. Ponadto sewofluran może wpływać na ekspresję samego białka RAGE. Ponieważ poprzednie badania przeprowadzone przez nasz zespół badawczy i inne potwierdzają kluczową rolę RAGE w zapaleniu pęcherzyków płucnych i urazie/naprawie nabłonka płuc podczas ARDS, zaprojektowaliśmy model eksperymentalny, aby zapewnić translacyjne zrozumienie mechanizmów sewofluranu w uszkodzeniu i naprawie płuc13,14,15. Efekty in vitro sewofluranu i izofluranu badano w nowej ludzkiej pierwotnej linii komórkowej nabłonka pęcherzyków płucnych, zaprojektowanej specjalnie do badania bariery powietrzno-krwiennej płuc obwodowych, hAELVi (human Alveolar Epithelial LentiVirus immortalized), z cechami podobnymi do pęcherzyków płucnych typu I, w tym funkcjonalnymi połączeniami ścisłymi16.

Przygotowując projekt naszych badań in vitro (np. hodowle komórek nabłonka pęcherzyków płucnych na granicy powietrze-ciecz z ekspozycją na "wdychany" sewofluran lub izofluran, zrozumieliśmy z wcześniej opublikowanych badań, że frakcje sewofluranu były oceniane tylko w interfejsie "powietrze"17,18,19 przy użyciu standardowych monitorów (podobnych do tych używanych w warunkach klinicznych). Stężenia chlorowców były zwykle wybierane zgodnie z minimalnymi wartościami stężenia pęcherzyków płucnych (MAC) (np. u ludzi, dla sewofluranu, 0,5, 1,1 i 2,2 obj., co stanowi odpowiednio 0,25, 0,5 i 1 MAC; dla izofluranu, 0,6, 0,8 i 1,3 obj%, reprezentującego odpowiednio 0,25, 0,5 i 1 MAC)20. Rzeczywiście, stężenia sewofluranu i izofluranu nigdy nie były badane w samej pożywce hodowlanej, co ogranicza ważność poprzednich modeli/instrumentów eksperymentalnych. Co więcej, w większości eksperymentów używano słoika beztlenowego, który był zamykany po wypłukaniu do środka mieszanki powietrza zawierającej sewofluran. Ponieważ naszym celem było zbadanie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w warunkach "fizjologicznych", uważaliśmy, że taki stan beztlenowy może nie być optymalny i nie byłby kompatybilny z długimi czasami trwania eksperymentów. W związku z tym opracowaliśmy własny system do hodowli komórek na granicy faz powietrze-ciecz i wystawiania ich na działanie czynników chlorowcowanych (sewofluranu i izofluranu) w celu zapewnienia precyzyjnie kontrolowanych frakcji "powietrznych" i "średnich" stężeń dla tych środków. Naszym zdaniem, ten etap eksperymentalny, który do tej pory nie został opisany w literaturze, jest obowiązkowy przed jakimikolwiek dalszymi badaniami in vitro sewofluranu i izofluranu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych (hAELVi)

