Artykuł metodologiczny

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

DOI:

10.3791/58564

⸱

17 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Dr. John T. Macdonald Foundation Department of Human Genetics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5John P. Hussman Institute for Human Genomics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 6Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Endocrinology and the Diabetes Research Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 7Vascular Biology Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 8Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja wychwytu cholesterolu LDL poprzez endocytozę za pośrednictwem LDLR jest ważnym obszarem badań w różnych głównych patologiach, w tym zaburzeniach metabolicznych, chorobach sercowo-naczyniowych i chorobach nerek. Obecnie nie ma dostępnej metody oceny wychwytu LDL przy jednoczesnym monitorowaniu stanu zdrowia komórek. W obecnym badaniu przedstawiono protokół wykorzystujący system analizy obrazowania żywych komórek do uzyskiwania seryjnych pomiarów napływu LDL przy jednoczesnym monitorowaniu zdrowia komórek. Ta nowatorska technika jest testowana na trzech ludzkich liniach komórkowych (komórki wątroby, nabłonka kanalików nerkowych i komórek śródbłonka tętnicy wieńcowej) w ciągu czterech godzin. Co więcej, czułość tej techniki została potwierdzona za pomocą dobrze znanych inhibitorów wychwytu LDL, Dynasore i rekombinowanego białka PCSK9, a także promotora wychwytu LDL, symwastatyny. Podsumowując, metoda ta zapewnia średnio- i wysokoprzepustową platformę do jednoczesnego badania przesiewowego aktywności farmakologicznej, a także monitorowania morfologii komórek, a tym samym cytotoksyczności związków regulujących napływ LDL. Analiza może być używana z różnymi systemami obrazowania i oprogramowaniem analitycznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytoza LDL, w której pośredniczy receptor lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR), jest ważnym obszarem badań, ponieważ poziom krążącego cholesterolu LDL jest podstawą chorób sercowo-naczyniowych1, choroby nerek2 jak również różnych chorób zapalnych3 oraz zaburzenia genetyczne z mutacjami w genach transportu cholesterolu4,5,6,7. Badania nad napływem cholesterolu za pośrednictwem LDLR doprowadziły do zidentyfikowania wielu narzędzi badawczych, takich jak inhibitory Dynamin, w tym substancja chemiczna Dynasore8,9,10, a także białka regulujące LDL, takie jak konwertaza proproteinowa Subtilisin/Kexin typ 9 (PCSK9)11,12.

Szlak endocytozy LDL-LDLR zaczyna się od sekwestracji kompleksu LDL-LDLR na powierzchni komórki do dołów pokrytych klatryną13. Pęcherzyki są następnie tworzone przez wgłębienie błony powierzchniowej komórki, internalizując kompleks LDL-LDLR w wakuolach w celu transportu wewnątrz komórki. Gdy utworzony pęcherzyk dojrzewa do wczesnych, a następnie późnych endosomów, pH spada wewnątrz późnego endosomu, powodując dysocjację LDL od jego receptora14. W przeszłości metody kwantyfikacji napływu LDL zależały od znakowanej radioaktywnie inkubacji 125I-LDL z komórkami, a następnie ekstrakcji znakowanego radioaktywnie białka z komórek w celu oceny ilościowej15. Zostało to następnie zastąpione przez użycie znakowanych fluorescencyjnie białek LDL, takich jak DiI-LDL, a następnie barwienie immunologiczne lub ekstrakcję białka do odczytów fluorescencyjnych za pomocą spektrofotometru lub czytnika płytek15,16. Znakowany fluorescencyjnie LDL został również wykorzystany w sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) do analizy internalizacji LDL i wiązania LDL na powierzchni komórki17. Chociaż metody te pozwalają na gromadzenie danych po leczeniu, monitorowanie żywotności komórek podczas leczenia nie jest możliwe.

Kwaśne pH w późnym endosomie pozwala na użycie aktywowanej pH, fluorescencyjnej sondy LDL, takiej jak pHrodo Red LDL, która fluoryzuje po internalizacji18,19. Ta właściwość pozwala na ciągły przebieg w czasie oceny wychwytu LDL w żywych komórkach. Dlatego protokół ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencji pHrodo Red-LDL w analizie żywych komórek w celu seryjnego pomiaru wychwytu LDL przy jednoczesnym monitorowaniu zdrowia komórek. Wyniki wskazują na niezawodność tej nowatorskiej techniki, testowanej w ciągu czterech godzin na trzech różnych liniach komórek ludzkich: komórkach ludzkiego raka wątroby (HepG2), ludzkich komórkach nabłonka nerki (HK2) i ludzkich komórkach śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC). Te linie komórkowe są klinicznie istotne dla klirensu LDL20,21,22,23,24,25,26,27, choroba nerek28,29,30,31, oraz choroba serca32,33, odpowiednio. Oprócz monitorowania napływu LDL, protokół ten obejmuje leczenie dwoma dobrze znanymi inhibitorami wychwytu LDL, hydratem Dynasore i rekombinowanym białkiem PCSK9, a także induktorem statyn ekspresji LDLR i wychwytu LDL, symwastatyną. Dynasore i rekombinowany PCSK9 działają poprzez różne szlaki w celu zmniejszenia wychwytu LDL.

