Artykuł metodologiczny

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

DOI:

10.3791/58574

⸱

27 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Medicine, University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases, University of British Columbia, 3Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sepsa noworodków pozostaje globalnym obciążeniem. Potrzebny jest model przedkliniczny do badań przesiewowych skutecznych interwencji profilaktycznych lub terapeutycznych. Posocznica wielodrobnoustrojowa u noworodków myszy może być wywołana przez wstrzyknięcie gnojowicy jelita ślepego dootrzewnowo 7 myszom i monitorowanie ich przez następny tydzień. Poniżej przedstawiono szczegółowe kroki niezbędne do wdrożenia tego modelu sepsy noworodków. Obejmuje to przygotowanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego, rozcieńczenie go do dawki dostosowanej do masy ciała i ściółki, zarys harmonogramu monitorowania oraz definicję obserwowanych kategorii zdrowotnych stosowanych do określenia humanitarnych punktów końcowych. Wytwarzanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego z połączonych dawców pozwala na podawanie go do wielu miotów w czasie, zmniejszając różnice między dawcami i zapobiegając stosowaniu potencjalnie toksycznego glicerolu. Zastosowana strategia monitorowania pozwala na przewidywanie wyników przeżycia i identyfikację myszy, które później dojdą do śmierci, co pozwala na wcześniejszą identyfikację humanitarnego punktu końcowego. Dwie główne cechy behawioralne są wykorzystywane do definiowania wyników zdrowotnych, a mianowicie zdolność nowonarodzonych myszy do prostowania się po umieszczeniu na plecach oraz ich poziom mobilności. Kryteria te mogą być potencjalnie stosowane do rozwiązywania problemów z humanitarnymi punktami końcowymi w innych badaniach chorób noworodków u myszy, o ile przeprowadzone zostanie badanie pilotażowe w celu potwierdzenia dokładności. Podsumowując, podejście to zapewnia ustandaryzowaną metodę modelowania sepsy u noworodków u myszy, zapewniając jednocześnie zasoby do oceny dobrostanu zwierząt wykorzystywane do definiowania wczesnych humanitarnych punktów końcowych dla zwierząt z wyzwaniami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sepsa jest główną przyczyną zgonów zakaźnych noworodków1. Ponieważ sepsa u noworodków jest słabo poznana, poczyniono niewielkie postępy zarówno w identyfikacji zagrożonych noworodków we wczesnym okresie choroby, jak i w opracowywaniu skutecznych metod leczenia lub profilaktyki. Wymaga to wykorzystania zwierzęcych modeli sepsy, aby lepiej zrozumieć ten proces i przetestować możliwe interwencje. Co więcej, dorosłe gryzonie różnie reagują na sepsę, ze statystycznie istotnymi różnicami w liczbie bakterii, które należy podać, aby uzyskać tę samą dawkę śmiertelną (LD) i różnicami w wynikającej z tego odpowiedzi gospodarza w porównaniu z noworodkami2. W związku z tym sepsa noworodkowa musi być badana u noworodków. W badaniach nad sepsą wykorzystano kilka modeli sepsy u dorosłych. Obejmują one prowokację dożylną z określonymi organizmami zaangażowanymi w sepsę u dorosłych ludzi lub podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP). CLP to endogenny model prowokacyjny, w którym jelito ślepe jest chirurgicznie izolowane, podwiązywane i nakłuwane, aby umożliwić wyciek treści jelitowej do otrzewnej, co ostatecznie prowadzi do ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się drobnoustrojów i ich produktów3. Jednak procedura chirurgiczna wymagana do ustalenia CLP jest śmiertelna dla nowonarodzonych zwierząt; w związku z tym konieczna jest alternatywna metoda, aby naśladować wielodrobnoustrojowe wyzwanie CLP w celu wywołania sepsy noworodków. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano model gnojowicy jelita ślepego dla posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków, w ramach którego zawartość jelita ślepego zwierząt jest zbierana, zawieszana w sterylnej dekstrozie 5% w wodzie (D5W) i wstrzykiwana dootrzewnowo nowonarodzonym myszom2. Od tego czasu stał się on coraz bardziej popularnym modelem do badania sepsy zarówno u nowonarodzonych, jak i dorosłych zwierząt i znacznie rozwinął mechanistyczny wgląd w proces choroby4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.

Biorąc pod uwagę coraz częstsze korzystanie z tego modelu i pragnienie badaczy do bezpośredniego porównywania wyników w różnych publikacjach, istnieje potrzeba dokładnego opisania i ujednolicenia aspektów technicznych we wszystkich badaniach. Standaryzacja dotyczy trzech aspektów modelu, a mianowicie: i) przygotowania gnojowicy jelita ślepego, ii) przygotowania podwielokrotności prowokacji do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym oraz iii) definicji humanitarnego punktu końcowego, zgodnie z którym zwierzęta uznaje się za nieocalałe w doświadczeniach prowokacyjnych. W szczególności metody przygotowania gnojowicy cecal są często przywoływane w oryginalnym artykule wprowadzającym model2. Krótkie podsumowanie tego modelu jest takie, że treść jelita ślepego od dorosłych myszy została pobrana, zawieszona w sterylnym D5W do stężenia 80 mg/ml i wykorzystana w ciągu 2 godzin do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym. Ten oryginalny model wykorzystywał myszy w tym samym wieku, pochodzące z tego samego miejsca dostawcy, które były trzymane w odpowiednich placówkach badawczych przez mniej niż 2 tygodnie przed pobraniem zawartości jelita ślepego. Wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, chociaż zmniejszyło koszty wynikające z regularnych dostaw od dostawców i pozwoliło na wykorzystanie nadmiaru myszy o szerszym zakresie płci i wieku, również znacznie zwiększyło zmienność między dawcami. To zmotywowało do opracowania alternatywnej techniki, w której zawartość jelita ślepego od wielu myszy została zebrana razem w celu przygotowania dużego bulionu, który następnie został podzielony na porcje i przechowywany w temperaturze -80 °C13. Ta alternatywna metoda została zaadaptowana przez wiele grup14,15. Adaptacja ta doprowadziła jednak do pewnych zmian technicznych, zarówno w zakresie stosowanych nośników pamięci (10% lub 15% glicerolu lub sam D5W), jak i strategii filtracji w celu usunięcia cząstek stałych (filtracja wielostopniowa przez filtr 860 μm, a następnie filtr 190 μm lub indywidualne filtracje przez filtry 100 μm lub 70 μm)13, 14,15. Wstrzyknięcie samego glicerolu może potencjalnie wyrządzić szkody, biorąc pod uwagę, że 25%-50% zastrzyków z glicerolu zostało wykorzystane jako model uszkodzenia nerek u gryzoni16,17,18,19,20. Aby uniknąć niezamierzonych skutków ubocznych glicerolu, preparat gnojowicy jelita ślepego dla myszy w tym badaniu zamraża się w D5W bez glicerolu i przeprowadza się testy żywotności bakterii podczas przechowywania w temperaturze -80 °C. Strategia filtracji zastosowana w tym badaniu to jedno przejście przez filtr 70 μm, który nie został bezpośrednio porównany z innymi wymienionymi strategiami filtracji.

Śmiertelne dawki wstrzykiwanej gnojowicy jelita ślepego mogą się różnić w zależności od placówki i powinny być dostosowane do pożądanej śmiertelności dla poszczególnych grup. Przy różnych dawkach prowokacyjnych, towarzyszące im objętości prowokacji zmieniają się w razie konieczności. Ten szczegół metodologiczny nie został jednak wcześniej zgłoszony. Co więcej, strategie standardowych procedur, takich jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, są rzadko omawiane w literaturze, ale poszczególne techniki mogą wpływać na to, czy nowonarodzone myszy przeciekają po wstrzyknięciu i wpływać na ich końcowe wyniki.