  1. rozmrażanie
    1. Pobrać pipetę 4 ml gotowego do użycia podłoża do uprawy ludzkiego nabłonka pęcherzyków płucnych (huAEC) w plastikowej tubce o pojemności 15 ml i szybko rozmrozić fiolkę w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C).
    2. Przenieść rozmrożoną zawiesinę komórek do plastikowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki przed odwirowaniem probówki o sile 200 x g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml pożywki hodowlanej. Następnie przenieść komórki do kolby T25.
    4. Hoduj komórki w standardowych warunkach (5% CO2, 95% nawilżone powietrze, 37 °C)
  2. Dzielenie
    1. Sprawdź stan komórek pod mikroskopem. Gdy komórki są w 80-90% zlewane, podziel komórki, wykonując kroki od 1.2.2 do 1.2.10.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną komórek za pomocą sterylnej pipety.
    3. Umyj komórki raz 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco i odessaj DPBS.
    4. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/EDTA (TE) do komórek przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, aż komórki zaczną się odłączać; sprawdzić pod mikroskopem, czy nie doszło do oderwania.
    5. Zawiesić komórki w 2 ml pożywki hodowlanej i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 3 ml pożywki hodowlanej.
    6. Użyj testu wykluczenia niebieskiego barwnika trypanowego, aby określić żywotność komórek. Pobrać 30 μl zawiesiny komórkowej i dodać 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do probówki. Następnie skutecznie wymieszaj roztwór 3-5 razy za pomocą pipety o pojemności 100 μl. Pobrać 10 μl roztworu i umieścić go pod szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru.
    7. Policz zarówno całkowitą liczbę żywotnych komórek, jak i liczbę martwych komórek (niebieskich) w obszarach hemocytometru. Następnie oblicz żywotność komórki [%] za pomocą równania: żywotność komórki = 100 – (100 / całkowita liczba komórek x liczba martwych komórek)
    8. Przenieść podwielokrotność z zawieszonym osadem komórkowym do nowej kolby T25 do hodowli komórkowej lub na płytkę 6-dołkową. Dodać pożywkę hodowlaną do komórek, aby uzyskać łącznie 5 ml pożywki hodowlanej w kolbie T25 lub 1 ml na każdą studzienkę z płytki 6-dołkowej.
    9. Hodować komórki w inkubatorze w standardowych warunkach (5% CO2, 95% nawilżone powietrze, 37 °C)
    10. Gdy komórki są całkowicie zlewające się, są gotowe do eksperymentu.

2. Przygotowanie szczelnej komory

UWAGA: Plan budowy hermetycznej komory jest przedstawiony w Rysunek 1.

  1. Użyj hermetycznego pudełka polipropylenowego o pojemności 6,5 l. Długość, szerokość i wysokość wynoszą odpowiednio 30 x 20 x 15,5 cm. Należy pamiętać, że objętość pudełka jest mniejsza niż objętość teoretyczna ze względu na zaokrąglone rogi.
  2. Wywierć otwór o średnicy 2.5 cm w dolnej części ściany bocznej.
  3. Włóż rurkę falistą z zielonym znakiem, która posłuży jako rura wejściowa mieszanki gazowo-powietrznej i uszczelnij ją silikonem.
  4. Wywierć drugi otwór o średnicy 2.5 cm w górnej części przeciwległej ściany bocznej.
  5. Włóż kolejną rurkę falistą z czerwonym znakiem i połącz ją z filtrem węglowym, który posłuży jako rura wylotowa mieszanki gazowo-powietrznej, i uszczelnij ją krzemem.
  6. Wywierć ciasny otwór o średnicy 4 mm pośrodku średniej ścianki pudełka.
  7. Włóż krótki przewód infuzyjny, który jest połączony na kolektorze z obracającym się męskim zamkiem luer-lock, który zostanie podłączony do analizatora gazów, i uszczelnij go krzemem.
  8. Umieść cyfrowy termometr/higrometr w hermetycznej komorze.

3. Wystawienie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych na działanie czynników halogenowych (sewofluranu i izofluranu)

UWAGA: Schematyczny rysunek urządzenia jest przedstawiony w Rysunek 2.

UWAGA: Chociaż badania na zwierzętach nie wykazały żadnych dowodów na uszkodzenie płodu lub upośledzenie płodności, a bardzo małe badanie przeprowadzone podczas cesarskiego cięcia nie wykazało żadnych niepożądanych skutków dla matki lub płodu, bezpieczeństwo stosowania środków halogenowych (np. sewofluranu lub izofluranu) podczas porodu i porodu nie zostało do tej pory wykazane. Ponadto nie zebrano żadnych kontrolowanych danych dotyczących ciąż u ludzi. Z tego względu należy zdecydowanie odradzać przeprowadzanie eksperymentów z użyciem sewofluranu lub izofluranu w czasie ciąży.