Dynasore jest małocząsteczkowym inhibitorem Dynamins10 i zmniejsza wychwyt LDL poprzez blokowanie zależnej od klatryny endocytozy kompleksu LDL-LDLR10,34. Z drugiej strony rekombinowany PCSK9 jest członkiem rodziny peptydazy S8, która wiąże się z LDLR i hamuje jego recykling na powierzchnię komórki po uwolnieniu LDL z internalizowanego kompleksu poprzez blokowanie wymaganych zmian konformacyjnych35,36. Zmniejszona gęstość LDLR na powierzchni komórki ostatecznie prowadzi do zmniejszonego wychwytu LDL przez komórkę. Statyny, bezpośrednio blokując enzym reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu (HMG-CoA), a tym samym biosyntezę cholesterolu, są również znane z tego, że zwiększają ekspresję LDLR25,38, co prowadzi do zwiększonego wychwytu LDL. Czułość tego protokołu została potwierdzona poprzez wykrycie znacznego zmniejszenia napływu LDL w trzech klinicznie istotnych ludzkich liniach komórkowych, HK2, HepG2 i HCAEC, przez Dynasore i/lub rekombinowany PCSK9 oraz wyraźny wzrost wychwytu LDL w komórkach HepG2 przez Simvastatin w czterogodzinnym kursie z monitorowaniem morfologii/zdrowia komórek. Podsumowując, metoda ta zapewnia platformę o średniej i wysokiej przepustowości do jednoczesnego badania przesiewowego aktywności farmakologicznej i cytotoksyczności związków regulujących wychwyt LDL w żywych komórkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wysiewanie komórek w płytce 24-dołkowej

  1. Odessać pożywkę z komórek, umyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (dPBS) firmy Dubelco i odessać dPBS. W przypadku komórek HepG2 w naczyniu o średnicy 100 mm użyj 1,5 ml 0,25% trypsyny/EDTA, a w przypadku komórek HK2 lub HCAEC użyj 1,5 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA do odłączenia komórek.
  2. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 4 minuty lub do momentu odłączenia komórek. Zneutralizuj trypsynę po 4 minutach inkubacji, dodając 3 ml kompletnej pożywki dla HepG2 i HK2 lub 3 ml roztworu neutralizującego trypsynę, dPBS plus 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), dla komórek HCAEC.
  3. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 250 x g przez 5 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce.
  4. Delikatnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o siatce 40 μm, aby rozbić grudki komórek. Nie myj komórek przez sitko.
  5. Policz komórki i ułóż je w optymalnej gęstości. Na przykład 5 000 komórek na dołek komórek HepG2 lub 10 000 komórek na dołek komórek HK2 lub HCAEC w 24-dołkowej płytce prowadzi do optymalnych wyników.
  6. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić połączenie komórek.
  7. Następnego dnia należy zmienić pożywkę komórkową na pożywkę bazową dla linii komórkowej (bez FBS) plus 5% surowicy z niedoborem białka lipologicznego (LPDS) lub pożywkę o niskiej (2%) pożywki FBS, w zależności od leczenia (patrz 1.7). Następnie kontynuuj inkubację przez 24 godziny, aby zagłodzić komórki. Użyj 500 μl całkowitej pożywki na dołek w 24-dołkowej płytce.
  8. Poddać komórki działaniu na jeden z trzech sposobów: Dodać 10 μg/ml rPCSK9 (lub nośnika) i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, dodać 40 μM hydratu Dynasore (lub nośnika, dimetylosulfotlenku) i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 10 minut, lub dodać 1 μM symwastatyny (lub nośnika, Dimetylosulfotlenek) i umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 12, 18 lub 24 godziny. Używaj mediów z 5% LPDS do zabiegów rPCSK9 lub Dynasore. Używaj pożywek o niskiej (2%) zawartości FBS lub pożywek z 5% leczeniem symwastatyną LPDS.
    UWAGA: Traktowanie komórek pożądanymi związkami można wykonać w momencie zmiany pożywki w celu głodu lipoprotein (krok 1.6) w przypadku eksperymentów długoterminowych lub przed analizą w przypadku eksperymentów krótkoterminowych. Alternatywnie, indywidualne czasy leczenia mogą być wybrane w zależności od rodzaju i celu eksperymentów.
  9. Następnie dodaj 5 μl LDL znakowanego na czerwono pHrodo (1 mg/ml zapasu) do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml. Następnie ostrożnie usuń wszelkie bąbelki z dołków.