Dobrostan zwierząt, w tym definicja humanitarnego punktu końcowego, jest centralnym aspektem tego modelu i każdego modelu infekcji i stanu zapalnego u gryzoni21. W 1998 roku Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) opublikowała obszerne wytyczne dotyczące wyboru humanitarnego punktu końcowego, definiując humanitarny punkt końcowy jako "każdy rzeczywisty lub potencjalny ból, niepokój lub dyskomfort powinien być zminimalizowany lub złagodzony poprzez wybór najwcześniejszego punktu końcowego, który jest zgodny z naukowymi celami badania"22. Inni ostrzegają również, że humanitarne punkty końcowe muszą być ustalane w oparciu o uzasadnienie naukowe, a nie tylko subiektywną interpretację stanu zwierzęcia21. Chociaż istnieje wiele zasobów dotyczących klinicznych, behawioralnych i opartych na znakach kryteriów dotyczących humanitarnego punktu końcowego, nawet w kontekście infekcji i stanu zapalnego21,23,24, żadne z nich, w tym wytyczne CCAC dotyczące humanitarnego punktu końcowego22, wspomnij o nowonarodzonych myszach. W związku z tym obiektywnie i naukowo uzasadnione humanitarne punkty końcowe są znacznie trudniejsze do ustalenia dla nowonarodzonych zwierząt, biorąc pod uwagę zarówno ich ograniczone zdolności behawioralne, jak i brak dowodów na podstawie kryteriów takich jak utrata masy ciała, która jest powszechnie stosowana w przypadku dorosłych myszy. Obecnie kryteria humanitarnego punktu końcowego stosowane dla nowonarodzonych myszy w wieku od 5 do 12 dni w literaturze dotyczącej gnojowicy jelita ślepego odnoszą się do oryginalnego manuskryptu, który wprowadził model2. W niniejszej pracy pierwotnej definicja humanitarnego punktu końcowego dla nowonarodzonych zwierząt opierała się na dwóch kryteriach; Mianowicie, zaobserwowano, że położenie myszy poza gniazdem (rozproszenie) i brak plam mlecznych powodowały śmierć w ciągu kilku godzin. Kwestią komplikującą przypisanie humanitarnego punktu końcowego jest to, że plamy mleczne stają się trudne do zauważenia u szczepów myszy o ciemnej sierści, takich jak powszechnie stosowany szczep C57BL/6J, po pierwszym tygodniu życia, podczas gdy chore zwierzęta są monitorowane do 14. dnia życia (DOL). Co więcej, przy zastosowaniu tych kryteriów można znaleźć martwe zwierzęta po prowokacji (obserwacja własna; niepublikowana); W związku z tym konieczna jest bardziej rygorystyczna definicja humanitarnego punktu końcowego, aby złagodzić cierpienie zwierząt doświadczalnych i uniknąć śmiertelności w sytuacjach, w których wynik można było dokładnie określić wcześniej.

Wszystkie trzy aspekty metodologiczne modelu gnojowicy jelita ślepego są przedstawione w standardowej procedurze operacyjnej, szczegółowo opisującej przygotowanie gnojowicy jelita ślepego, metodę wstrzykiwania zwierząt doświadczalnych, która utrzymuje stałą objętość iniekcji między dawkami i zmniejsza ryzyko wycieków, oraz definicję humanitarnego punktu końcowego dla myszy w wieku od 7 do 12 dni w oparciu o system modelowania behawioralnego. Zebrano informacje behawioralne dotyczące wyników zdrowia myszy od ponad 240 zwierząt doświadczalnych i pogrupowano je według końcowego wyniku przeżycia, demonstrując opartą na dowodach definicję humanitarnego punktu końcowego. Cierpienie zwierząt doświadczalnych jest zmniejszane poprzez identyfikację konających noworodków myszy w najwcześniejszym możliwym punkcie czasowym, podczas gdy biologicznie istotne wyniki przeżycia można wywnioskować, obserwując kluczowe zmienne. Wizualna reprezentacja zarówno przygotowania gnojowicy jelita ślepego, jak i zachowań nowonarodzonych myszy będzie doskonałym źródłem informacji dla każdej grupy badającej sepsę lub nowonarodzonych zwierząt prowokacyjnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej pod numerem protokołu A17-0110.

1. Sterylizacja narzędzi

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) włącz i podgrzej sterylizator z gorącymi kulkami do 250 °C, co najmniej 30 minut przed użyciem.
  2. Zanurz narzędzia w 70% etanolu.
  3. Zanurz narzędzia w nagrzanym sterylizatorze gorących kulek na co najmniej 1 minutę.
    UWAGA: Uchwyty narzędzi nagrzewają się i mogą się palić, jeśli zostaną pozostawione w sterylizatorze z gorącymi kulkami na dłużej niż 1.5 minuty.
  4. Spryskaj matę ręczników papierowych 70% etanolem, aby ją wysterylizować.
  5. Wyjmij narzędzia ze sterylizatora gorących kulek, nie dotykając wysterylizowanej części narzędzia do niesterylnych uchwytów innych zanurzonych narzędzi i umieść je na ręcznikach papierowych spryskanych etanolem.
  6. Odczekaj od 30 s do 2 minut, aż narzędzia ostygną, zanim użyjesz ich do sekcji.

2. Przygotowanie gnojowicy Cecal

  1. Zważ wstępnie 15 ml probówek wirówkowych (jedna probówka na każde pięć myszy poddawanych eutanazji).
  2. Poddaj eutanazji dawców gnojowicy jelita ślepego zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami lub skorzystaj z poniższego protokołu.
    UWAGA: Do przygotowania gnojowicy jelita ślepego wykorzystano do 40 myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 12 tygodni, przy czym jednorazowo usypywano do pięciu myszy.
    1. Przenieś myszy do komory eutanazyjnej i ustaw aparat do znieczulenia izofluranem na 5% z perfuzją tlenu.
    2. Monitoruj myszy, aby zaobserwować utratę zdolności poruszania się i zobaczyć, jak wchodzą w chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, a na koniec przestań oddychać.
    3. Wyjmij mysz z komory eutanazji, uszczypnij ją w łapę i obserwuj, jak noga się cofa lub wdycha. Jeśli któryś z nich jest obecny, zwróć mysz do komory eutanazji; W przeciwnym razie kontynuuj.
    4. Nieuleczalnie poddać myszy eutanazji przez ostre zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Przeprowadzić sekcję jelita ślepego przy użyciu wstępnie wysterylizowanych i schłodzonych narzędzi (patrz punkt 1) w BSC.
    1. Przypnij nogi myszy do płyty z ekstrudowanej pianki polistyrenowej za pomocą igieł 23 G, tak aby mysz miała brzuch do góry. Zabezpiecz, a następnie spryskaj brzuch 70% etanolem.
    2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przeciąć skórę, nożyczkami poluzować skórę od wyściółki otrzewnej i rozciąć prostokątny obszar od pachwiny do mostka i od lewej strony do prawej. Usuń sierść z otrzewnej.
    3. Przełącz się na nową parę sterylnych narzędzi, aby przeciąć otrzewną, tworząc prostokątny otwór, tak jak to zrobiono w przypadku skóry, zmieniając narzędzia, jeśli te, które są używane, stykają się ze skórą.
    4. Zidentyfikuj jelito ślepe, które powinno biegnąć od lewej do prawej w poprzek ciała. Zarąb tkankę łączną, aby zidentyfikować gałęzie jelita ślepego od jelit i odciąć jelito ślepe od jelit. Umieść jelito ślepe na wysterylizowanym arkuszu papieru do ważenia.
      UWAGA: Papier wagowy można sterylizować poprzez obustronne spryskanie go 70% etanolem i pozostawienie do wyschnięcia lub poprzez naświetlanie promieniami UV. Alternatywnie, jelito ślepe można wypreparować na sterylnej szalce Petriego.
  4. Ekstruzja zawartości jelita ślepego
    1. W BSC użyj sterylnych narzędzi, aby przeciąć oba końce jelita ślepego.
    2. Przytrzymaj środek jelita ślepego sterylnymi kleszczami i użyj płaskiej, sterylnej metalowej szpatułki, aby delikatnie wypchnąć zawartość jelita ślepego z odciętych końców, wykonując ruch toczny i unikając ruchu skrobania, który mógłby rozerwać nabłonek. Zebrać zawartość i umieścić ją w wstępnie zważonej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    3. Zbierz zawartość jelita ślepego od maksymalnie pięciu myszy w tej samej probówce. Ponownie zważyć probówkę po dodaniu całej zawartości.
      UWAGA: Spodziewaj się średnio 300 mg i do 390 mg gnojowicy jelita ślepego na mysz, co wymaga od 1,8 do 2,4 ml D5W do ponownego zaparcia na mysz; dlatego użycie więcej niż pięciu myszy na tym etapie może spowodować przepełnienie probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Wytrzyj narzędzia do czysta ręcznikiem papierowym spryskanym etanolem i wysterylizuj je, powtarzając kroki 1.2-1.6.
  5. Filtracja gnojowicy jelita ślepego
    1. Zważyć probówkę wirówkową wypełnioną zawartością jelita ślepego i obliczyć ilość D5W, którą należy dodać do zawartości jelita ślepego, dzieląc wagę zawartości jelita ślepego przez pożądane stężenie wyjściowe w miligramach na mililitr, jak w poniższym równaniu.
      figure-protocol-1
    2. W BSC dodać wymaganą ilość lodowatego D5W do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej zawartość jelita ślepego.
    3. Wirować probówkę wirówkową o pojemności 15 ml w pionie i poziomie przez 30 sekund. Sprawdzić, czy nie ma cząstek stałych o średnicy większej niż 1-3 mm, a jeśli są obecne, kontynuować wirowanie, aż wszystkie duże cząstki znikną w widoczny sposób.
    4. Umieść sterylne sitko o pojemności 70 μm w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, którą umieszcza się na lodzie. Odpipetować 4 ml zawiesiny jelita ślepego do sitka komórkowego, a następnie do probówki zbiorczej. Zawiesić cząstki, pipetując w górę i w dół 2x-3x. Delikatnie wyciśnij pęcherzyki, aby zwiększyć prędkość filtrowania, jednocześnie mieszając zawartość końcówką pipety, aż nie będzie już więcej kropel do filtrowania.
      UWAGA: Podczas mieszania mogą pojawić się cząstki stałe wystarczająco duże, aby zatkać pipetę o pojemności 5 ml. W takim przypadku powtórzyć wirowanie od kroku 2.5.3 i jeśli roztwór nadal się nie rozpada, użyj pipety, aby docisnąć cząstki do ścianki probówki wirówkowej.
    5. Powtórzyć krok 2.5.4, zmieniając sitka między każdą probówką gnojowicy jelita ślepego i zebrać całą zawartość w tej samej probówce do zbierania wirówek o pojemności 50 ml trzymanej na lodzie lub w drugiej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, jeśli objętość filtratu przekracza poziom lodu w pojemniku na lód.
  6. Podwielokrotnienie gnojowicy jelita ślepego.
    1. W stosownych przypadkach połącz wiele probówek z filtratem zawiesiny o pojemności 50 ml z kroku 2.5.5 w większym sterylnym pojemniku (np. butelce do przechowywania o pojemności 1 000 ml). Następnie wiruj przez 15 s i umieść 20 ml w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Wirować gnojowicę jelita ślepego, która znajduje się w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przez 5-10 s, a następnie podsycić 500 μl do trzech fiolek kriogenicznych o pojemności 2 ml z gumową uszczelką, aby zapobiec parowaniu w miarę upływu czasu. Natychmiast umieścić zapas główny i podazieloną fiolkę kriogeniczną na lodzie.
    3. Powtarzać kroki 2.6.1 i 2.6.2 aż do momentu, gdy cała zawiesina jelita ślepego zostanie podzielona na porcje, wirując materiał główny po każdych trzech fiolkach kriogenicznych, aby zapobiec osadzaniu się jakichkolwiek cząstek stałych i utrzymać jednorodną mieszankę.
    4. Zamrozić porcje gnojowicy jelita ślepego w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Spodziewaj się od trzech do czterech fiolek po 500 μl od każdej dorosłej myszy. Każda fiolka podstawowa powinna być mniej więcej wystarczająca, aby rzucić wyzwanie jednemu miotowi ośmiu myszy na poziomie 7.

