Artykuł metodologiczny

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58574

⸱

27 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Medicine, University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases, University of British Columbia, 3Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Streszczenie

Sepsa noworodków pozostaje globalnym obciążeniem. Potrzebny jest model przedkliniczny do badań przesiewowych skutecznych interwencji profilaktycznych lub terapeutycznych. Posocznica wielodrobnoustrojowa u noworodków myszy może być wywołana przez wstrzyknięcie gnojowicy jelita ślepego dootrzewnowo 7 myszom i monitorowanie ich przez następny tydzień. Poniżej przedstawiono szczegółowe kroki niezbędne do wdrożenia tego modelu sepsy noworodków. Obejmuje to przygotowanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego, rozcieńczenie go do dawki dostosowanej do masy ciała i ściółki, zarys harmonogramu monitorowania oraz definicję obserwowanych kategorii zdrowotnych stosowanych do określenia humanitarnych punktów końcowych. Wytwarzanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego z połączonych dawców pozwala na podawanie go do wielu miotów w czasie, zmniejszając różnice między dawcami i zapobiegając stosowaniu potencjalnie toksycznego glicerolu. Zastosowana strategia monitorowania pozwala na przewidywanie wyników przeżycia i identyfikację myszy, które później dojdą do śmierci, co pozwala na wcześniejszą identyfikację humanitarnego punktu końcowego. Dwie główne cechy behawioralne są wykorzystywane do definiowania wyników zdrowotnych, a mianowicie zdolność nowonarodzonych myszy do prostowania się po umieszczeniu na plecach oraz ich poziom mobilności. Kryteria te mogą być potencjalnie stosowane do rozwiązywania problemów z humanitarnymi punktami końcowymi w innych badaniach chorób noworodków u myszy, o ile przeprowadzone zostanie badanie pilotażowe w celu potwierdzenia dokładności. Podsumowując, podejście to zapewnia ustandaryzowaną metodę modelowania sepsy u noworodków u myszy, zapewniając jednocześnie zasoby do oceny dobrostanu zwierząt wykorzystywane do definiowania wczesnych humanitarnych punktów końcowych dla zwierząt z wyzwaniami.

Wprowadzenie

Sepsa jest główną przyczyną zgonów zakaźnych noworodków1. Ponieważ sepsa u noworodków jest słabo poznana, poczyniono niewielkie postępy zarówno w identyfikacji zagrożonych noworodków we wczesnym okresie choroby, jak i w opracowywaniu skutecznych metod leczenia lub profilaktyki. Wymaga to wykorzystania zwierzęcych modeli sepsy, aby lepiej zrozumieć ten proces i przetestować możliwe interwencje. Co więcej, dorosłe gryzonie różnie reagują na sepsę, ze statystycznie istotnymi różnicami w liczbie bakterii, które należy podać, aby uzyskać tę samą dawkę śmiertelną (LD) i różnicami w wynikającej z tego odpowiedzi gospodarza w porównaniu z noworodkami2. W związku z tym sepsa noworodkowa musi być badana u noworodków. W badaniach nad sepsą wykorzystano kilka modeli sepsy u dorosłych. Obejmują one prowokację dożylną z określonymi organizmami zaangażowanymi w sepsę u dorosłych ludzi lub podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP). CLP to endogenny model prowokacyjny, w którym jelito ślepe jest chirurgicznie izolowane, podwiązywane i nakłuwane, aby umożliwić wyciek treści jelitowej do otrzewnej, co ostatecznie prowadzi do ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się drobnoustrojów i ich produktów3. Jednak procedura chirurgiczna wymagana do ustalenia CLP jest śmiertelna dla nowonarodzonych zwierząt; w związku z tym konieczna jest alternatywna metoda, aby naśladować wielodrobnoustrojowe wyzwanie CLP w celu wywołania sepsy noworodków. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano model gnojowicy jelita ślepego dla posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków, w ramach którego zawartość jelita ślepego zwierząt jest zbierana, zawieszana w sterylnej dekstrozie 5% w wodzie (D5W) i wstrzykiwana dootrzewnowo nowonarodzonym myszom2. Od tego czasu stał się on coraz bardziej popularnym modelem do badania sepsy zarówno u nowonarodzonych, jak i dorosłych zwierząt i znacznie rozwinął mechanistyczny wgląd w proces choroby4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.