2. Analiza komórek na żywo

  1. Natychmiast po dodaniu znakowanego LDL umieścić płytkę w inkubatorze systemu analizy żywych komórek (patrz tabela materiałów) i pozostawić płytkę do wyrównania przez 15 minut w celu zmniejszenia kondensacji na płytce.
  2. W międzyczasie otwórz oprogramowanie i zaplanuj skanowanie, dodając naczynie trzymające płytkę. Obraz 16 obrazów na studzienkę w odstępach 1-godzinnych 10X przez 4 godziny przy użyciu kanału czerwonego i fazowego.
  3. Utwórz mapę tablic do użycia do przetwarzania danych.
    1. Kliknij zakładkę Właściwości. Wybierz Mapę płyt. Wprowadź typ komórki i zabiegi w zakładce Związki.
    2. Kliknij kartę Regiony, wybierz każdy zestaw replik i zapisz jako regiony.

3. Ustawianie parametrów analizy

  1. Po zakończeniu przebiegu eksperymentalnego utwórz zestaw obrazów w oprogramowaniu, aby wytrenować komputer w zakresie ilościowego określania każdego parametru zawartego w zestawie zliczającym.
    1. W oprogramowaniu otwórz widok płyty, a następnie w polu Narzędzia zadania analizy wybierz opcję Utwórz lub Dodaj do kolekcji obrazów.
    2. Wybierz pozycję Nowa kolekcja obrazów, wpisz nazwę kolekcji obrazów, a następnie wybierz kanały czerwony i Faza, zaznaczając pola wyboru obok kanałów.
    3. Wybierz jeszcze 5 obrazów i dodaj je do kolekcji obrazów, dodając je do bieżącej kolekcji obrazów.
  2. Utwórz definicję przetwarzania dla komórek. Tabela 1 zawiera parametry definicji przetwarzania komórek HepG2, HK2 i HCAE dla tego protokołu napływu LDL.
    1. W polu Narzędzia zadania analizy wybierz opcję Nowa definicja przetwarzania. Z menu rozwijanego wybierz kolekcję obrazów o nazwie podaną w kroku 2.1.2. Wprowadź parametry dla typu komórek z tabeli 1.
    2. W polu Podgląd użyj menu rozwijanego, aby wybrać opcję Podgląd wszystkiego.
    3. W polu Maska analizy zaznacz pola Maska konfluencji i Czerwona maska obiektu, aby wyświetlić obszar uwzględniony w analizie na potrzeby definicji przetwarzania. Zobacz Rysunek 1.
    4. Przewiń kolekcję obrazów, aby upewnić się, że komórki i LDL są zawarte w masce. Wybierz Plik i zapisz definicję przetwarzania.
  3. Przeanalizuj zestaw obrazów z przebiegu eksperymentalnego.
    1. Otwórz eksperyment w widoku płyty. W polu Narzędzia zadania analizy wybierz opcję Uruchom nowe zadanie analizy. Wybierz zapisaną definicję przetwarzania.
    2. Nazwij zadanie analizy, wybierz zakres czasu do analizy i wyróżnij studnie eksperymentalne do analizy. Kliknij przycisk Uruchom.

4. Analiza i przetwarzanie danych

  1. Po zakończeniu zadania analizy wyeksportuj dane:
    1. Wybierz zakończoną analizę i naciśnij przycisk Widok. W menu Narzędzia wybierz opcję Eksport metryki/wykresu.
    2. W menu Regiony wybierz opcję Wszystkie dołki, a w menu Grupa, aby uzyskać średnie wartości dla każdego zestawu studni jako grupy, wybierz opcję Repliki, a aby wyeksportować poszczególne wartości dla każdej studni, wybierz opcję Brak.
    3. Z menu metryki Czerwony obiekt wybierz Całkowita intensywność zintegrowanego czerwonego obiektu (RCU x μm2/obraz). Ten parametr wskazuje sumę intensywności sygnału czerwonego (w RCU) pomnożoną przez obszar sygnału czerwonego (w μm2) na wszystkich obrazach w każdym dołku, co odpowiada całkowitemu wychwytowi LDL przez komórki.
    4. Kliknij przycisk Eksport danych. Zaznacz opcję Podziel dane na poszczególne obrazy. Dane są automatycznie kopiowane do schowka i można je wkleić do nowego pliku arkusza kalkulacyjnego.
    5. Z menu metryki Obiekt fazy wybierz konfluencję (procent). Zaznacz opcję Podziel dane na poszczególne obrazy. Kliknij przycisk Eksport danych. Dane są automatycznie kopiowane do schowka i mogą być kopiowane do pliku arkusza kalkulacyjnego zawierającego dane Total Red Object Integrated Intensity (Całkowita intensywność zintegrowanego obiektu czerwonego).
    6. Zastosuj konwersję procentowej konfluencji na powierzchnię całkowitą, korzystając z następującego równania.

