Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

38.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58565

⸱

15 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, 2No.2 Middle School of Shijiazhuang, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 4Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Streszczenie

Dokanałowe (IT) wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wzbudziło znaczne zainteresowanie terapią genową OUN ze względu na jej bezpieczeństwo, nieinwazyjność i doskonałą skuteczność transdukcji w OUN. Poprzednie badania wykazały terapeutyczną moc terapii genowej dostarczanej przez AAV w zaburzeniach neurodegeneracyjnych przez administrację IT. Odnotowano jednak wysokie wskaźniki nieprzewidywalnych awarii spowodowanych ograniczeniami technicznymi administracji IT u małych zwierząt. W tym przypadku ustaliliśmy system punktacji, aby wskazać stopień powodzenia nakłucia lędźwiowego u małych zwierząt poprzez dodanie 1% chlorowodorku lidokainy do roztworu do wstrzykiwań. Dalej pokazujemy, że zakres przejściowego osłabienia po wstrzyknięciu może przewidywać skuteczność transdukcji AAV. W związku z tym ta metoda iniekcji IT może być wykorzystana do optymalizacji badań terapeutycznych w mysich modelach chorób OUN, które dotykają szerokie obszary OUN.

Wprowadzenie

AAV może pośredniczyć w długotrwałej i powszechnej ekspresji genów w transdukcji OUN z niewielkimi skutkami ubocznymi, i dlatego stał się jednym z najbardziej obiecujących narzędzi terapii genowej w leczeniu chorób OUN, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), choroby Huntingtona (HD), choroby Alzheimera (AD), lizosomalnych chorób spichrzeniowych (LSD), choroby Gauchera (GD) i ceroidowej lipofuscynozy neuronalnej (NCL)1. Obecnie wyizolowano ponad 100 serotypów AAV od ludzi i zwierząt. Spośród nich co najmniej 12 zostało wykorzystanych w badaniach przedklinicznych i klinicznych, w tym najczęściej stosowane wektory genów, takie jak AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 i rAAVrh.101,2,3,4,5,6.

Różne choroby OUN wymagają różnych strategii dostarczania AAV ze względu na różne dotknięte regiony OUN i typy komórek. Regiony OUN i typy komórek, które może transdukować AAV, różnią się w zależności od serotypu, a także metody dostarczania. Na przykład wykazano, że rAAVrh10 transdukuje głównie astrocyty, gdy jest dostarczany przez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie dożylne (IV), podczas gdy transdukuje zarówno neurony, jak i glej, gdy jest dostarczany przez wstrzyknięcie dooponowe4,7. Dodatkowo wstrzyknięcie miąższu powodowało miejscową transdukcję w okolice miejsca wstrzyknięcia, natomiast wstrzyknięcie do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) poprzez wstrzyknięcie dokomorowe lub dooponowe powodowało rozległą transdukcję OUN8. Badania wykazały również skuteczność terapeutyczną terapii genowej dostarczanej przez AAV w chorobach neurodegeneracyjnych przez administrację IT9,10,11. W chorobach, które wpływają na szerokie obszary OUN, takich jak ALS, wykazano, że wstrzyknięcie dooponowe do płynu mózgowo-rdzeniowego obejmuje większość obszarów dotkniętych chorobą mniejszą dawką w porównaniu z metodą dostarczania ogólnoustrojowego4,10. Ostatnie badania wykazały również, że nakłucie lędźwiowe może być stosowane do wstrzykiwania AAV w mysich modelach ALS, co pozwala uniknąć potencjalnych urazów związanych z laminektomią i cewnikowaniem dooponowym4.