Biorąc pod uwagę coraz częstsze korzystanie z tego modelu i pragnienie badaczy do bezpośredniego porównywania wyników w różnych publikacjach, istnieje potrzeba dokładnego opisania i ujednolicenia aspektów technicznych we wszystkich badaniach. Standaryzacja dotyczy trzech aspektów modelu, a mianowicie: i) przygotowania gnojowicy jelita ślepego, ii) przygotowania podwielokrotności prowokacji do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym oraz iii) definicji humanitarnego punktu końcowego, zgodnie z którym zwierzęta uznaje się za nieocalałe w doświadczeniach prowokacyjnych. W szczególności metody przygotowania gnojowicy cecal są często przywoływane w oryginalnym artykule wprowadzającym model2. Krótkie podsumowanie tego modelu jest takie, że treść jelita ślepego od dorosłych myszy została pobrana, zawieszona w sterylnym D5W do stężenia 80 mg/ml i wykorzystana w ciągu 2 godzin do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym. Ten oryginalny model wykorzystywał myszy w tym samym wieku, pochodzące z tego samego miejsca dostawcy, które były trzymane w odpowiednich placówkach badawczych przez mniej niż 2 tygodnie przed pobraniem zawartości jelita ślepego. Wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, chociaż zmniejszyło koszty wynikające z regularnych dostaw od dostawców i pozwoliło na wykorzystanie nadmiaru myszy o szerszym zakresie płci i wieku, również znacznie zwiększyło zmienność między dawcami. To zmotywowało do opracowania alternatywnej techniki, w której zawartość jelita ślepego od wielu myszy została zebrana razem w celu przygotowania dużego bulionu, który następnie został podzielony na porcje i przechowywany w temperaturze -80 °C13. Ta alternatywna metoda została zaadaptowana przez wiele grup14,15. Adaptacja ta doprowadziła jednak do pewnych zmian technicznych, zarówno w zakresie stosowanych nośników pamięci (10% lub 15% glicerolu lub sam D5W), jak i strategii filtracji w celu usunięcia cząstek stałych (filtracja wielostopniowa przez filtr 860 μm, a następnie filtr 190 μm lub indywidualne filtracje przez filtry 100 μm lub 70 μm)13, 14,15. Wstrzyknięcie samego glicerolu może potencjalnie wyrządzić szkody, biorąc pod uwagę, że 25%-50% zastrzyków z glicerolu zostało wykorzystane jako model uszkodzenia nerek u gryzoni16,17,18,19,20. Aby uniknąć niezamierzonych skutków ubocznych glicerolu, preparat gnojowicy jelita ślepego dla myszy w tym badaniu zamraża się w D5W bez glicerolu i przeprowadza się testy żywotności bakterii podczas przechowywania w temperaturze -80 °C. Strategia filtracji zastosowana w tym badaniu to jedno przejście przez filtr 70 μm, który nie został bezpośrednio porównany z innymi wymienionymi strategiami filtracji.

Śmiertelne dawki wstrzykiwanej gnojowicy jelita ślepego mogą się różnić w zależności od placówki i powinny być dostosowane do pożądanej śmiertelności dla poszczególnych grup. Przy różnych dawkach prowokacyjnych, towarzyszące im objętości prowokacji zmieniają się w razie konieczności. Ten szczegół metodologiczny nie został jednak wcześniej zgłoszony. Co więcej, strategie standardowych procedur, takich jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, są rzadko omawiane w literaturze, ale poszczególne techniki mogą wpływać na to, czy nowonarodzone myszy przeciekają po wstrzyknięciu i wpływać na ich końcowe wyniki.