      Całkowita powierzchnia fazowa (μm2/obraz) = Zbieg (%) × (Wysokość obrazu (piksele) × Rozdzielczość) × (Szerokość obrazu (piksele) × Rozdzielczość)

      UWAGA:Parametr konfluencji (%) wskazuje procentową zbieżność obszaru fazowego na obraz, który odpowiada obszarowi komórek w każdym dołku. Ta metryka powinna zostać przeliczona na całkowitą powierzchnię fazy dla każdego pojedynczego obrazu po wyeksportowaniu. Specyfikacje obrazu dla kanału fazowego (wysokość, szerokość i rozdzielczość obrazu), które mają być używane z powyższym wzorem dla każdego naczynia doświadczalnego, można znaleźć, odwołując się do Właściwości naczynia w sekcji Kanały obrazu.
    7. Znormalizować całkowitą intensywność całkowania czerwonego obiektu do całkowitej powierzchni fazy, jak obliczono w 4.1.6, używając następującego wzoru dla każdego indywidualnego obrazu, aby wyeliminować zmienność gęstości komórek w studzienkach.
      1. Podziel wartości całkowitej intensywności zintegrowanego czerwonego obiektu (RCU x μm2/obraz) każdego obrazu przez odpowiadającą mu całkowitą powierzchnię fazową (μm2/obraz), aby uzyskać wartości wychwytu LDL (RCU) na obraz.
      2. Następnie uśrednij dane dotyczące absorpcji LDL (RCU) ze wszystkich obrazów każdego dołka, aby uzyskać średni wychwyt LDL w każdym dołku, a następnie uśrednij wartości wychwytu LDL ze wszystkich powtórzonych studzienek, aby uzyskać średnie grupowe. Dane te są ostatecznymi wartościami wychwytu LDL i mogą być wykorzystane do ilustracji i analizy statystycznej przy użyciu wybranego oprogramowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek pozwala na niezawodne monitorowanie zdrowia komórek podczas badań nad napływem cholesterolu w trzech ludzkich liniach komórkowych
Przeprowadziliśmy walidację naszego testu na trzech ludzkich liniach komórkowych, w których regulacja homeostazy cholesterolu odgrywa główną rolę patofizjologiczną, w tym na komórkach ludzkiego raka wątroby (HepG2), ludzkich komórkach nabłonka nerki (HK2) i ludzkich komórkach śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC). Użyliśmy systemu obrazowania żywych komórek do wykonania testu wychwytu LDL w 4-godzinnym cyklu czasowym z pomiarami seryjnymi w odstępach 1-godzinnych. Nasze wyniki wskazują, że wszystkie testowane typy komórek były kompatybilne z tą nową techniką i skutkują krzywymi wskazującymi na ciągły wychwyt LDL przez cały czas trwania badania napływu z 4,33 godziny jako końcowym punktem końcowym (Rysunek 2). Dane dotyczące napływu pokazane w Rysunek 2 uzyskano poprzez normalizację całkowitej fluorescencji LDL znakowanej czerwonym pHrodo (całkowita intensywność zintegrowanego czerwonego obiektu na obraz w RCU x μm2/obraz) do całkowitej powierzchni komórki na każdym obrazie każdej studzienki (obszar obiektu fazowego na obraz w μm2 / obraz) w celu wyeliminowania zmienności gęstości komórek w studzienkach. Ponadto, aby zweryfikować czułość testu napływu LDL w celu badania przesiewowego związków wpływających na wychwyt cholesterolu LDL, użyliśmy dwóch kontroli pozytywnych, o których wiadomo, że hamują napływ LDL, Dynasore i rPCSK9, oraz jednej kontroli pozytywnej, o której wiadomo, że indukuje wychwyt LDL, Simwastatyny. Jak potwierdziły nasze wyniki, po leczeniu Dynasore i rPCSK9, wszystkie trzy testowane ludzkie linie komórkowe (HepG2, HK2 i HCAEC) wykazały znaczne zmniejszenie napływu LDL w ciągu 4 godzin (Figura 2A-C). Na przykład, Rysunek 2A pokazuje, że napływ LDL jest zmniejszony w komórkach HepG2 po leczeniu Dynasore w ciągu czasu, w porównaniu z komórkami leczonymi DMSO; podczas gdy DMSO jako grupa kontrolna nośnika do kontroli Dynasore nie miała znaczącego wpływu na napływ LDL w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Co więcej, nasze odkrycia wykazały wyraźny wzrost wychwytu LDL przez komórki HepG2 po leczeniu symwastatyną (Ryc. 3), co potwierdza czułość tej metody w wykrywaniu znaczących zmian w napływie LDL. Po około 4,5 godzinie, który jest typowym punktem czasowym w badaniach wychwytu LDL, napływ LDL jest znacznie zmniejszony po leczeniu Dynasore lub rPCSK9 i zwiększony przez leczenie symwastatyną (Ryc. 4).