Eksperymentalne bezpośrednie nakłucie lędźwiowe zostało po raz pierwszy użyte do dostarczania środków, zwłaszcza znieczulających, do rdzenia kręgowego w celu analgezji i znieczulenia w 1885 roku12,13. W tym raporcie ilustrujemy metodę wstrzykiwania IT nakłucia lędźwiowego u dorosłych myszy za pomocą 1% chlorowodorku lidokainy, miejscowego środka znieczulającego pochodzącego z amidu, w roztworze do wstrzykiwań w celu oceny i monitorowania jakości wstrzyknięcia. Udane wstrzyknięcia charakteryzowały się przejściowym paraliżem wywołanym lidokainą, podczas gdy nieudane wstrzyknięcia nie wykazywały tego zachowania. Sklasyfikowaliśmy poziom przejściowego osłabienia jako jeden z pięciu stopni, które pomagają przewidzieć skuteczność wtrysku. Na koniec pokazujemy, że poziom transdukcji rAAVrh10 można przewidzieć na podstawie stopnia paraliżu. Dlatego ta dokanałowa metoda dostarczania AAV może być wykorzystana do zwiększenia dostarczania genów za pośrednictwem AAV w eksperymentalnej terapii chorób OUN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy FVB/NJ zostały wyhodowane w obiekcie dla zwierząt Key Laboratory of Hebei Neurology. Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Drugiego Szpitala Uniwersytetu Medycznego w Hebei i przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi zarządzania zwierzętami laboratoryjnymi ogłoszonymi przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej.

1. Przygotowanie 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy

  1. Odważyć 2 g chlorowodorku lidokainy. Dodaj 5-6 ml sterylnej wody i delikatnie wymieszaj. Zwiększ objętość do 10 ml sterylną wodą.
  2. 1.2 Przefiltruj roztwór podstawowy przez filtry 0,2 mikrona. Poddzielić roztwór podstawowy, 1 ml na 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i uszczelnić go folią uszczelniającą. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Bezpośrednie dokanałowe podawanie AAV u obudzonych myszy

  1. Przetrzyj obszar roboczy sterylną gazą z 70% etanolem i przygotuj wymagane materiały, jak wspomniano w Tabeli 1.
  2. Przygotować 100 μl kompleksu chlorowodorku lidokainy AAVrh.10/1%, dodając 95 μl roztworu podstawowego rAAVrh10 (5 x10 12 kopii genomu/ml) do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 μl i dodać 5 μl 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Następnie przechowywać roztwór wirusa na lodzie (4 °C).
    UWAGA: Zostanie użyte 8 μL na mouse4.
  3. Przygotowanie strzykawki z roztworem AAV do wstrzykiwań
    1. Zmontować strzykawkę Hamiltona o pojemności 25 μl z igłą 27 G i wyrównać skośną końcówkę igły ze skalą objętościową na strzykawce.
    2. Delikatnie pobrać 8 μl z 4 x10 10 kopiami genomu roztworu wirusa do strzykawki. Upewnij się, że usunąłeś pęcherzyki powietrza.
  4. Przygotowanie mouse
    UWAGA:     W tym badaniu wykorzystano samce lub samice myszy FVB/NJ (w wieku 30–70 dni). W masce operowano iniekcję IT.
    1. Wysterylizuj obszar roboczy w okapie z 70% etanolem. Połóż obudzoną mysz (samiec lub samicę, 30–70 dni, waga 13–20 g) na łóżku w pozycji leżącej w kapturze. Przykryj górną część ciała sterylną gazą, aby uspokoić mysz i uniknąć ugryzienia.
    2. Przymocuj zwierzę, chwytając odpowiednio i mocno za obręcz miednicy kciukiem po jednej stronie i palcem wskazującym/środkowym po drugiej stronie. Utrzymuj napiętą skórę między obustronnymi obręczami miednicznej kciukiem i palcem wskazującym. Przytrzymaj delikatnie górną część ciała zwierzęcia dłonią.
    3. Ogol futro na grzbiecie między obustronnymi obręczami miednicy, a następnie wysterylizuj powierzchnię skóry peelingiem na bazie jodku i 70% etanolem.
  5. Iniekcja dokanałowa12
    1. Wyczuć przestrzeń międzykręgową wzdłuż środkowej linii między obustronnymi obręczami miednicy kciukiem lub palcem wskazującym drugiej ręki i naciśnij wgłębienie paznokciem, aby wskazać przestrzeń międzykręgową L5-L6 (zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia).
    2. Obróć lekko i delikatnie podstawę ogona, aby wskazać linię środkową kręgosłupa. Przed wstrzyknięciem wyregulować skos igły w kierunku głowy zwierzęcia (wspomniano w kroku 2.3.1).
    3. Upewnij się, że zwierzęta są mocno zamocowane i wyrównaj igłę wzdłuż linii środkowej kręgosłupa.
    4. Delikatnie i pionowo (lub lekko przechylić pod kątem 70–80°) w miejscu przecięcia wgłębienia i utrzymać strzykawkę w środkowej płaszczyźnie strzałkowej. Powoli zmniejsz kąt do około 30°, gdy łączy się z kością, a następnie wsuń igłę w przestrzeń międzykręgową.
      nuta: Ewidentny nagły ruch ogonem jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń opony śródoponowej. Gdy igła wejdzie do przestrzeni międzykręgowej, końcówka igły będzie mocno zaciśnięta. Igła 27 G użyta w tym badaniu nadaje się do podawania IT u myszy, ale nie u szczurów.
    5. Wstrzyknąć roztwór wektorowy (wspomniany w kroku 2.2). Uruchomić stoper i wstrzyknąć 8 μl roztworu wektorowego z prędkością 1 μl/4 s. Zachowaj igłę około 1 minutę po zakończeniu porodu. Wyjmij igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć wycieku.
    6. Oceń przejściowe osłabienie kończyn myszy natychmiast po podaniu, aby ocenić jakość iniekcji4.
      nuta: Standard jest następujący4. Ocena 0: brak słabości; Ocena 1: niewielkie osłabienie kończyn tylnych bez nieprawidłowości chodu; Wynik 2: umiarkowane osłabienie kończyn tylnych z wyraźnymi nieprawidłowościami chodu; Wynik 3: całkowity paraliż kończyn tylnych; Wynik 4: całkowity paraliż kończyn tylnych, duszność i umiarkowane osłabienie kończyn przednich; i wynik 5: całkowity paraliż wszystkich czterech kończyn i wyraźna duszność.
    7. Przenieś mysz z powrotem do klatki, aby odzyskać siły po paraliżu.
  6. Sprzątanie
    1. Przepłukać strzykawkę 1 ml jałowej wody. Posortuj materiały laboratoryjne i zbierz wszystkie jednorazowe materiały do sterylizacji w autoklawie. Wyczyść ławkę 70% etanolem.