Dobrostan zwierząt, w tym definicja humanitarnego punktu końcowego, jest centralnym aspektem tego modelu i każdego modelu infekcji i stanu zapalnego u gryzoni21. W 1998 roku Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) opublikowała obszerne wytyczne dotyczące wyboru humanitarnego punktu końcowego, definiując humanitarny punkt końcowy jako "każdy rzeczywisty lub potencjalny ból, niepokój lub dyskomfort powinien być zminimalizowany lub złagodzony poprzez wybór najwcześniejszego punktu końcowego, który jest zgodny z naukowymi celami badania"22. Inni ostrzegają również, że humanitarne punkty końcowe muszą być ustalane w oparciu o uzasadnienie naukowe, a nie tylko subiektywną interpretację stanu zwierzęcia21. Chociaż istnieje wiele zasobów dotyczących klinicznych, behawioralnych i opartych na znakach kryteriów dotyczących humanitarnego punktu końcowego, nawet w kontekście infekcji i stanu zapalnego21,23,24, żadne z nich, w tym wytyczne CCAC dotyczące humanitarnego punktu końcowego22, wspomnij o nowonarodzonych myszach. W związku z tym obiektywnie i naukowo uzasadnione humanitarne punkty końcowe są znacznie trudniejsze do ustalenia dla nowonarodzonych zwierząt, biorąc pod uwagę zarówno ich ograniczone zdolności behawioralne, jak i brak dowodów na podstawie kryteriów takich jak utrata masy ciała, która jest powszechnie stosowana w przypadku dorosłych myszy. Obecnie kryteria humanitarnego punktu końcowego stosowane dla nowonarodzonych myszy w wieku od 5 do 12 dni w literaturze dotyczącej gnojowicy jelita ślepego odnoszą się do oryginalnego manuskryptu, który wprowadził model2. W niniejszej pracy pierwotnej definicja humanitarnego punktu końcowego dla nowonarodzonych zwierząt opierała się na dwóch kryteriach; Mianowicie, zaobserwowano, że położenie myszy poza gniazdem (rozproszenie) i brak plam mlecznych powodowały śmierć w ciągu kilku godzin. Kwestią komplikującą przypisanie humanitarnego punktu końcowego jest to, że plamy mleczne stają się trudne do zauważenia u szczepów myszy o ciemnej sierści, takich jak powszechnie stosowany szczep C57BL/6J, po pierwszym tygodniu życia, podczas gdy chore zwierzęta są monitorowane do 14. dnia życia (DOL). Co więcej, przy zastosowaniu tych kryteriów można znaleźć martwe zwierzęta po prowokacji (obserwacja własna; niepublikowana); W związku z tym konieczna jest bardziej rygorystyczna definicja humanitarnego punktu końcowego, aby złagodzić cierpienie zwierząt doświadczalnych i uniknąć śmiertelności w sytuacjach, w których wynik można było dokładnie określić wcześniej.

Wszystkie trzy aspekty metodologiczne modelu gnojowicy jelita ślepego są przedstawione w standardowej procedurze operacyjnej, szczegółowo opisującej przygotowanie gnojowicy jelita ślepego, metodę wstrzykiwania zwierząt doświadczalnych, która utrzymuje stałą objętość iniekcji między dawkami i zmniejsza ryzyko wycieków, oraz definicję humanitarnego punktu końcowego dla myszy w wieku od 7 do 12 dni w oparciu o system modelowania behawioralnego. Zebrano informacje behawioralne dotyczące wyników zdrowia myszy od ponad 240 zwierząt doświadczalnych i pogrupowano je według końcowego wyniku przeżycia, demonstrując opartą na dowodach definicję humanitarnego punktu końcowego. Cierpienie zwierząt doświadczalnych jest zmniejszane poprzez identyfikację konających noworodków myszy w najwcześniejszym możliwym punkcie czasowym, podczas gdy biologicznie istotne wyniki przeżycia można wywnioskować, obserwując kluczowe zmienne. Wizualna reprezentacja zarówno przygotowania gnojowicy jelita ślepego, jak i zachowań nowonarodzonych myszy będzie doskonałym źródłem informacji dla każdej grupy badającej sepsę lub nowonarodzonych zwierząt prowokacyjnych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbijskiego w Brytyjskiej Kolumbii zgodnie z protokołem numer A17-0110.