  1. Pracuj pod laboratoryjnym okapem wyciągowym.
  2. Dostosuj obwód urządzenia anestezjologicznego, aby przełączyć przewód gazowy podtlenku azotu na dwutlenek węgla (CO2 ).
  3. Podłącz hermetyczną komorę z oznaczoną na zielono, falistą rurką do niestandardowego obwodu maszyny anestezjologicznej. Włóż podgrzewany nawilżacz (taki jak te używane w wentylatorach OIOM) do rury między urządzeniem znieczulającym a hermetyczną komorą, aby podgrzać mieszaninę przepływu gazów do około 37 °C
  4. Zamontuj szczelną komorę na płycie grzejnej, zapewniając temperaturę płyty grzewczej 37°C.
  5. Umieścić 6-dołkową płytkę zawierającą komórki hAELVI w hermetycznej komorze i uszczelnić pokrywę.
  6. Reguluj natężenie przepływu gazu (tj. mieszaniny powietrza i CO2 ), aby szybko uzyskać warunki standardowe, zdefiniowane jako 5% CO2 i 95% nawilżonego powietrza.
  7. Otwórz parownik środka chlorowcowarowanego i wybierz żądaną wartość procentową (w niniejszym badaniu badane stężenia sewofluranu i izofluranu wynosiły odpowiednio 4% i 1%).
  8. Zanotować skład mieszaniny gazów oraz stężenie sewofluranu lub izofluranu zmierzone przez zewnętrzny analizator gazów i wyświetlane na ekranie.
  9. Po osiągnięciu wartości docelowych należy zmniejszyć natężenie przepływu świeżego gazu do 1 l/min.
  10. Powietrzna komora może być utrzymywana przy takim natężeniu przepływu gazu tak długo, jak jest to konieczne do przeprowadzenia eksperymentu.