3. Przygotowanie tkanek do barwienia immunohistochemicznego

  1. Pobieranie tkanek
    1. Znieczulenie myszy po 21 dniach od wstrzyknięcia 3% hydratem chloralu (0,1 ml/10 g) głęboko przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
    2. Perfuzja przezsercowa z 20 ml lodowatego 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) najpierw, następnie 4% lodowaty paraformaldehyd (w 0,01 M PBS) z pompą (10 ml/min przez 1 min, następnie 5 ml/min przez 9 min).
      ostrożność: Paraformaldehyd jest rakotwórczy i toksyczny. Używaj go tylko w dygestoria w rękawiczkach.
  2. Rozwarstwienie rdzenia kręgowego i mózgu
    1. Przymocuj kończyny i głowę każdego zwierzęcia w pozycji leżącej na piankowej pokrywie pudełka za pomocą igieł strzykawkowych, a następnie zdejmij i usuń skórę z głowy do kości krzyżowej nożyczkami.
    2. Przytnij czaszkę między oczami, przeciąć wzdłuż środkowej trasy czaszki i poziomej linii na móżdżku, a następnie otwórz czaszkę z każdej strony.
    3. Podnieś kość potyliczną pęsetą i obustronnie otwórz kanał kręgowy nożyczkami okulistycznymi. Odetnij żebra po obu stronach i ostrożnie usuń górną połowę kręgów.
    4. Podnieś mózg zakrzywioną pęsetą i odetnij nerwy podstawy czaszki, a następnie ostrożnie wypreparuj cały mózg i rdzeń kręgowy. Po utrwaleniu tkanek w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny.
  3. Przygotowanie plastrów tkanek
    1. Krioprotektoratuj mózg oraz rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym i lędźwiowym w 30% roztworze sacharozy przez noc w temperaturze 4 °C. Osadź tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i szybko zamroź ciekłym azotem.
    2. Przeciąć tkankę o ciśnieniu 25 μm za pomocą kriostatu i przechowywać zamrożone skrawki w 0,01 M PBS w temperaturze 4 °C do użycia.