Główną zaletą korzystania z obrazowania żywych komórek do badań absorpcji LDL jest to, że system ten dostarcza w czasie rzeczywistym obrazy komórek w każdym dołku, które mogą być wykorzystane do monitorowania potencjalnej cytotoksyczności badanych związków. Ryciny 5-7 ilustrują reprezentatywne obrazy trzech badanych linii komórkowych w początkowym punkcie czasowym (0,33 h) i końcowym punkcie końcowym (4,33 h) jako wizualne odniesienie dla napływu netto LDL. Obrazy potwierdzają prawidłową morfologię komórek po leczeniu Dynasore lub rPCSK9, wskazując zarówno na skuteczność, jak i bezpieczeństwo tych związków.

Analiza żywych komórek dostarcza wiarygodnych seryjnych pomiarów ilościowych napływu cholesterolu z różnymi zabiegami

Główną zaletą korzystania z tego protokołu z systemem obrazowania żywych komórek jest możliwość zbierania danych przez cały przebieg czasu i porównywania napływu LDL w wielu punktach czasowych, a nie tylko w jednym końcowym punkcie czasowym, jak to zwykle robiono. Korzystając z tego protokołu, jesteśmy w stanie obliczyć procentową redukcję napływu LDL w końcowym punkcie czasowym, a także w odstępach 1 h w całym przebiegu czasu. Tabela 2 podsumowuje zmniejszenie napływu LDL w trzech badanych ludzkich liniach komórkowych po 10-minutowym wstępnym traktowaniu 40 μM Dynasore lub 1-godzinnym wstępnym traktowaniu 10 μg/ml rPCSK9. Po 4,33 h jako końcowym punkcie końcowym badania, leczenie Dynasore w dawce 40 μM znacząco zmniejszyło napływ LDL do komórek HepG2, komórek HK2 i HCAEC odpowiednio o 53%, 68% i 54% (Tabela 2A-C), a leczenie rPCSK9 w stężeniu 10 μg/ml spowodowało zmniejszenie napływu LDL do komórek HK2 o 55% (Tabela 2B). Oprócz ilościowego określenia końcowego punktu czasowego, jak w tradycyjnych testach, jesteśmy w stanie przeprowadzić analizę ilościową w zakresie redukcji napływu LDL w wyniku leczenia w każdym punkcie czasowym eksperymentu. Na przykład Tabela 2B pokazuje, że leczenie rPCSK9 w komórkach HK2 spowodowało zmniejszenie wychwytu LDL o 79% po 1,33 h, 67% po 2,33 h, 59% po 3,33 h w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę analizy ilościowej napływu LDL po leczeniu.