3. Wyzwanie sepsą u 7-dniowych nowonarodzonych myszy

  1. Oddziel, zidentyfikuj i zważ nowonarodzone myszy.
    1. W BSC przenieś nowonarodzone myszy do nowej klatki, aby utrzymać myszy z dala od matki i zmniejszyć stres związany z matką.
    2. Usuń i przetrzyj część materiału gniazdowego rękawiczkami, aby przenieść zapach klatki na rękawice. Następnie uformuj materiał gniazdowy w mniejsze gniazdo i umieść go w nowej klatce bez zapory.
    3. Przenieś nowonarodzone myszy do materiału gniazdowego w nowej klatce.
    4. Przenieś więcej materiału do zagnieżdżania, aby utworzyć drugie, puste gniazdo w nowej klatce.
    5. Zamknij i wyjmij klatkę zapory z kaptura, aby zapora nie była zestresowana słyszeniem niepokoju nowonarodzonych myszy.
    6. Aby śledzić poszczególne nowonarodzone myszy w miocie w czasie, użyj markera odpornego na etanol, aby zaznaczyć od jednej do pięciu kropek z przodu lub z tyłu ogona, ponownie nakładając co 12-24 godziny w razie potrzeby.
    7. Zważ każdą mysz, która będzie miała wyzwanie, umieszczając każdą z nich w drugim gnieździe po zważeniu i powtórz to dla wszystkich myszy.
    8. Zwróć cały miot do zapory przed przygotowaniem podwielokrotności prowokacji jelita ślepego.
  2. Oblicz indywidualne dawki gnojowicy jelitowej skorygowane o masę i wymagane rozcieńczenie za pomocą D5W, wykonując ten krok osobno dla każdej ściółki, korzystając z poniższych obliczeń lub korzystając z dostarczonego arkusza roboczego (patrz plik uzupełniający).
    1. Obliczyć miligramy gnojowicy jelita ślepego (a), które należy podać każdej myszy, mnożąc masę myszy w gramach (b) przez pożądaną dawkę prowokacyjną w miligramach gnojowicy jelita ślepego na gram myszy (c).
      figure-protocol-2
    2. Obliczyć indywidualną objętość nierozcieńczonej gnojowicy jelita ślepego wymaganą na mysz w mikrolitrach (d), dzieląc miligramy gnojowicy jelita ślepego potrzebnej na mysz z kroku 3.2.1 (a) przez stężenie gnojowicy jelita ślepego, 160 mg gnojowicy jelita ślepego na mililitr D5W (e) i mnożąc przez 1,000 μl na mililitr, aby przeliczyć mililitry na mikrolitry.
      figure-protocol-3
    3. Uśrednić ilość gnojowicy jelita ślepego wymaganą na mysz (g), sumując objętość gnojowicy jelita ślepego (d) na mysz w miocie n myszy, podzieloną przez liczbę myszy (n).
      figure-protocol-4
    4. Obliczyć średni współczynnik rozcieńczenia dla gnojowicy jelita ślepego (h), dzieląc średnią objętość iniekcji (100 μl) przez średnią objętość gnojowicy jelita ślepego wymaganą na mysz (g).
      figure-protocol-5
    5. Obliczyć objętość iniekcji każdej myszy w mikrolitrach (j), mnożąc objętość gnojowicy jelita ślepego wymaganej dla każdej myszy (d) przez średni współczynnik rozcieńczenia (h), a następnie zaokrąglić ją do najbliższej dziesiątki (aby dopasować przyrosty 10 μl strzykawki do wstrzykiwań).
      figure-protocol-6
    6. Obliczyć średnią wymaganą objętość D5W do rozcieńczenia gnojowicy jelitowej (k), odejmując średnią ilość gnojowicy jelitowej (g) od średniej objętości wtrysku (100 μl).
      figure-protocol-7
    7. Oblicz całkowitą ilość gnojowicy jelita ślepego w mikrolitrach (l), mnożąc średnią gnojowicę jelita ślepego na mysz w mikrolitrach (g) przez liczbę myszy w tym miocie (n) i mnożąc przez 1,4, aby uzyskać dodatkowy.
      figure-protocol-8
    8. Obliczyć całkowitą ilość D5W w mikrolitrach (m) potrzebną do rozcieńczenia gnojowicy jelita ślepego, mnożąc średnią wymaganą objętość D5W (k) przez liczbę myszy (n) i mnożąc przez 1,4, aby uzyskać dodatkowy.
      figure-protocol-9
  3. Przygotować podwielokrotność prowokacyjną po obliczeniu wymaganej ilości gnojowicy z jelita grubego (l z kroku 3.2.7). W BSC rozmrozić wymaganą liczbę fiolek z gnojowicą jelitową w temperaturze pokojowej, pipetując jej zawartość w celu wymieszania.
    1. Gdy w rozmrożonej zawiesinie jelita ślepego nie ma już widocznych kryształków lodu, należy przenieść obliczoną ilość zawiesiny jelita ślepego (l z kroku 3.2.7) do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml.
    2. Rozcieńczyć do wymaganego stężenia przez dodanie lodowatego D5W, jak obliczono w kroku 3.2.8 (m). Przechowywać podwielokrotność wyzwania na lodzie.
    3. Przed załadowaniem strzykawki wymieszaj probówkę mikrowirówki, przesuwając ją 20 razy, a następnie 3 razy pobieraj i usuwaj 300-500 μl gnojowicy jelita ślepego za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 500 cm3 28 G 1/2 cala.
    4. Pobrać około 150 μl rozcieńczonej zawiesiny jelita ślepego do tej samej strzykawki.
    5. Przesunąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki z tłoka, lekko odciągnąć strzykawkę, a następnie usunąć pęcherzyki.
    6. Dozować nadmiar zawiesiny jelita ślepego z powrotem do probówki mikrowirówki, aż do momentu, gdy do strzykawki zostanie załadowana odpowiednia ilość zawiesiny jelita ślepego dla jednej myszy, obliczona dla poszczególnych myszy w kroku 3.2.5 (j).
  4. Wstrzyknąć dootrzewnowo gnojowicę jelita ślepego, zgodnie z odpowiednimi wytycznymi lokalnej instytucji opieki nad zwierzętami lub wykonać czynności opisane poniżej.
    1. W BSC należy oddzielić nowonarodzone myszy od matki, jak opisano w kroku 3.1.
    2. Chwyć mysz za kark, używając kciuka i palca wskazującego.
    3. Przymocuj ogon myszy na grzbiecie palca środkowego i serdecznego lub na przedniej części palca serdecznego i małego palca.
    4. Aby zminimalizować przecieki, przechyl noworodka myszy tak, aby była skierowana w dół i włóż igłę pod kątem igły skierowaną do góry, między nogę a narządy płciowe, utrzymując igłę płytko i podskórnie.
    5. Po wbiciu igły na 1 cm należy naciskać w dół i do przodu, aby poczuć, jak igła nakłuwa otrzewną. Powoli wciskać tłok, trzymając końcówkę igły tak stabilnie, jak to możliwe, ponieważ ruchy boczne mogą uszkodzić narządy myszy.
    6. Ostrożnie wyjmuj igłę przez 5-10 sekund, podążając tą samą drogą na zewnątrz, co do wewnątrz, rozluźniając środkowy palec podczas usuwania, aby zmniejszyć napięcie w ciele myszy.
    7. Aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, przytrzymaj mysz przez kilka sekund po wyjęciu igły, aby dać czas na zamknięcie miejsca wstrzyknięcia i obserwuj wszelkie wycieki lub wybrzuszenia w miejscu wstrzyknięcia, w którym to momencie mysz nie powinna być używana w analizie.
      UWAGA: Wybrzuszenie skóry w miejscu wstrzyknięcia wskazuje na nieudane wstrzyknięcie dootrzewnowe, przy czym wstrzyknięcie jest podskórne.
    8. Umieść mysz na ręczniku papierowym i pozwól myszy zrobić krok. Jeśli mysz jest nieruchoma przez 5 sekund, lekko naciśnij ogon.
    9. Podnieś mysz i sprawdź, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma wycieku zawiesiny jelita ślepego. Jeśli dojdzie do wycieku, wyklucz mysz z analizy i poddaj ją eutanazji.