4. Immunohistochemia

  1. Wstępnie potraktować swobodnie pływające sekcje w 1% H2O2 przez 10 minut, a następnie myć w PBS przez 10 minut. Inkubować w roztworze blokującym zawierającym 5% surowicy i 0,3% niejonowego detergentu w PBS przez 1 godzinę.
  2. Inkubować plastry z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać skrawki w PBST (0,2% Tween 20 w PBS) przez 30 minut (3 razy po 10 minut każda).
  3. Inkubować plastry z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym biotyny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Myć w PBST przez 30 minut (3 razy po 10 minut każdy).
  4. Skrawki inkubować z kompleksem peroksydazy biotyny o powinowactwie przez 40 minut i barwić środkiem achromogennym. Zamontuj sekcje na szkiełkach i dokładnie wysusz.
  5. Namocz szkiełka w bezwodnym etanolu na 5 minut i ksylenie na 10 minut, a następnie uszczelnij szkiełka medium montażowym. Na koniec zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu wyposażonego w urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) przy powiększeniach 100x, 200x i 400x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy wykazywały różny stopień przejściowego osłabienia bezpośrednio po wstrzyknięciu dojamowym (IT) roztworu AAV w 1% lidokainy hydrochlorku, co wynikało z różnej jakości wykonania iniekcji dokanałowej. Zgodnie z opracowanym przez nas półilościowym systemem oceny 5-stopniowej, zbadaliśmy wzorce transdukcji AAV u myszy z różnym stopniem wywołanego lidokainą osłabienia kończyn (wynik 0, n = 2; wynik 1, n = 1; wynik 4, n = 4; wynik 5, n = 3). Immunobarwienie EGFP rdzeni kręgosłupa wykazało ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technicznie rzecz biorąc, istnieje kilka krytycznych kroków podczas wstrzykiwania IT u obudzonych myszy. Po pierwsze, odpowiedni gest i zdecydowana kontrola myszy przez cały czas trwania operacji jest warunkiem wstępnym udanego porodu. Po drugie, najtrudniejszym punktem jest wyczucie przestrzeni międzykręgowej końcówką igły, ponieważ nie należy wkładać zbyt głęboko bez oporu ani nie wkładać na siłę pod silnym oporem w przypadku zranienia zwierząt lub zgięcia końcówki igły. Po trzecie, chociaż przejściowy paraliż spowodow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu z Departamentu Zasobów Ludzkich i Zabezpieczenia Społecznego Prowincji HEBEI (CY201605) oraz grantu z Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hebei (H2017206101), i jesteśmy bardzo wdzięczni dr za Guangping Gao, który dostarczył AAV dla tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy FVB / NJCharles River Laboratories Chiny
Monohydrat chlorowodorku lidokainyHEOWNS73-78-9
Rdzeń wektora wirusowego AAV Centrum Terapii Genowej w Szkole
25 i mikro; L  Strzykawka Hamilton/igła 27-30 GGASTIGHT1702
O.C.T compondSAKURA4583
H 2O 2SHUI HUAN PAI
Kozia surowicaSolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
Królik anty-GFPLife techG10362Rozcieńczenie 1:333
Drugie przeciwciało (koza-anty królik)Jackson Immuno Research111-005-144Rozcieńczenie 1:1,000
ODCZYNNIK VECTATAIN ABCVector LabPK-6100
ImmPACT DAB Zestaw substratów peroksydazyVector LabSK-4105
Podłoże montażowe do fluorescencji z DAPIVectorshieldH-1200
NaClYong Da Chemical
NaH2PO4· 2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4· 12H2OYong Da Chemiczny
paraformaldehydYong Da Chemiczne307699
adhezyjne Szkiełka mikroskopoweCITOGLAS1708325 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLASElectro Micro Microscopy Siences72236-6024 mm x 60 mm
15 mL Probówka wirówkowaCORNING430790
96 dołek klaster hodowli komórkowychCoster3599
24-dołkowy klaster hodowli komórkowychCoster3524
70% etanolWEN ZHI
GauzeWei AN 051711128 cm x 10 cm x 12 cm 1
mL strzykawkaHong Da
MicrotubesPlazmed
Micropipet eppendorf
Peppet końcówkiRainin
Centirifugeeppendorf5427R
RegeratorHaierBCD-539WT
FiltrMILLEX GPR4PA42342
PompaLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
MikroskopOlympusBX53
Mikrotom do zamrażaniaLeicaCM1520
Medycznej Uniwersytetu Massachusetts 170401

Bibliografia

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirusy towarzysz ce adenowirusomdostarczanie AAVterapia genowa OUNmodel mysiprzej ciowe os abienielidokainy chlorowodorektransdukcja rdzenia kr gowegoanaliza immunohistochemicznaci cie w kriosztacie
Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.