1. Sterylizacja narzędzi

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) włączyć i rozgrzać sterylizator koralikowy do 250 °C co najmniej 30 min przed użyciem.
  2. Zanurzyć narzędzia w 70% etanolu.
  3. Zanurzyć narzędzia w rozgrzanym sterylizatorze koralikowym na minimum 1 min.
    UWAGA: Uchwyty narzędzi nagrzeją się i mogą spowodować oparzenia, jeśli narzędzia pozostaną w sterylizatorze koralikowym dłużej niż 1,5 min.
  4. Spryskać warstwę ręczników papierowych 70% etanolem w celu ich sterylizacji.
  5. Wyjąć narzędzia ze sterylizatora koralikowego, dbając o to, aby sterylizowana część narzędzia nie dotykała niesterylnych uchwytów innych zanurzonych narzędzi, i położyć je na spryskanych etanolem ręcznikach papierowych.
  6. Odczekać od 30 s do 2 min, aż narzędzia ostygną przed przystąpieniem do sekcji.

2. Przygotowanie zawiesiny treści kątnicy

  1. Zważ wcześniej probówki wirówkowe 15 mL (jedna probówka na każdą grupę pięciu uśmiercanych myszy).
  2. Uśmierć myszy będące dawcami treści kątnicy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami lub zastosuj poniższy protokół.
    UWAGA: Do przygotowania zawiesiny z treści kątnicy użyto do 40 myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 12 tygodni, uśmiercając maksymalnie pięć myszy jednocześnie.
    1. Przenieś myszy do komory eutanazyjnej i ustaw aparat do znieczulenia izofluranem na 5% z perfuzją tlenu.
    2. Monitoruj myszy, aby zaobserwować utratę zdolności do poruszania się, wejście w chirurgiczną fazę znieczulenia, a ostatecznie zatrzymanie oddechu.
    3. Wyjmij mysz z komory eutanazyjnej, uciśnij jej łapę i sprawdź, czy występuje cofanie nogi lub wdech. Jeśli którykolwiek z tych objawów wystąpi, zwróć mysz do komory eutanazyjnej; w przeciwnym razie kontynuuj.
    4. Przeprowadź ostateczną eutanazję myszy poprzez szybką dyslokację szyjną.
  3. Wykonaj dysekcję kątnicy, używając wcześniej wysterylizowanych i schłodzonych narzędzi (patrz sekcja 1) w BSC.
    1. Przypnij nogi myszy do płyty z ekstrudowanego styropianu za pomocą igieł 23 G tak, aby mysz leżała brzuchem do góry. Unieruchom, a następnie spryskaj brzuch 70% etanolem.
    2. Używając sterylnej pęsety i nożyczek, przetnij skórę, oddziel nożyczkami skórę od wyściółki otrzewnej i wytnij prostokątny obszar od pachwin do mostka oraz od lewej do prawej strony. Usuń wszelką sierść z otrzewnej.
    3. Zmień narzędzia na nową sterylną parę, aby przeciąć otrzewną, tworząc otwór prostokątny w taki sam sposób, jak w przypadku skóry; wymień narzędzia, jeśli użyte wcześniej miały kontakt ze skórą.
    4. Zidentyfikuj kątnicę, która powinna przebiegać od lewej do prawej strony ciała. Przeciąć tkankę łączną, aby oddzielić odgałęzienia kątnicy od jelit, a następnie odetnij kątnicę od jelit. Umieść kątnicę na wysterylizowanej kartce papieru ważkiego.
      UWAGA: Papier ważki można wysterylizować, spryskując go 70% etanolem z obu stron i pozostawiając do wyschnięcia lub poprzez naświetlanie UV. Alternatywnie dysekcję kątnicy można przeprowadzić na sterylnym szalce Petriego.
  4. Wydobywanie treści kątnicy
    1. W BSC, używając sterylnych narzędzi, przetnij oba końce kątnicy.
    2. Przytrzymaj środek kątnicy sterylną pęsetą i za pomocą płaskiej sterylnej metalowej szpatułki delikatnie wypchnij treść kątnicy przez przecięte końce, wykonując ruch obrotowy i unikając drapania, które mogłoby przerwać nabłonek. Zbierz treść i umieść ją w wcześniej zważonej probówce wirówkowej 15 mL.