figure-results-1
Rysunek 1: Maska definicji przetwarzania. Reprezentatywne obrazy komórek HK2 przedstawiono po zastosowaniu odpowiedniej definicji przetwarzania (szczegółowo opisanej w tabeli 1). Pokazane sąKomórki HK2 bez maskowania (A), z zastosowaną maską fazową (B), z zastosowaną czerwoną maską obiektu (C) lub z zastosowanymi maskami fazy i czerwonego obiektu (D). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zmniejszenie wychwytu LDL przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w ciągu 4,33 godziny. System analizy żywych komórek służy do pomiaru napływu LDL do komórek ludzkiego raka wątroby (HEPG2) (A), ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HK2) (B) i komórek ludzkiego śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAE) (C). Komórki traktowano preparatem Dynasore (10 minut przed serią) lub rPCSK9 (1 godzinę przed serią) jako kontrole pozytywne. DMSO był używany jako nośnik do leczenia Dynasore. Kontrole pozytywne znacznie zmniejszyły napływ LDL we wszystkich 3 liniach komórkowych. Wartości napływu LDL uzyskano poprzez normalizację całkowitej intensywności całkowania obiektu czerwonego (RCUxμm2/obraz) do całkowitej powierzchni obiektu fazowego (μm2/obraz). Dane są średnie±SEM. N = 6 dołków/grupę. Dane są reprezentatywne dla 2 lub 3 niezależnych eksperymentów. p < 0,0001 vs puste, a ####p < 0,0001 vs DMSO, przy użyciu dwukierunkowej ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Wzrost wychwytu LDL przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w ciągu 4,33 godziny. System analizy żywych komórek służy do pomiaru napływu LDL do komórek ludzkiego raka wątroby (HEPG2). Wychwyt LDL jest znacznie zwiększony po leczeniu symwastatyną przez 12 godzin (A), 18 godzin (B) lub 24 godziny (C) przy użyciu pożywek zawierających 2% FBS. Pomiar czasu 24 h wykonano również z mediami zawierającymi 5% LPDS (bez FBS). DMSO zastosowano jako kontrolę negatywną. Wartości napływu LDL uzyskano poprzez normalizację całkowitej intensywności całkowania obiektu czerwonego (RCU x μm2 / obraz) do całkowitej powierzchni obiektu fazowego (μm2 / obraz). Dane są średnie±SEM. N = 6 dołków/grupę. Dane są reprezentatywne dla jednego niezależnego eksperymentu. p < 0,0001 w porównaniu z DMSO, przy użyciu testu t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Znaczne zmniejszenie napływu LDL przez czynniki obniżające wychwyt LDL w czasie 4,3 godziny. Napływ LDL jest znacznie zmniejszony w ludzkich komórkach raka wątroby (HepG2) (A), ludzkich komórkach nabłonka kanalików nerkowych (HK2) (B) i ludzkich komórkach śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAE) (C) po leczeniu inhibitorami wychwytu LDL Dynasore przez 10 minut lub rPCSK9 przez 1 godzinę. Napływ LDL jest znacznie zwiększony przez symwastatynę w komórkach HepG2 po 12, 18 lub 24 godzinach leczenia (D). Dane są średnie±SEM. N = 6 dołków/grupę. Dane są reprezentatywne dla 2 lub 3 niezależnych eksperymentów. p < 0,0001 przy użyciu dwukierunkowej usługi ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Zmniejszony napływ LDL do komórek raka wątrobowokomórkowego (HepG2) przez środek obniżający wychwyt LDL, Dynasore. Reprezentatywne obrazy obiektu fazowego i czerwonego obiektu dla komórek HepG2 są przedstawione po 0,33 godziny (lewe panele), a punkt końcowy 4,33 godziny (prawe panele) pokazują zdrowy stan komórek. 40 μM Dynasore, o którym wiadomo, że zmniejsza wychwyt cholesterolu LDL, zastosowano jako kontrolę pozytywną (C). Zdjęcia zostały wykonane w 10-krotnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Zmniejszony napływ LDL do ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HK2) przez leki obniżające wychwyt LDL, Dynasore i rPCSK9. Reprezentatywne obrazy obiektu fazowego i czerwonego obiektu dla komórek HK2 przedstawione w 0,33 godziny (lewe panele) i 4,33 godziny punktu końcowego (prawe panele) pokazują zdrowy stan komórek. Jako kontrolę pozytywną zastosowano 40 μM Dynasore (C) lub 10 μg/ml rPCSK9 (D), o którym wiadomo, że zmniejsza wychwyt cholesterolu LDL. Zdjęcia są wykonywane w 10-krotnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Zmniejszony napływ LDL do ludzkich komórek śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC) przez środek obniżający wychwyt LDL, Dynasore. Reprezentatywne obrazy obiektu fazowego i czerwonego obiektu dla HCAEC przedstawione w 0,33 godziny (lewe panele) i 4,33 godziny punktu końcowego (prawe panele) pokazują zdrowy stan komórek. 40 μM Dynasore, o którym wiadomo, że zmniejsza wychwyt cholesterolu LDL, zastosowano jako kontrolę pozytywną (C). Zdjęcia zostały wykonane w 10-krotnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. Dane są średnie±SEM. N = 6 dołków/grupę. Dane są reprezentatywne dla 2 lub 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Tabela 1: Parametry definicji przetwarzania. Parametry te są specyficzne dla systemu analizy używanego w tym protokole. Parametry powinny być skonfigurowane tak, aby analizowały czerwony obszar w kanale czerwonym i obszar komórki w kanale fazowym. Przedstawiono ustawienia parametrów dla linii komórkowych HepG2, HK2, HCAE.

figure-results-9
Tabela 2: Procentowa zmiana napływu LDL w komórkach HepG2, HK2 i HCAE traktowanych Dynasore, rPCSK9 lub Simvastatin po 4,3 godzinie. (A) komórki HepG2, (B) komórki HK2, (C) komórki HCAE i (D) komórki HepG2.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole demonstrujemy wykorzystanie obrazowania żywych komórek jako nowej i skuteczniejszej metody pomiaru wychwytu LDL w czasie rzeczywistym w różnych ludzkich liniach komórkowych. Ludzkie komórki raka wątroby (HepG2) są powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych pod kątem terapii obniżających poziom cholesterolu 21,22,23,24,25,26,39,40. Dlatego wybraliśmy ten typ komórek do testowania możliwości systemu obrazowania żywych komórek do badań napływu LDL. Nasze wyniki wskazują, że komórki HepG2 są kompatybilne z tą nową techniką i powodują krzywą podobną do esicy, wskazującą na ciągły wychwyt LDL przez czas trwania testu napływowego do 4,33 godziny jako ostateczny punkt końcowy (Figura 2A i Figura 3).

Homeostaza cholesterolu odgrywa ważną rolę w patofizjologii różnych nefropatii. Rzeczywiście, nagromadzenie cholesterolu w tkance nerkowej jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do zwłóknienia nerek prowadzącego do przewlekłej choroby nerek i jest główną patologią w różnych nefropatiach 28,29,30,31. W związku z tym zbadaliśmy naszą metodę na ludzkich komórkach nabłonka nerek (HK2) jako popularnej i niezawodnej linii komórkowej wykorzystywanej w dziedzinie nefrologii. Nasze dane potwierdziły również wykonalność systemu obrazowania żywych komórek do pomiaru napływu LDL do komórek HK2. Jak pokazano na rycinie 2B, komórki HK2 pobierały cholesterol LDL liniowo przez cały czas trwania badania napływu (4 godziny).