4. Pomiar sewofluranu lub izofluranu metodą chromatografii

  1. Przygotowanie próbek
    1. W różnych punktach czasowych należy na krótko otworzyć komorę, aby wyjąć badane próbki (w niniejszym badaniu użyliśmy płytki 6-dołkowej) i zamknąć pokrywę. Pozostałe próbki należy przechowywać w pudełku. Następnie odessać 1 ml pożywki zawartej w każdej próbce za pomocą mikropipety o regulowanej objętości o dużej objętości.
    2. Umieścić pożywkę w 10 ml fiolkach do chromatografii w przestrzeni nad głową, które powinny być hermetycznie przykręcone z teflonową nakrętką. Zamrozić fiolki chromatograficzne w temperaturze -20 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
    3. Przygotować roztwór podstawowy sewofluranu i drugi roztwór podstawowy izofluranu, oba w stężeniu 50 g/l w metanolu. Jednocześnie przygotować roztwór podstawowy chloroformu (wzorzec wewnętrzny, IS) o stężeniu 2 g/l w metanolu. Wszystkie roztwory wzorcowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotować roztwory robocze sewofluranu i izofluranu w stężeniach 50, 500 i 5000 mg/l w wodzie ultraczystej/dimetylosulfoksydydem (50/50; v/v). Do celów standaryzacji wewnętrznej roztwór roboczy utrwala się na 100 mg/l w metanolu.
  2. Analiza próbek komórkowych
    UWAGA: Procedura ekstrakcji opiera się na wcześniej zwalidowanej metodzie chromatografii gazowej i spektrometrii mas firmy Bourdeaux i wsp.1 i używa tych samych parametrów czułości i specyficzności. W protokole tym zastosowano sewofluran i chloroform (IS), a izofluran powiązano z wieloparametryczną metodą analityczną. Krótko mówiąc, do akwizycji spektrometrii mas metoda została opracowana po wstrzyknięciu czystego roztworu. Następnie m/z potwierdzono wzorcami referencyjnymi i danymi literaturowymi. Dla każdego analitu (z wyjątkiem IS) wybrano trzy m/z: jeden m/z do oznaczania ilościowego (najobfitszy i wyższy), dla którego obfitość obliczono przez całkowanie obszaru pod krzywą w celu oceny ilościowej i dwa m/z do potwierdzenia. Używając trzech m/z, anality można było specyficznie zidentyfikować, ponieważ wszystkie m/z miały ten sam czas retencji, a także dlatego, że wszystkie ilości m/z (względne potwierdzenie jonów vs. kwantyfikacja) były takie same w czystym wzorcu i we wszystkich próbkach. Dzięki temu trybowi akwizycji anality mogą być identyfikowane i oznaczane ilościowo z dobrą specyficznością.
    1. Skonstruuj 8-punktowe krzywe kalibracyjne z zakresami stężeń 0,5-400 mg/L i wieloma kontrolami jakości (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 i 400 mg/L).
      UWAGA: Aby zwalidować każdą kalibrację, zastosowano cztery kontrole jakości: dolną granicę oznaczalności (C1 = 0,5 mg/L), dwa poziomy pośrednie (C2 = 20 mg/L i C3 = 75 mg/L) oraz poziom końcowy (C4 przy 400 mg/L; górny poziom oznaczalności). Wszystkie wzorce i kontrole analizowano w hodowanych matrycach komórkowych, aby uniknąć efektu matrycy. Dla każdej krzywej kalibracyjnej analizowano ślepą matrycę w celu sprawdzenia, czy nie ma zakłóceń z hodowanymi wzorcami komórkowymi i wewnętrznymi.
    2. Przygotować roztwór podstawowy sewofluranu i drugi roztwór podstawowy izofluranu, oba w stężeniu 50 g/l w metanolu. Jednocześnie przygotować roztwór podstawowy chloroformu (wzorzec wewnętrzny, IS) o stężeniu 2 g/l w metanolu. Wszystkie roztwory wzorcowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie przygotować roztwory robocze mieszaniny sewofluranu i izofluranu w stężeniach 50, 500 i 5000 mg/l w wodzie ultraczystej / dimetylosulfoksydyku (50/50; v/v). W przypadku IS roztwór roboczy rozcieńcza się w stężeniu 100 mg/l w metanolu.
    3. W przypadku krzywych kalibracyjnych i kontrolnych należy przygotować próbki, wprowadzając 50 μl IS (100 mg/l) do 1 ml matryc próbek komórkowych.
    4. Przygotować roztwory próbek z 200 μl nasyconego roztworu wodnego chlorku sodu w probówce o pojemności 10 ml, hermetycznie przykręconej z teflonową nakrętką.
  3. Chromatografia gazowa i spektrometria mas
    1. Do analiz próbek należy stosować iniekcje przestrzeni nad powierzchnią w chromatografii gazowej w połączeniu z metodą wykrywania masy.
    2. Probówki z przestrzenią nad głową przenosić przez 10 minut w temperaturze 80 °C za pomocą wytrząsarki grzewczej. Następnie pobrać i wstrzyknąć 1,5 ml próbki gazu do chromatografu gazowego. Ustawić parametr wtryskiwacza na 260 °C z podzielonym przepływem na 100 ml/min na 2 minuty na początku przebiegu chromatografii.
    3. Użyj wtryskiwacza dzielonego/bezdzielnego z ciśnieniem zaprogramowanym w trybie nośnika. Najpierw utrzymuj ciśnienie gazu na poziomie 40 kPa przez 0,15 min. Następnie zwiększ ciśnienie programu szybkości do 150 kPa przy 125 kPa/min przed ustawieniem szybkości od 16 kPa/min do ciśnienia 300 kPa na 5 minut.
    4. Równocześnie z wstrzykiwaniem należy rozpocząć od temperatury pieca wynoszącej 60 °C przez 1 minutę i zwiększać aż do osiągnięcia temperatury 140 °C z szybkością 20 °C/min. Następnie ponownie zwiększyć temperaturę, aż do osiągnięcia 250 °C. Łączny czas biegu to 7 min.
    5. Przeprowadzić rozdzielanie chromatograficzne za pomocą kolumny kapilarnej ze stopioną krzemionką (30 m x 1,4 μm, 0,25 mm ID). Przeprowadzić eksperymenty masowe w warunkach monitorowania pojedynczych jonów (SIM) i monitorować kwantyfikację jonów m/z 181 oraz kwalifikacje jonów m/z 151 i 51 jednocześnie w czasie retencji (RT) wynoszącym 2,30 min dla sewofluranu, m/z 149 (oznaczanie ilościowe jonów), m/z 115 i 87 (kwalifikacje jonów) dla izofluranu w RT 2,8 min i m/z 83 (oznaczanie ilościowe jonów) dla chloroformu w RT 3,70 min.
    6. Określić stężenia sewofluranu i izofluranu w hodowli komórkowej na podstawie ich stosunku powierzchni do powierzchni IS, stosując dopasowanie wagowe kwadratowe. Dolna granica oznaczalności (LLOQ) sewofluranu i izofluranu wynosiła 0,5 mg/l, a górna granica oznaczalności (ULOQ) wynosiła 400 mg/l.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stężenia sewofluranu i izofluranu, które rozpuściły się w medium w czasie, przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2.