    3. Połącz treści kątnic z maksymalnie pięciu myszy w jednej probówce. Ponownie zważ probówkę po dodaniu całej treści.
      UWAGA: Średnia ilość zawiesiny z kątnicy na mysz wynosi 300 mg, maksymalnie do 390 mg, co wymaga 1,8 do 2,4 mL D5W na mysz do resuspensji; w związku z tym użycie więcej niż pięciu myszy na tym etapie może doprowadzić do przepełnienia probówki wirówkowej 15 mL.
    4. Wyczyść narzędzia ręcznikiem papierowym spryskanym etanolem i wysterylizuj je ponownie, powtarzając kroki 1.2-1.6.
  5. Filtracja zawiesiny z treści kątnicy
    1. Zważ probówkę wirówkową wypełnioną treścią kątnicy i oblicz ilość D5W do dodania, dzieląc masę treści kątnicy przez pożądaną stężenie roztworu w miligramach na mililitr, zgodnie z poniższym wzorem.
      Wzór na obliczenie objętości D5W dla stężenia treści kątnicy; analiza równania.
    2. W BSC dodaj wymaganą ilość lodowatego D5W do probówki wirówkowej 15 mL zawierającej treść kątnicy.
    3. Mieszaj probówkę wirówkową 15 mL na vortexie w pionie i poziomie przez 30 s. Sprawdź, czy obecne są cząstki o średnicy powyżej 1-3 mm; jeśli tak, kontynuuj mieszanie na vortexie, aż wszystkie duże cząstki widocznie znikną.
    4. Umieść sterylne sito komórkowe 70 µm w probówce wirówkowej 50 mL umieszczonej w lodzie. Pipetuj 4 mL resuspendowanej zawiesiny z kątnicy do sita komórkowego, a następnie do probówki zbiorczej. Resuspenduj cząstki, pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Delikatnie usuwaj pęcherzyki powietrza, aby zwiększyć prędkość filtrowania, mieszając zawartość końcówką pipety, dopóki nie przestaną przefiltrowywać się krople.
      UWAGA: Podczas mieszania mogą pojawić się cząstki na tyle duże, by zapchać pipetę 5 mL. W takim przypadku powtórz mieszanie na vortexie z kroku 2.5.3, a jeśli roztwór nadal nie ulegnie rozbiciu, użyj pipety, aby docisnąć cząstkę do ścianki probówki wirówkowej.
    5. Powtórz krok 2.5.4, zmieniając sita komórkowe pomiędzy każdą probówką zawiesiny, i połącz całą zawartość w jednej probówce zbiorczej 50 mL trzymanej w lodzie lub w drugiej probówce wirówkowej 50 mL, jeśli objętość filtratu przekroczy poziom lodu w pojemniku.
  6. Aliquotowanie zawiesiny z treści kątnicy.
    1. Jeśli dotyczy, połącz kilka probówek z filtrowaną zawiesiną z kątnicy z kroku 2.5.5 w większym sterylnym pojemniku (np. butelce do przechowywania 1 000 mL). Następnie mieszaj na vortexie przez 15 s i przelej 20 mL do nowej probówki wirówkowej 50 mL.
    2. Mieszaj roztwór zapasowy zawiesiny z kątnicy w probówce wirówkowej 50 mL na vortexie przez 5-10 s i odmień aliquoty po 500 µL do trzech krio probówek 2 mL z gumową uszczelką, aby zapobiec parowaniu w czasie. Natychmiast umieść roztwór zapasowy i aliquoty w lodzie.
    3. Powtarzaj kroki 2.6.1 i 2.6.2, aż cała zawiesina zostanie podzielona na aliquoty, mieszając roztwór zapasowy na vortexie po każdych trzech krio probówkach, aby zapobiec sedymentacji cząstek i utrzymać jednorodność mieszaniny.
    4. Zamroź aliquoty zawiesiny z treści kątnicy w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Z każdej dorosłej myszy można uzyskać od trzech do czterech fiolek zapasowych po 500 µL. Każda fiolka powinna być wystarczająca do podania jednej miotowi ośmiu myszy w DOL 7.