Ze względu na znaczenie metabolizmu cholesterolu w rozwoju i progresji miażdżycy32,33,41, głównej przyczyny chorób sercowo-naczyniowych, która z kolei jest zabójcą numer jeden na świecie42, naszym celem było zwalidowanie naszej metody w typie komórek istotnym dla miażdżycy. Użyliśmy ludzkich komórek śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC), ponieważ są to jedne z pierwszych typów komórek, które są narażone na znieważenie cholesterolu w świetle tętnicy wieńcowej pacjenta z miażdżycą. Nasze dane pokazane na rysunku 2C wskazują, że ta metoda napływu LDL działa również skutecznie w przypadku HCAEC. Wynikowy wykres to krzywa podobna do sigmoidalnej, podobna do krzywej komórek HepG2.

Aby przetestować trafność i czułość tego ulepszonego testu napływu LDL do badań przesiewowych związków wpływających na wychwyt cholesterolu LDL, użyliśmy trzech kontroli, środków obniżających wychwyt LDL Dynasore i rPCSK9 oraz aktywatora napływu LDL Simvastatin. W tym przypadku potraktowaliśmy wyżej wymienione linie komórkowe (HepG2, HK2 i HCAEC) zoptymalizowanymi stężeniami Dynasore lub rPCSK9 przed testem napływowym. Nasze wyniki wykazały, że wszystkie trzy badane linie komórkowe zareagowały na leczenie znacznym zmniejszeniem napływu LDL w ciągu 4 godzin (ryc. 2). Na przykład, po 4,33 h jako końcowym punkcie czasowym, leczenie Dynasore w dawce 40 μM znacznie zmniejszyło napływ LDL do komórek HepG2, komórek HK2 i HCAEC odpowiednio o 53%, 68% i 54% (p<0,0001; Rysunek 2A-C i tabela 2A-C). Ponadto rPCSK9 w stężeniu 10 μg/ml spowodował wyraźne zmniejszenie o 55% napływu LDL do komórek HK2 (p<0,0001; Rysunek 2B i Tabela 2B). Co więcej, nasze odkrycia wykazały, że traktowanie komórek HepG2 symwastatyną spowodowało wyraźny wzrost wychwytu LDL (Figura 3), co potwierdza czułość tej metody w wykrywaniu znaczących zmian w napływie LDL. Badania leczenia rPCSK9 w komórkach HepG2 i HCAEC nie są uwzględnione w tym protokole, ponieważ rPCSK9 jest stosowany jako dodatkowe leczenie kontrolne z dobrze udokumentowanymi wynikami, ale jest kosztowny do kupienia w małych ilościach. Dlatego rPCSK9 został użyty tylko do walidacji tego protokołu w komórkach HK2.

Analiza obrazowania żywych komórek, wraz z funkcjonalnym i terminowym pomiarem napływu LDL, pozwoliła na ciągłe monitorowanie stanu zdrowia i morfologii komórek. Ta zaleta może skutecznie wykrywać potencjalną cytotoksyczność zastosowanych związków, dzięki czemu metoda ta jest idealną techniką do jednoczesnego monitorowania aktywności farmakologicznej i cytotoksyczności. Ryciny 5-7 ilustrują reprezentatywne obrazy trzech badanych linii komórkowych w końcowym punkcie końcowym (4,33 h) jako wizualne odniesienie dla wpływu leczenia na napływ netto LDL, a także pokazują zdrową morfologię komórek po testowanych zabiegach. Zalecamy oględziny wszystkich obrazów z każdej studzienki, aby upewnić się, że komórki są zdrowe i morfologiczne na czas trwania badania. Na przykład, w danych, które nie zostały pokazane, gdy zbadano obrazy komórek HepG2 traktowanych 80 μM Dynasore, zaobserwowaliśmy oznaki oderwania komórek, ponieważ krawędzie komórek wydawały się unosić z płytki, co sugeruje oderwanie komórek przy wyższych stężeniach Dynasore. Ponadto wysokie stężenia symwastatyny (3-10 μM) prowadziły również do zmiany morfologii wskazującej na indukowaną apoptozę, jak zgłaszano w przypadku wysokich dawek statyn45. Protokół ten wykorzystano do przeprowadzenia miareczkowania leczenia Dynasore przy 20-80 μM i symwastatynie w stężeniu 0,5-10 μM, po czym obrazy komórek wykorzystano do analizy zdrowia komórek i określenia potencjalnej ctotoksyczności leczenia w różnych stężeniach. Wyniki sugerują zastosowanie 40 μM dla Dyansore i 1 μM dla symwastatyny jako optymalnych stężeń.