Przebiegi stężeń sewofluranu i izofluranu w ośrodku były w czasie podobne. Bezpośrednio po ustawieniu wymaganego stężenia środka halogenowanego, stężenia wzrosły w ciągu pierwszej godziny. Następnie osiągnięto plateau, które utrzymywało się do momentu przerwania podawania ś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz protokół opisuje łatwą metodę wystawiania komórek na działanie precyzyjnej frakcji halogenowego środka znieczulającego, takiego jak sewofluran lub izofluran. Co więcej, po raz pierwszy donosimy o rygorystycznej korelacji między frakcją gazową a stężeniem sewofluranu i izofluranu w samej pożywce hodowlanej. Ten fundamentalny krok pozwala nam teraz bezpiecznie korzystać z naszej hermetycznej komory do badania wpływu tych halogenowanych czynników w hodowanej monowarstwie ludzkich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Radzie Regionalnej Owernii ("Programme Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) oraz francuskiej Agence Nationale de la Recherche i Direction Générale de L'Offre de Soins ("Programme de Recherche Translationnelle en Santé" ANR-13-PRTS-0010) za przyznanie dotacji. Fundatorzy nie mieli wpływu na projekt, przeprowadzenie i analizę badania ani na przygotowanie tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SevofluraneBaxterNależy zdecydowanie odradzać przeprowadzanie eksperymentów z użyciem sewofluranu lub izofluranu w czasie ciąży
IsofluraneVirbacWykonywanie eksperymentów z użyciem sewofluranu lub izofluranu w czasie ciąży Należy zdecydowanie odradzać
Ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnychInScreenexINS-CI-1015
huAEC Medium ( gotowy do użycia)InScreenexINS-ME-1013-500ml
Obwód maszyny anestezjologicznejDrägerFabius
Analizator gazówDrageerVamos Plus
Filtr gazów anestezjologicznychSedanaMedicalFlurAbsord
Podgrzewany nawilżaczFisher& PaykelMR850
ChamberCurver00012-416-00
Chromatografia gazowa sprzężona z detekcją masyThermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USAŚlad 1310 z kolumną TSQ 8000evo
Stopiona krzemionka (30 m x 1,4 i #956; m, 0.25 mm ID)Restek, Lisses, FrancjaRxi-624Sil MS

Bibliografia

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10 (8), e0135857(2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

interfejs powietrze cieczekspozycja na sewofluranekspozycja na izofluranspektrometria mas gaz wobw d aparatu do znieczulaniahermetyczna komora z polipropylenukontrola przep ywu gazuplateau st enia

Powiązane artykuły