4. Monitorowanie myszy

  1. Regularnie monitoruj myszy, aby sprawdzić, czy dotarły do humanitarnego punktu końcowego.
    1. Obserwuj myszy 2 godziny po prowokacji pod kątem wszelkich powikłań związanych z wstrzyknięciem.
    2. Monitoruj myszy 12 godzin po prowokacji pod kątem zachorowalności związanej z sepsą i identyfikacji myszy w humanitarnym punkcie końcowym (patrz kroki 4.2-4.3 dla kryteriów).
    3. Następnie monitoruj co 4-6 godzin przez pierwsze 2 dni, z wyjątkiem 8 godzin w nocy, kiedy nowonarodzone myszy są bez opieki.
    4. Po upływie 2 dni od wyzwania monitoruj 1x-2x dziennie. Jeśli obserwuje się chore myszy lub myszy, u których ocena zdrowia spada, należy zwiększyć częstotliwość monitorowania do co 4-6 godzin.
  2. Monitorowanie nowonarodzonych myszy
    1. W przypadku każdego zabiegu z udziałem nowonarodzonych myszy należy przenieść materiał ściółkowy do nowej klatki, jak opisano w kroku 3.1 (z tych samych powodów, które tam wymieniono). Dokładnie sprawdź, czy nie ma noworodków, które są wyciągane z gniazda podczas karmienia. Myszy wyciągnięte z miotu podczas karmienia nie powinny być uważane za myszy rozproszone.
    2. Podczas usuwania górnej części gniazda należy zidentyfikować wszelkie rozproszenia nowonarodzonych myszy z dala od gniazda lub utkniętych w materiale gniazdowym, ale z dala od ich rodzeństwa z miotu, z wyjątkiem myszy odciągniętych od ściółki podczas karmienia. Zapoznaj się z kryteriami humanitarnego punktu końcowego w kroku 4.5, jeśli okaże się, że mysz jest rozproszona.
  3. Zmierz odruchy prostowania i mobilność myszy.
    1. Na ręczniku papierowym połóż mysz na jego plecach i monitoruj, czy jest w stanie wyprostować się w ciągu maksymalnie 4 sekund. Po umieszczeniu na plecach mysz opadnie na lewą lub prawą stronę, czyli wtedy, gdy zaczyna się odliczanie 4 s.
      UWAGA: Aby zostać sklasyfikowaną w grupie "Prawa", mysz musi być w stanie uzyskać co najmniej trzy z czterech opuszków łap na ręczniku papierowym przez 1 s. Nadal jest zgrupowany jako zdolny do wyprostowania się, jeśli się przewróci.
      1. Jeśli mysz może się wyprostować, poczekaj 8 sekund, aby określić jej poziom mobilności.
      2. Kategoryzuj mysz jako "Rights-Mobile", jeśli potrafi się wyprostować i eksplorować swoje otoczenie, wykonując wiele kroków z rzędu.
      3. Kategoryzuj mysz jako "Ospała", jeśli potrafi się wyprostować i podjąć kilka kroków, aby zbadać swoje otoczenie. Myszy z tej grupy mogą przewracać się podczas robienia kroku, wyglądać na chwiejne na nogach i robić przerwy między krokami.
      4. Kategoryzuj mysz jako "Rights-Nonmobile", jeśli może się wyprostować, ale nie porusza się zbyt wiele. Nadal może się przewrócić, a jeśli w ciągu 8 sekund nie podejmie żadnych kroków, jest grupowany jako Rights-Nonmobile.
    2. Jeśli mysz nie mogła się wyprostować, skategoryzuj jej mobilność na podstawie obserwowanego ruchu bioder.
      UWAGA: Unikaj powtarzania monitorowania lub wydłużania czasu, jaki mysz spędza na grzbiecie, ponieważ może to wpłynąć na system punktacji i humanitarny punkt końcowy, ponieważ mysz, która nie naprawi się w ciągu 4 sekund, może czasami to zrobić, jeśli da się jej więcej czasu.
      1. Kategoryzuj mysz jako "Nie w prawo (FTR)-Mobilna", jeśli nie jest w stanie sama się wyprostować i wyświetla ruch bioder przekraczający kąt 90° od poziomu. Niektóre myszy mogą się wyprostować, jeśli otrzymają więcej niż 4 s, ale nadal powinny być klasyfikowane jako FTR, z wynikami mobilności opartymi na ruchu bioder.
      2. Kategoryzuj mysz jako "FTR-letargiczną", jeśli nie jest w stanie się wyprostować i wyświetla ruch bioder pod kątem poniżej 90° od poziomu.
      3. Kategoryzuj mysz jako "FTR-niemobilna", jeśli nie jest w stanie się wyprostować i ma nogi, które się trzęsą lub wibrują, ale nie poruszają biodrami. Kończyny mogą się wysuwać lub chować, ale nie mają ruchu bocznego. Mysz jest widocznie chora i osiągnęła humanitarny punkt końcowy.
  4. Powtórz krok 4.3 po drugiej stronie myszy, nagrywając obie strony.
    UWAGA: Patrz plik uzupełniający, aby rejestrować obserwacje.
  5. Określ, czy mysz znajduje się w humanitarnym punkcie końcowym i wymaga eutanazji, jak opisano w Tabeli 1 i poniżej.
    1. Kategoryzuj myszy według różnych poziomów prawości i mobilności na podstawie obserwacji monitorowania zanotowanych w krokach 4.3 i 4.4. Mobilność myszy jest mierzona dla każdej strony, a zachowanie myszy jest wykorzystywane do określenia, czy mysz wymaga eutanazji.
    2. Przydziel dowolne myszy z odruchem prostowania (a) FTR-Nieruchliwe, albo (b) FTR-Ospałe, które zostaną oddzielone od gniazda, aby znajdowały się w humanitarnym punkcie końcowym.
    3. Monitorując punkty czasowe powyżej 20 godzin po prowokacji, sklasyfikuj każdą mysz z odruchem prostowania "nie udaje się w prawo" po obu stronach jako znajdującą się w humanitarnym punkcie końcowym, ponieważ przedstawione dane przewidują z dużą dokładnością, że myszy te w końcu ulegną chorobie i nie wyzdrowieją.
  6. Oddziel myszy, które mają zostać poddane eutanazji, zgodnie z opisem w kroku 4.5. Jeśli monitorowana mysz nie jest postrzegana jako znajdująca się w humanitarnym punkcie końcowym, umieść ją w drugim pustym gnieździe w nowej klatce bez tamy i kontynuuj z innymi nowonarodzonymi myszami.
  7. Po monitorowaniu całego miotu przenieś połowę materiału gniazdowego do klatki z zaporą, przekształcając gniazdo z miejscem pośrodku dla nowonarodzonych myszy.
    UWAGA: Nieprawidłowo uformowane gniazdo może spowodować rozproszenie się myszy i zmniejszenie dostępnej opieki, jaką może zaoferować tama.
  8. Przenieś nowonarodzone myszy z powrotem do klatki z zaporą.
  9. Zamknij ściółkę w gnieździe, kładąc resztki materiału gniazdowego na ściółce i delikatnie ściskając ją wokół pokrywy, aby zabezpieczyć materiał do gniazdowania na miejscu.
  10. Poddaj eutanazji nowonarodzone myszy oddzielone w kroku 4.6 zgodnie z wymaganiami lokalnej instytucji.