Na koniec sugerujemy przeprowadzenie badania miareczkowania gęstości komórek, jeśli inna linia komórkowa ma być testowana tą metodą w celu określenia optymalnej liczby komórek na studzienkę w celu uzyskania spójnych wyników. Nasze badanie optymalizacji gęstości komórek wykazało, że 10 000 komórek/studzienkę w 24-dołkowej płytce prowadzi do stałych wyników napływu LDL dla komórek HK2 i HCAE. Ważne jest, aby pamiętać, że w przypadku tego testu napływu LDL przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek pożądana jest monowarstwa niezlewających się komórek równomiernie rozmieszczonych na studzienkach, ponieważ skupiska komórek mogą powodować błędy w końcowych znormalizowanych wartościach napływu LDL. Powodem tego jest to, że do normalizacji danych napływu obszar obiektu fazowego jest używany jako miara gęstości komórek i na ten parametr może mieć negatywny wpływ, gdy tworzą się grudki komórek. Zaobserwowaliśmy, że komórki HepG2 mają tendencję do tworzenia grudek, gdy są wysiewane w gęstości większej niż 5,000 komórek / studnię, powodując niespójne wyniki napływu; dlatego użyliśmy 5,000 komórek na studzienkę w 24-dołkowej płytce jako optymalnej gęstości dla komórek HepG2.

Reasumując, nasza metoda zapewnia średnio- i wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych aktywności farmakologicznej i cytotoksyczności związków regulujących jednoczesny napływ LDL. Metodę tę można łatwo dostosować do stosowania z innymi ligandami znakowanymi fluorescencyjnie, które wchodzą do kompartmentu lizosomalnego w celu oceny wychwytu ligandów w czasie rzeczywistym. Chociaż protokół ten oferuje specyfikacje dla systemu obrazowania i analizy na żywo InCucyte, protokół można dostosować do alternatywnych systemów obrazowania, takich jak Cellomics.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez następujące granty dla LAS: National Institute of Health (R56HL132209 i 1R01HL140468) oraz Miami Heart Research Institute. KY jest laureatem stypendium przeddoktoranckiego American Heart Association (18PRE33960070). Komórki HepG2 zostały udostępnione dzięki uprzejmości dr Emmanuela Thomasa, University of Miami-Miller School of Medicine46,47,48.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pHrodo Red-LDLThermoFisher ScientificL34356
Komórki HepG2E. Thomas Lab, U. MiamiHB-8065
MEMSigmaM0325
Pirogronian soduSigmaP5280
L-glutamina 200 mM roztwórSigmaG7513
FBSAtlas BiologicalsFP-0500-A
Komórki HK2ATCCCRL-2190
Keratynocyty Zestaw mediów SFMGibco17005-042
Pierwotne komórki śródbłonka tętnicy wieńcowejATCCPCS-100-020
Pożywka z komórek naczyniowychATCCPCS-100-030
Zestaw do wzrostu komórek śródbłonka-VEGFATCCPCS-100-041
Ludzka lipoproteina Niedobór surowicyMilliporeLP4
PBSSigmaD8537
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Trypsin-EDTA (0,05%)Gemini Bio-Products400-150
Roztwór neutralizujący trypsynęATCCPCS-999-004
Płytka 24-dołkowaFalcon353226
40 μ Siatkowy sitko do komórek MVWR10199-654
Probówki stożkowe 15 mlVWR89039-666
Probówki stożkowe 50 mlVWR89039-658
Barwienie błękitem trypanowym (0,4%)Life TechnologiesT10282
Szkiełka zliczająceBio-Rad145-0011
Incucyte ZoomObrazowanie SartoriusZoomi platforma analityczna
Dynasore HydrateSigmaD7693
PCSK9 Rekombinowane białkoCayman Chemicals20631

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  2. Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G. Lipids and renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), Suppl 2 145-147 (2006).
  3. Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104(2015).
  4. Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
  5. Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
  6. Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
  7. Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
  8. Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042(2011).
  9. Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
  10. Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
  11. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
  12. Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
  13. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  14. Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431(2009).
  15. Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
  16. Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
  17. Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
  18. Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
  19. Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
  20. Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
  21. Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
  22. Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
  23. Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
  24. McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
  25. Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
  26. Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
  27. Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
  28. Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
  29. Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
  30. Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
  31. Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57(2018).
  32. Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
  33. Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
  34. Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M. Dynasore-not just a dynamin inhibitor. Cell Communication and Signaling. 13 (1), 24(2015).
  35. Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
  36. Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154(2003).
  37. Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425(1990).
  38. Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
  39. Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
  40. Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
  41. Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
  42. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  43. Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
  44. Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
  45. Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
  46. Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
  47. Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362(2016).
  48. Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Endocytoza zale na od LDLRkwantyfikacja nap ywu LDLinhibicja dynasorembia ko PCSK9stymulacja symwastatynkom rki HepG2kom rki HK2

Powiązane artykuły