3. Wywoływanie sepsy u 7-dniowych myszy noworodkowych

  1. Oddziel, zidentyfikuj i zważ myszy noworodki.
    1. W komorze BSC przenieś myszy noworodki do nowej klatki, aby odizolować je od matki i zredukować stres u samicy.
    2. Wyjmij i potrzyj w rękawiczkach część materiału gniazdowego, aby przenieść zapach klatki na rękawiczki. Następnie uformuj materiał gniazdowy w mniejsze gniazdo i umieść go w nowej klatce bez matki.
    3. Przenieś myszy noworodki do materiału gniazdowego w nowej klatce.
    4. Przenieś więcej materiału gniazdowego, aby stworzyć drugie, puste gniazdo w nowej klatce.
    5. Zamknij klatkę matki i wyjmij ją z komory, aby samica nie odczuwała stresu wywołanego słyszeniem odgłosów niepokoju myszy noworodków.
    6. Aby śledzić poszczególne myszy noworodki w miocie w czasie, użyj markera odpornego na etanol, aby nanieść od jednej do pięciu kropek na przedniej lub tylnej części ogona, powtarzając czynność co 12-24 h w razie potrzeby.
    7. Zważ każdą mysz, która zostanie poddana procedurze, umieszczając każdą z nich w drugim gnieździe po zważeniu; powtórz to dla wszystkich myszy.
    8. Zwróć cały miot do matki przed przygotowaniem alikwoty zawiesiny treści kąkoliczki do podania.
  2. Oblicz indywidualne dawki zawiesiny treści kąkoliczki dostosowane do masy ciała oraz wymagane rozcieńczenie w D5W, wykonując ten krok oddzielnie dla każdego miotu, korzystając z poniższych obliczeń lub dołączonego arkusza kalkulacyjnego (patrz Supplemental File).
    1. Oblicz liczbę miligramów zawiesiny treści kąkoliczki (a), które należy podać każdej myszy, mnożąc masę myszy w gramach (b) przez pożądaną dawkę w miligramach zawiesiny treści kąkoliczki na gram masy myszy (c).
      Wzór mnożenia a=b×c; przydatny w obliczeniach matematycznych i studiach nad algebrą.
    2. Oblicz indywidualną objętość nierozcieńczonego roztworu treści kąkoliczki wymaganą dla każdej myszy w mikrolitrach (d), dzieląc liczbę miligramów zawiesiny treści kąkoliczki potrzebnej dla jednej myszy z kroku 3.2.1 (a) przez stężenie roztworu treści kąkoliczki, 160 mg zawiesiny treści kąkoliczki na mililitr D5W (e), i mnożąc przez 1,000 µL na mililitr, aby przeliczyć mililitry na mikrolitry.
      Równanie obliczania stężenia, wzór: d=a÷e×1,000μL na mL, odnosi się do badań nad rozcieńczaniem.
    3. Oblicz średnią objętość roztworu treści kąkoliczki wymaganą dla myszy (g), sumując objętość roztworu treści kąkoliczki (d) dla każdej myszy w miocie liczącym n myszy, a następnie dzieląc wynik przez liczbę myszy (n).
      g=sum(di→n)÷n; Statystyczny wzór na średnią; Schemat edukacyjny; Koncepcja analizy danych.
    4. Oblicz średni współczynnik rozcieńczenia roztworu treści kąkoliczki (h), dzieląc średnią objętość iniekcji (100 µL) przez średnią objętość roztworu treści kąkoliczki wymaganą dla myszy (g).
      Równanie równowagi statycznej, \( h = 100 \mu L \div g \), analiza wzoru w obliczeniach fizycznych.
    5. Oblicz specyficzną objętość iniekcji dla każdej myszy w mikrolitrach (j), mnożąc wymaganą dla danej myszy objętość roztworu treści kąkoliczki (d) przez średni współczynnik rozcieńczenia (h>), a następnie zaokrąglij wynik do najbliższej dziesiątki (aby dopasować go do 10 µL skoków strzykawki iniekcyjnej).
      Równanie równowagi statycznej j=d×h, reprezentacja symboliczna, edukacyjny wzór matematyczny.
    6. Oblicz średnią wymaganą objętość D5W do rozcieńczenia roztworu treści kąkoliczki (k), odejmując średnią objętość roztworu treści kąkoliczki (g) od średniej objętości iniekcji (100 µL).
      Równanie w obliczeniach objętości, k=100μL−g, równowaga statyczna, reprezentacja wzoru.