5. Miareczkowanie gnojowicy jelita ślepego

  1. Poddać myszy prowokacji po podaniu żądanej dawki prowokacyjnej (sekcja 3) i monitorować wyniki (sekcja 4).
  2. Obserwuj, czy końcowy wynik prowadzi do pożądanej LD, a jeśli nie, powtórz sekcje 3 i 4 z nowym miotem z wyższą lub niższą dawką prowokacyjną, dostosowując ją o 5%-10%.
    UWAGA: Dawki prowokacyjne mogą być podobne do Rysunek 1B, ale muszą być zbalansowane w każdym obiekcie i szczepie myszy.
  3. Obserwuj również, czy myszy osiągają humanitarny punkt końcowy szybciej czy wolniej niż oczekiwana kinetyka w Rysunek 1B, i powtórz sekcje 3 i 4 z nowym miotem przy wyższej lub niższej dawce prowokacyjnej, dostosowując ją o 5%-10%.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotność gnojowicy jelitowej przechowywanej w temperaturze -80 °C może być testowana w czasie poprzez seryjne rozcieńczanie i posiewanie porcji gnojowicy jelita ślepego na 5% próbnym agarze sojowym z krwią owczą, a następnie 24 godziny inkubacji tlenowej w temperaturze 37 °C. Stwierdzono, że późniejsze liczenie zawartości jednostki tworzącej kolonię (CFU) w preparacie gnojowicy jelita ślepego nie zmieniło się przez okres 6 miesięcy, a na żywotność nie miało wpływu długotrwałe przechowywanie w temperaturze -80 °C (Rysunek 2). Każda mysz dawczyni dawała średnio wystarczającą ilość gnojowicy jelita ślepego, aby rzucić wyzwanie trzem do czterech miotów (dane nie pokazane).

Myszy prowokowane w DOL 7 gnojowicą jelita ślepego w celu wywołania sepsy wielobakteryjnej zaczęły osiągać humanitarny punkt końcowy w ciągu 12 godzin od wyzwania, a posocznica wielodrobnoustrojowa została w większości rozwiązana w ciągu 48 godzin po prowokacji, jak zaobserwowano w krzywej przeżycia Kaplana-Meiera połączonej z danymi od ponad 200 myszy z prowokacją (Rysunek 1A). Śmiertelność zależała od podanej dawki prowokacyjnej, przy czym 5% zmiana dawki prowokacyjnej powodowała około 15% różnicę we wskaźniku przeżycia (Figura 1B). Masa ciała myszy była mierzona podczas każdej wizyty monitorującej. Utratę masy ciała zaobserwowano u wszystkich zwierząt, które podjęły wyzwanie, przy czym nie było dyskryminacji między myszami, które ostatecznie przeżyły, a tymi, które nie przeżyły w ciągu początkowych 24 godzin po prowokacji (Rysunek 1C). Po 24 godzinach większość zwierząt, które przeżyły, zaczęła odzyskiwać wagę, podczas gdy wszystkie zwierzęta, które nie przeżyły, nadal traciły na wadze i przeniosły się do humanitarnego punktu końcowego. Jednak niewielka część zwierząt, które przeżyły, które zachowały odruch prostowania, również nadal traciła na wadze lub nie przybierała na wadze, aż do końca eksperymentu, tracąc nawet 20% początkowej masy ciała w ciągu 40 godzin od wyzwania. Ponieważ utrata masy ciała między myszami, które ostatecznie przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, nastąpiła pokrywająca się utrata masy ciała, zmiana masy ciała lub próg utraty masy ciała nie mogły być wykorzystane jako kryterium humanitarnego punktu końcowego, przy jednoczesnym zachowaniu celu, jakim jest dokładne oddzielenie osób, które przeżyły, od tych, które nie przeżyły.

Zachowanie myszy było monitorowane zgodnie z opisem w protokole i w Tabeli 2. Wyświetlane są migawki kategorii zdrowotnych (Rysunek 3A-C). Zdjęcia te pokazują różne kategorie zdrowotne myszy, które nie zdołały się wyprostować po umieszczeniu na plecach i nakreślają różnicę między FTR-Mobile a FTR-Letargic, co jest ważnym rozróżnieniem. Zdrowe myszy w tym wieku nie wykazują aktywności FTR-letargicznej; Dlatego ta kategoria zdrowia jest markerem choroby i odpowiedzią na wyzwanie. Chore myszy wykazywały objawy letargu FTR (Rysunek 3B) i mogły cofnąć się w kierunku FTR-Nonmobile (Rysunek 3C), gdzie górna noga pozostaje równoległa do dolnej nogi, z niewielkim lub zerowym ruchem kołysania bioder, co jest jednym z kryteriów humanitarnego punktu końcowego. Myszy mogą również wyzdrowieć, uzyskując zwiększony ruch bioder i stając się FTR-Mobile (Rysunek 3A). Wyniki odruchu prostego i mobilności określono zarówno dla lewej, jak i prawej strony każdej myszy, a najwyższy wynik wykorzystano do określenia, czy mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy. Informacje behawioralne zebrano od ponad 240 zwierząt, którym podano śmiertelną dawkę 60 (LD60) gnojowicy jelita ślepego i zaobserwowano 144 humanitarne punkty końcowe (Rysunek 3D-F i Tabela 1). To oparte na dowodach podejście wykorzystano do zdefiniowania i udoskonalenia humanitarnego punktu końcowego w czterech etapach choroby, skategoryzowanych przez eksperymentatorów na podstawie zarówno różnic behawioralnych między osobami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, jak i ułamkiem humanitarnych punktów końcowych osiągniętych w każdym przedziale czasowym. Podczas wczesnych eksperymentów myszy FTR-Nonmobile, które nie miały ruchu bioder, były konsekwentnie znajdowane martwe w ciągu 4-6 godzin od zaobserwowania tego zachowania. W zbieraniu przedstawionych informacji jako kryterium humanitarnego punktu końcowego wykorzystano ocenę stanu zdrowia FTR-Nonmobile. Od 12 do 21 godzin po prowokacji, podczas gdy myszy FTR-Nonmobile zostały poddane eutanazji, zarówno zwierzęta, które przeżyły, jak i nieocalałe, wykazywały bardzo podobne wzorce zachowań i nie można ich było odróżnić w żaden inny sposób (Rysunek 3D). Od 21 do 48 godzin po prowokacji większość myszy, które przeżyły, odzyskała odruch prostowania, podczas gdy mniej niż 1% zaobserwowanych zachowań FTR dotyczyło zwierząt, które przeżyłyby eksperyment (Ryc. 3E). W ten sposób myszy, które nie zdołały wyprostować się z obu stron, stały się dodatkowym kryterium humanitarnego punktu końcowego w tym czasie. Między 12 a 20 godziną po prowokacji zaobserwowano 12,5% całkowitej liczby ludzkich punktów końcowych, w porównaniu z 80,5% między 20 a 48 godziną i 7% po 48 godzinach (Tabela 1). Cechą odróżniającą myszy, które ostatecznie przeżyły i które ostatecznie pogorszyły się do humanitarnego punktu końcowego, była utrata odruchu prostowania, niezależna od ruchomości bioder (Ryc. 3F). Rzeczywiście, między 20 a 48 godzinami po prowokacji łącznie 121 myszy nie zdołało wyprostować się z obu stron, przy czym 116 z tych myszy ostatecznie przeszło do humanitarnego punktu końcowego (co stanowi 96% dokładność w identyfikacji myszy, które nie wyzdrowieją). Po upływie 48 godzin od wyzwania zaobserwowano, że 11 myszy nie jest w stanie wyprostować się z obu stron, a 10 z nich osiągnęło humanitarny punkt końcowy (91% dokładności). Po upływie 20 godzin od wyzwania liczba myszy, które utraciły odruch prostowania dla obu stron, przewiduje ostateczny wynik z dokładnością ponad 90%; w związku z tym zostało to dodane do kryteriów humanitarnego punktu końcowego, aby wcześniej zidentyfikować myszy, które nie wróciły do zdrowia, i zmniejszyć cierpienie myszy (Tabela 1).

Częstotliwość, z jaką myszy potrzebują monitorowania, zmienia się w czasie, ze względu na różne wskaźniki zgonów po prowokacji, i jest opisana w Tabeli 1. Uważano, że mysz znajduje się w humanitarnym punkcie końcowym w dowolnym momencie, jeśli nie zdołała się wyprostować i wykazywała nieruchome ruchy bioder po obu stronach, lub jeśli mysz została znaleziona rozproszona z gniazda, nie była w stanie się wyprostować i miała letargiczny ruch bioder. Oczekiwano, że myszy z którymkolwiek z tych schorzeń nie będą w stanie ponownie dołączyć do miotu i zaobserwowano, że są FTR-Nonmobile w ciągu 4-6 godzin. Począwszy od 20 godzin po wyzwaniu, dodano nowy humanitarny punkt końcowy, ponieważ przedstawione informacje pokazują, że zdecydowana większość myszy, u których obie strony doświadczają FTR, ulega chorobie.

Filmy, tabele i zasoby przedstawione w tym manuskrypcie są skutecznym źródłem nauczania dla prawidłowego przypisywania zachowań u myszy z wyzwaniami. Siedmiu eksperymentatorów zostało poproszonych o obejrzenie filmu szkoleniowego i przeczytanie zarówno protokołu, jak i tabel przed przypisaniem zachowań 60 wyzwanym zwierzętom. Identyfikacja humanitarnego przypisania punktu końcowego była dokładna zarówno w przypadku odróżnienia myszy FTR-Nonmobile od myszy, które wykazywały inne zachowania (Figura 4A), jak i myszy FTR od myszy, które były w stanie wyprostować się w dopuszczalnym przedziale czasowym (Figura 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera, miareczkowanie dawki gnojowicy jelita ślepego i zmiana masy ciała po prowokacji gnojowicy jelita ślepego. (A) Wynik przeżycia noworodków myszy C57BL/6J, którym podano dootrzewnowe wstrzyknięcie gnojowicy jelita ślepego w DOL 7. Dane dla tej liczby zostały połączone z niezależnych eksperymentów z użyciem wielokrotnych dawek prowokacyjnych, w zakresie od 0,7 do 1,3 mg gnojowicy jelita ślepego na gram masy ciała, którą podawano tym myszom. (B) Nowonarodzone myszy, którym podano od 0,80 do 0,95 mg gnojowicy jelita ślepego na gram masy ciała z jednego preparatu gnojowicy jelita ślepego, wykazują zależny od dawki związek między ilością podanej gnojowicy jelita ślepego a procentem przeżycia. (C) Procentowa zmiana masy ciała w porównaniu z wagą wyzwania, przy czym linia przerywana oznacza 20% utratę masy ciała od czasu wyzwania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Stężenie CFU w gnojowicy cecalowej przechowywanej w temperaturze -80 °C nie zmienia się przez okres 6 miesięcy. Wpływ wieku gnojowicy jelita ślepego na stężenie CFU badano za pomocą regresji liniowej. Każdy punkt odpowiada jednej podwielokrotności tego samego preparatu gnojowicy jelita ślepego, seryjnie rozcieńczanej i powlekanej przez okres 6 miesięcy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kategorie ruchomości bioder u myszy, które nie są w stanie się poprawić, oraz zachowania zwierząt w różnych momentach po wyzwaniu. Myszy, które zostały poddane sepsie, po umieszczeniu na plecach będą wykazywać oznaki zachorowalności, które można zmierzyć stopniem ruchu bioder. (A) Mysz mobilna nie działająca w prawo (FTR) wykazuje ruch kołysania bioder górnej części nogi przekraczający kąt 90° od poziomu. (B) Mysz z letargiem FTR wykazuje ruch kołysania bioder, ale nie przekracza kąta 90° od poziomu w żadnym momencie podczas 4 sekund monitorowania. (C) Niektóre myszy FTR-Nonmobile będą prostować nogę, zginając się w kolanie, ale będą wykazywać bardzo mały (kąty mniejsze niż 10°) lub zerowy ruch kołysania bioder, a nogi pozostaną równoległe do siebie. (D) Zachowania zwierząt w ciągu 12-21 godzin po wyzwaniu pokazują, że tylko zachowania FTR-Nonmobile oddzielają osoby, które przeżyły, od tych, którzy nie przeżyli. (E) Od 21 do 48 godzin po prowokacji tylko 4 z 592 zaobserwowanych zachowań FTR (0,67%) należą do osób, które przeżyły, co pozwala odruchowi prostowania przewidzieć ostateczny wynik i może być wykorzystane jako nowe kryterium dla humanitarnego punktu końcowego. Po upływie 48 godzin od zakażenia, 6 ze 131 myszy (4,55%), które miały odruch prostowania, stało się częścią grupy FTR i zostało uśmiercone pod koniec eksperymentu, co uzasadnia ciągłe monitorowanie przez cały okres rekonwalescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Materiały instruktażowe skutkują dokładną klasyfikacją zachowań przez niezależnych eksperymentatorów. Eksperymentatorzy przeszkoleni przez oglądanie filmów towarzyszących temu protokołowi podzielili filmy z 60 nowonarodzonymi myszami na różne grupy zdrowotne. (A) Określono zdolność do rozróżnienia humanitarnego punktu końcowego i średnio 97% zachowań zostało dokładnie sklasyfikowanych jako FTR-niemobilne lub nie, podczas gdy tylko 1% myszy FTR-niemobilnych zostało błędnie zidentyfikowanych. Dwa procent myszy zostało błędnie zidentyfikowanych jako FTR-Nonmobile. (B) Identyfikacja drugiego humanitarnego kryterium punktu końcowego prawidłowego rozróżnienia myszy FTR lub tych, które mają zdolność wyprostowania się w ciągu 4 sekund od umieszczenia na plecach, została przypisana prawidłowo w 97% scoringów, podczas gdy tylko 0,96% myszy zostało nieprawidłowo przypisanych jako prostujące się, a 2% myszy zostało nieprawidłowo przypisanych jako FTR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. .
Stadium chorobyA: Wysoka zachorowalność, brak śmiertelnościB: Wysoka zachorowalność, niska śmiertelnośćC: Wysoka zachorowalność, wysoka śmiertelnośćD: Niska zachorowalność, niska śmiertelność
Godziny po wyzwaniu0−1212−2020−48>48
Częstotliwość monitorowania2 godziny po wyzwaniuco 4−6 hCo 4−6 h, 8 h, bez opieki przez noc1-2 razy dziennie, w razie potrzeby więcej
Odsetek zaobserwowanych całkowitych humanitarnych punktów końcowych 0/14418/144Numer katalogowy 116/14410/144
Odsetek zaobserwowanych humanitarnych punktów końcowych0%12,5 proc80,5%7 proc
Kryteria humanitarnego punktu końcowego1. FTR−Niemobilny po obu stronach1. FTR−Niemobilny po obu stronach
2. Rozproszony z gniazda i jest FTR−Letargiczny2. Rozproszony z gniazda i jest FTR−Letargiczny
3. FTR po lewej lub prawej stronie (z dowolnym wynikiem mobilności)

Tabela 1: Częstotliwość monitorowania i kryteria humanitarnego punktu końcowego w różnych stadiach choroby. Częstotliwość monitorowania, obserwowane humanitarne punkty końcowe, odsetek humanitarnych punktów końcowych i kryteria humanitarnego punktu końcowego w różnych stadiach choroby.