    7. Oblicz całkowitą ilość roztworu treści kąkoliczki w mikrolitrach (l), mnożąc średnią objętość roztworu treści kąkoliczki na mysz w mikrolitrach (g) przez liczbę myszy w tym miocie (n) i mnożąc przez 1,4, aby uzyskać zapas.
      Równanie równowagi statycznej l=g×n×1.4, istotne dla studiów nad analizą mechaniczną.
    8. Oblicz całkowitą ilość D5W w mikrolitrach (m) wymaganą do rozcieńczenia roztworu treści kąkoliczki, mnożąc średnią wymaganą objętość D5W (k) przez liczbę myszy (n) i mnożąc przez 1,4, aby uzyskać zapas.
      Wzór m=k×n×1.4, obliczenia matematyczne, odnośnik edukacyjny.
  3. Przygotuj alikwotę do podania po obliczeniu wymaganej ilości roztworu treści kąkoliczki (l z kroku 3.2.7). W komorze BSC rozmroź wymaganą liczbę fiolek z roztworem treści kąkoliczki w temperaturze pokojowej, pipetując zawartość w celu wymieszania.
    1. Gdy w rozmrożonej zawiesinie treści kąkoliczki nie będzie już widocznych kryształków lodu, przenieś obliczoną ilość roztworu treści kąkoliczki (l z kroku 3.2.7) do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL.
    2. Rozcieńcz do wymaganego stężenia, dodając lodowate D5W zgodnie z obliczeniami w kroku 3.2.8 (m). Przechowuj alikwotę w lodzie.
    3. Przed napełnieniem strzykawki wymieszaj zawartość probówki, potrząsając nią 20 razy, a następnie 3 razy pobierz i wypuść 300-500 µL zawiesiny treści kąkoliczki za pomocą strzykawki insulinowej 500 cc 28 G o długości ½ cala.
    4. Pobierz do tej samej strzykawki około 150 µL rozcieńczonej zawiesiny treści kąkoliczki.
    5. Opukaj strzykawkę, aby odsunąć pęcherzyki powietrza od tłoka, lekko cofnij tłok, a następnie wypuść pęcherzyki.
    6. Odprowadź nadmiar zawiesiny treści kąkoliczki z powrotem do probówki, aż w strzykawce znajdzie się prawidłowa ilość zawiesiny dla jednej myszy, obliczona dla poszczególnych myszy w kroku 3.2.5 (j).
  4. Wykonaj iniekcję domięśniową zawiesiny treści kąkoliczki zgodnie z odpowiednimi lokalnymi wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami lub postępuj zgodnie z poniższymi krokami.
    1. W komorze BSC oddziel myszy noworodki od matki, jak opisano w kroku 3.1.
    2. Uchwyć mysz za kark, używając kciuka i palca wskazującego.
    3. Zabezpiecz ogon myszy na grzbiecie palca środkowego i serdecznego lub na przedniej części palca serdecznego i małego.
    4. Aby zminimalizować wycieki, przechyl mysz noworodka tak, aby była skierowana przodem w dół, i wprowadź igłę ściętym końcem do góry, między nogę a narządy płciowe, prowadząc igłę płytko i podskórnie.
    5. Po wprowadzeniu igły na głębokość 1 cm, naciśnij w dół i do przodu, aby poczuć przebicie otrzewnej. Powoli wciśnij tłok, utrzymując końcówkę igły tak stabilnie, jak to możliwe, ponieważ ruchy boczne mogłyby uszkodzić organy myszy.
    6. Ostrożnie wyjmij igłę w ciągu 5-10 s, prowadząc ją tą samą drogą, którą została wprowadzona; podczas wyjmowania rozluźnij palec środkowy, aby zmniejszyć napięcie w ciele myszy.
    7. Aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, przytrzymaj mysz przez kilka sekund po wyjęciu igły, aby dać czas na zamknięcie miejsca iniekcji, i zaobserwuj, czy nie występuje wyciek lub uwypuklenie w miejscu wstrzyknięcia; w takim przypadku mysz nie powinna być uwzględniana w analizie.
      UWAGA: Uwypuklenie skóry w miejscu iniekcji świadczy o niepowodzeniu iniekcji otrzewnowej i podaniu preparatu podskórnie.
    8. Połóż mysz na ręczniku papierowym i poczekaj, aż zrobi krok. Jeśli mysz pozostaje nieruchoma przez 5 s, lekko naciśnij jej ogon.
    9. Podnieś mysz i sprawdź, czy w miejscu iniekcji nie występuje wyciek zawiesiny treści kąkoliczki. W przypadku wycieku wyklucz mysz z analizy i poddaj ją eutanazji.