Odruch prostowaniaruchliwośćLimit czasu do prawej po umieszczeniu na plecachLimit czasu na pomiar ilości ruchu (ruchomy / ospały / nieruchomy)Kryteria punktacji w zakresie mobilności
Prawaruchomy4 s Dodatkowe 8 sMysz robi wiele kroków z rzędu, utrzymując pęd do przodu i eksploruje otoczenie. Szczeniak się nie przewróci.
ospałyMysz może zrobić krok, ale zatrzyma się i zatrzyma przed wykonaniem kolejnego. Szczeniak może się przewrócić.
NiemobilnyMysz nie wykonuje żadnych kroków po wyprostowaniu się. Szczeniak może się przewrócić.
Nie udało się w prawoRuchome biodraTe same 4 s używane do pomiaru odruchu prostowaniaMa energiczny ruch bioder z górną nogą obracającą się pod kątem większym niż 90° od poziomu co najmniej raz w ciągu 4 s.
Ospałe biodraRuch bioder do 90° od poziomu, ale nie dalej.
Nieruchome biodraKończyny mogą się poruszać, rozciągając się i chowając, ale biodra nie będą się obracać. Szczeniak wygląda bardzo chorowicie.

Tabela 2: Tabela monitorowania i kryteria określania oceny zdrowia myszy. Dostarczone kryteria wykorzystano do zdefiniowania grup kategorii zdrowia dla myszy oraz do zmniejszenia indywidualnej wariancji w przypisywaniu wyników zdrowotnych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy noworodkowe po porodzie mają bardzo ograniczoną mobilność i nie są w stanie wyprostować się po umieszczeniu na plecach, nawet jeśli nie są kwestionowane. Do DOL 7, wieku myszy z wyzwaniem w tym modelu, zakres ruchu rozciągający się od Rights-Mobile do FTR-Mobile zaobserwowano u myszy bez wyzwania, z istotną różnicą, a mianowicie, że niekwestionowana mysz w tym wieku nie wykazywała zachowania FTR-letargiczne. Zaobserwowano, że tylko myszy z posocznicą wielodrobnoustrojową stały się ospałe FTR; Dlatego ta odpowiedź może być markerem ciężkości choroby. Zwracanie uwagi na odcięcie kąta 90° od poziomu dla ruchu bioder pozwala na konsekwentne i dokładne przypisanie ospałego lub ruchomego ruchu bioder u myszy. Wybrano przedział czasowy 4 s, aby sprawdzić, czy mysz może się wyprostować, ponieważ myszy bez wyzwań były w stanie konsekwentnie wyprostować się w tym przedziale czasowym. Unikano wielokrotnego pomiaru tej samej myszy, natomiast czas na wyprostowanie się i pomiar ruchomości bioder ograniczono do 4 s, aby uniknąć nadmiernego zmęczenia myszy, co w przeciwnym razie mogłoby wpłynąć na jej zdolność do pozyskiwania pożywienia i ciepła oraz mogłoby wpłynąć na jej rokowanie w sprawie poprawy. Zaobserwowano prostowanie się zarówno po lewej, jak i po prawej stronie, a wyższy z wyników wykorzystano do określenia, czy mysz znajdowała się w humanitarnym punkcie końcowym, ponieważ stwierdzono, że niektóre myszy wykazują FTR-Nonmobile po jednej stronie, ale mają większą mobilność po drugiej stronie i są w stanie ostatecznie wyzdrowieć.

System punktacji używany do oceny zdrowia myszy opierał się na zastosowaniu kategorycznych odcięć do tego, co jest spektrum ruchu, a zatem mógł być podatny na indywidualne odchylenia. Personel został przeszkolony razem, aby upewnić się, że każda osoba ocenia myszy tak samo; Jednak prawdopodobnie pozostanie pewien poziom subiektywności prowadzący do zmienności. Spójność punktacji oceniono, prosząc siedmiu badaczy, którzy wcześniej nie prowadzili monitorowania noworodków na myszach, aby poznali wymagania określone w tym protokole i filmie, a następnie niezależnie przypisali zachowania i określili humanitarny punkt końcowy. Zaobserwowano 97% dokładność przy punktacji przeprowadzonej na 60 myszach z prowizją, co sugeruje, że indywidualne uprzedzenia nie odgrywają znaczącej roli w przypisaniach behawioralnych tego modelu. Przedstawiony protokół monitorowania behawioralnego opiera się na obserwacjach zwierząt poddanych badaniu DOL 7, jednak myszy młodsze niż 6 dni w niekwestionowanym stanie zdrowia nie mogą konsekwentnie się naprawiać. W związku z tym opisane humanitarne kryteria punktu końcowego nie mogły być bezpośrednio zastosowane do młodszych myszy. Jeśli w tym modelu eksperymentalnym wykorzystuje się młodsze myszy lub jeśli stosuje się inny model prowokacyjny o różnej kinetyce choroby, należy opracować i pilotować odpowiednie humanitarne kryteria punktu końcowego, aby uniknąć eutanazji myszy, które w przeciwnym razie ostatecznie wyzdrowiałyby. System punktacji przedstawia solidną metodę poprawy klasyfikacji humanitarnych punktów końcowych, która po przetestowaniu i potwierdzeniu może potencjalnie zostać zastosowana w innych modelach.

Każde przygotowanie gnojowicy jelita ślepego lub użycie nowego szczepu myszy wymagało retitracji dawki gnojowicy jelita ślepego do podania w celu uzyskania podobnej dawki śmiertelnej. Każdy preparat został ustandaryzowany przez odczyt interesujący nas sam, a mianowicie przeżycie, a nie podający tę samą liczbę bakterii. Stężenie bakterii żywotnych w każdym preparatzie gnojowicy jelita ślepego różniło się nieznacznie, potencjalnie z powodu różnic w bakteriach komensalnych dawcy lub z powodu różnic w masie pozostawionej w sitku komórkowym gnojowicy jelita ślepego po filtracji. Podczas miareczkowania gnojowicy jelita ślepego pierwsze dwa mioty podzielono na dwie grupy, a każdej połowie miotu podano jedną z dwóch dawek, tak aby każda z dawek została przetestowana w dwóch miotach. Jeśli uzyskany wskaźnik przeżycia nie odpowiadał wymaganemu poziomowi, wówczas dawkę prowokacyjną zwiększano lub zmniejszano o 5%-10% i eksperyment powtarzano. Wykorzystano wiele miotów, aby uwzględnić różnice między miotami, które mogą powodować odporność lub zwiększoną podatność na sepsę w miocie. Ważne było dokładne mianowanie gnojowicy jelita ślepego przy każdym nowym przygotowaniu, aby zapewnić, że nowe miareczkowanie gnojowicy jelita ślepego było porównywalne z poprzednimi preparatami gnojowicy jelita ślepego. Zaobserwowano, że okresy nadmiernego hałasu i wibracji, szczególnie podczas zagęszczania asfaltu oraz budowy pobliskiego budynku i drogi, zwiększają naprężenia w zaporach. Wiązało się to ze zwiększonymi wskaźnikami kanibalizacji i wpłynęło na śmiertelność eksperymentów dotyczących przeżycia, dotykając nawet myszy bez wyzwań, co wskazuje, że mogą istnieć zewnętrzne wpływy na przeżycie noworodków, które również należy kontrolować.

Wcześniejsze metody przygotowania gnojowicy jelita ślepego obejmowały albo użycie świeżej gnojowicy jelita ślepego, albo przygotowanie zamrożonej gnojowicy jelita ślepego, przy użyciu różnych metod, w tym przechowywania w glicerolu, który nieuchronnie zostałby przeniesiony podczas wyzwania. Podczas gdy stosowanie świeżej gnojowicy jelita ślepego ma tę zaletę, że skład bakteryjny jest najbardziej zbliżony do oryginalnej zawartości jelita ślepego, istnieje ryzyko rozbieżności między poszczególnymi myszami-dawcami ze względu na zmienność bakterii komensalnych. Chociaż zostało to zminimalizowane dzięki użyciu dawców jelita ślepego od tego samego dostawcy z minimalnym czasem między przybyciem a postępem eksperymentu, może to stać się zbyt kosztowną opcją dla niektórych laboratoriów i stanowiło kolejne wyzwanie logistyczne związane z dostępnością myszy w tym samym wieku podczas rozpoczynania eksperymentu z gnojowicą jelita ślepego u nowonarodzonych myszy, które miały 7 dni. Zastosowano alternatywną metodę wykorzystania świeżej gnojowicy jelita ślepego, w której zawartość jelita ślepego wielu dorosłych dawców została zebrana, ponownie zawieszona w D5W, zamrożona w temperaturze -80 °C bez glicerolu i rozmrożona po jednej porcji na raz do eksperymentów. Wykorzystanie gnojowicy jelita ślepego dorosłego dawcy do badania sepsy noworodków może potencjalnie przenosić gatunki bakterii obecnych w gnojowicy jelita ślepego, na które nowonarodzona mysz nie była narażona, ale jest to strategia, która pozwala na badanie sepsy u noworodków myszy i była wykorzystywana do badania biologii noworodków myszy w ciągu ostatnich13 lat. Rozdział 14,15. Gnojowica jelita ślepego została rozcieńczona w D5W, aby zapewnić odżywienie bakteriom, co pozwoliło na ustanowienie aktywnej infekcji po wstrzyknięciu bakterii i miało na celu naśladowanie dostępności składników odżywczych w jamie otrzewnej podczas martwiczego zapalenia jelit. Glicerol nie został włączony jako środek stabilizujący w zamrażaniu bakterii ze względu na potencjalne negatywne skutki uboczne, które mogą wynikać z samego wstrzyknięcia glicerolu. Gdyby glicerol został zawarty w preparacie zawiesiny jelita ślepego, wówczas potencjalne uszkodzenia, które może wywołać sam glicerol, musiałyby zostać przetestowane poprzez włączenie wstrzyknięcia samego glicerolu (bez zawiesiny jelita ślepego) u myszy, co zwiększyłoby użycie myszy. Żywotność bakterii gnojowicy jelita ślepego badano po zamrożeniu gnojowicy jelita ślepego bez glicerolu i stwierdzono, że jest stała, bez zmian w stężeniu bakterii w oddzielnych podwielokrotnościach tego samego preparatu gnojowicy jelita ślepego przechowywanego w temperaturze -80 °C przez okres 6 miesięcy. Sugeruje to, że przechowywanie bez glicerolu jest wykonalne w celu zapewnienia spójnego wyniku biologicznego. Zastosowanie masowo przygotowanej mrożonej gnojowicy jelita ślepego pozwoliło również na wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, zmniejszając koszty i wykorzystując samce myszy, które w przeciwnym razie byłyby nadmierne z hodowli, zmniejszając w ten sposób marnotrawstwo myszy.

Identyfikacja nieudanych wyzwań u myszy była ważna, aby uniknąć dodawania dodatkowego szumu do systemu. Po poddaniu się dootrzewnowemu wstrzyknięciu gnojowicy jelita ślepego, myszy obserwowano pod kątem obecności wybrzuszenia pod skórą, co wskazywało na nieudane wstrzyknięcie, które w rzeczywistości było podskórne. U myszy obserwowano nieszczelności w miejscu wstrzyknięcia, zarówno bezpośrednio po usunięciu igły, jak i po umożliwieniu im wykonania kroku po wstrzyknięciu, ponieważ myszy czasami (rzadko) przeciekały dopiero po przesunięciu kończyny miejsca wstrzyknięcia o krok. Obecność wybrzuszenia lub nieszczelności po wstrzyknięciu skutkowała usunięciem myszy z analizy. W końcu każdy z tych objawów może skutkować innym wynikiem z powodu nieprawidłowej ilości wstrzykniętej gnojowicy jelita ślepego, ponieważ zaobserwowano, że 5% różnica w dawce prowokacyjnej wpływa na późniejsze przeżycie.

Eksperymenty prowokacyjne z gnojowicą jelita ślepego często wymagały różnych docelowych dawek śmiertelnych przy różnych dawkach dostosowanych do masy. Z tego powodu objętość wtrysku może wynosić od zaledwie 20 μl do nawet 100 μl. Proporcjonalny błąd eksperymentalny związany z objętością martwej igły również zmienia się wraz z objętością wstrzyknięcia, co zwiększa trudność bezpośredniego porównania różnych dawek. Dzięki prostej modyfikacji polegającej na standaryzacji objętości iniekcji, to źródło wariancji jest usuwane z eksperymentu.

System monitorowania zachowania noworodków myszy zastosowany w tym protokole jest pierwszym w swoim rodzaju. Naukowcy, którzy zamierzają prowadzić etyczne badania na nowonarodzonych myszach, często borykają się z wyzwaniem braku zasobów do oceny dobrostanu zwierzęcia w tym wieku. Prezentowany intuicyjny i spójny system monitorowania zaczyna wypełniać tę lukę w wiedzy. Co ważne, to oparte na dowodach podejście nie tylko podnosi jakość uzyskanych danych doświadczalnych, ale jednocześnie zmniejsza cierpienie zwierząt doświadczalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr James Wynn otrzymuje wsparcie od National Institutes of Health (NIH)/National Institute of General Medical Sciences (R01GM128452) oraz NIH/Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD089939).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalne podziękowania dla Claire Harrison i Animal Care Facility w British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) za ich wsparcie w pracy ze zwierzętami, a także dla dr Po-Yan Cheng za ich wskazówki i wkład w monitorowanie i dobrostan zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 - 20 μ L końcówki do pipetVWR732-0799
1,8 ml Probówka do mikrowirówekCostar3621
100 - 1000 μ L końcówki do pipetVWR732-0801
1 - 200 μ L końcówki do pipetVWR732-0800
15 ml Probówka wirówkowaFroggaBioTB15-25
23G1igły Becton Dickinson305145tylko igła, a nie strzykawka, służąca do przypinania myszy do styropianu
28G 0,5 ml Strzykawka insulinowaBD329461
2 ml Fiolka kriogenicznaCorning430488
50 ml Probówka wirówkowaFisher scientific14-432-22
Pipeta 5 mlCostar4487
6 - 10-tygodniowe dorosłe myszy C57BL/6JJackson Laboratories664
7 + jednodniowe myszy noworodkowe C57BL/6JWyhodowane w domun.a
70 μ m Sitko do komórekFalcon352350
Defibrynowana krew owczaDalynnHS30-500
Dekstroza 5% wody (D5W)BaxterJB0080
Kleszcze preparacyjneVWR  82027-386
Nożyczki preparacyjne, ostra końcówkaVWR  82027-592
Nożyczki preparacyjne, ostra/końcówkaVWR82027-594
Etanol (HistoPrep 95% denaturowany alkohol etylowy)FisherbrandHC11001GLrozcieńczony do 70% podwójnie destylowaną wodą
Marker odporny na etanol; Marker laboratoryjnyVWR52877-310
EZ Anesthesia VaporizerEZ AnesthesiaEZ-155
Germinator 500, Narzędzie chirurgiczne do sterylizacji na sucho (sterylizator gorących kulek)Braintree ScientificGER 5287-120V
IsofluraneFresenius KabiCP0406V2
Micro SpatulaChemglassCG-1983-12
PipetaDrummond4-000-100
Klasyczna pipeta Rainin PR-1000Rainin17008653
Klasyczna pipeta Rainin PR-20Pipeta klasyczna Rainin
Klasyczna pipeta Rainin PR-200do 17008652Rainin
SartoriusBL 150 S
Kleszczyki do próbekVWR82027-440 / 82027-442
Kwadratowa butelka do przechowywania 1000 mlCorning431433
Płyta styropianowaDowolnan.a
Sure-Seal Komora eutanazja myszy/szczuraEuthanexEZ-178
Agar sojowy tryptycznySigma-Aldrich22091-2,5KG
VX-200 Lab Vortex MixerLabnet InternationalS0200
waga papierFisherbrand09-898-12B
17008650 Waga

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
  2. Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
  3. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
  4. Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
  5. Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
  6. Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
  7. Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
  8. Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
  9. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
  10. Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).
  11. Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
  12. Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
  13. Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).
  14. Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
  15. Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
  16. Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).
  17. Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
  18. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
  19. Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
  20. Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
  21. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
  22. Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
  23. Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. Humane endpoints in shock research. SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).
  24. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neonatal Sepsis ModelCecal Slurry PreparationPolymicrobial SepsisHumane Endpoint MonitoringMouse Pup ChallengeWeight Adjusted DoseHealth Score AssessmentRighting Reflex TestSurvival Curve AnalysisAnimal Welfare Protocol

Powiązane artykuły