4. Monitorowanie myszy

  1. Regularnie monitoruj myszy, aby sprawdzić, czy nie osiągnęły humanitarnego punktu końcowego.
    1. Obserwuj myszy 2 h po zakażeniu w celu wykrycia ewentualnych powikłań związanych z iniekcją.
    2. Monitoruj myszy 12 h po zakażeniu pod kątem zachorowalności związanej z sepsą oraz w celu zidentyfikowania myszy, które osiągnęły humanitarny punkt końcowy (kryteria opisano w krokach 4.2-4.3).
    3. Następnie monitoruj je co 4-6 h przez pierwsze 2 dni, z wyjątkiem 8-godzinnej przerwy nocnej, kiedy noworodki nie są nadzorowane.
    4. Po upływie 2 dni od zakażenia monitoruj myszy 1-2 razy dziennie. Jeśli zaobserwowane zostaną chore myszy lub takie, których ocena stanu zdrowia spada, zwiększ częstotliwość monitorowania do raz na 4-6 h.
  2. Monitorowanie noworodków myszy
    1. Przy każdej procedurze z udziałem noworodków myszy przenieś ściółkę do nowej klatki zgodnie z opisem w kroku 3.1 (z tych samych powodów, które tam wskazano). Uważnie sprawdź, czy żadne noworodki nie zostały wyciągnięte z gniazda podczas ssania. Myszy wyciągnięte z lęgu podczas ssania nie powinny być uznane za myszy rozproszone.
    2. Podczas usuwania górnej części gniazda zidentyfikuj wszelkie rozproszenia noworodków, zarówno z dala od gniazda, jak i zaplątanych w materiale gniazdowym w oddaleniu od reszty lęgu, z wyjątkiem myszy wyciągniętych z lęgu podczas ssania. W przypadku znalezienia myszy rozproszonej należy odnieść się do kryteriów humanitarnego punktu końcowego w kroku 4.5.
  3. Zmierz odruchy prostowania i mobilność myszy.
    1. Połóż mysz na plecach na ręczniku papierowym i monitoruj jej zdolność do obrócenia się na brzuch w maksymalnym czasie 4 s. Po położeniu myszy na plecach upadnie ona na lewy lub prawy bok – w tym momencie rozpoczyna się odliczanie 4 s.
      UWAGA: Aby została zaklasyfikowana do grupy „Rights” (prostuje się), mysz musi być w stanie oprzeć co najmniej trzy z czterech opuszek łap o ręcznik papierowy przez 1 s. Mysz nadal jest uznawana za zdolną do obrócenia się, nawet jeśli ponownie upadnie.
      1. Jeśli mysz potrafi się obrócić, odczekaj 8 s, aby ocenić jej poziom mobilności.
      2. Zaklasyfikuj mysz jako „Rights-Mobile” (prostuje się-mobilna), jeśli potrafi się obrócić i bada otoczenie, wykonując kilka kroków pod rząd.
      3. Zaklasyfikuj mysz jako „Rights-Lethargic” (prostuje się-letargiczna), jeśli potrafi się obrócić i wykonuje kilka kroków, by zbadać otoczenie. Myszy z tej grupy mogą upaść podczas kroku, wydawać się niestabilnymi na nogach i robić przerwy między krokami.
      4. Zaklasyfikuj mysz jako „Rights-Nonmobile” (prostuje się-niemobilna), jeśli potrafi się obrócić, ale nie wykazuje znacznej aktywności ruchowej. Mysz może nadal upadać; jeśli nie wykona żadnego kroku w ciągu 8 s, zostaje zaklasyfikowana jako Rights-Nonmobile.
    2. Jeśli mysz nie potrafiła się obrócić, oceń jej mobilność na podstawie zaobserwowanego ruchu bioder.
      UWAGA: Unikaj powtarzania monitorowania lub wydłużania czasu przebywania myszy na plecach, ponieważ może to wpłynąć na system punktacji i humanitarny punkt końcowy, gdyż mysz, która nie obróciła się w ciągu 4 s, czasem potrafi to zrobić, jeśli otrzyma więcej czasu.
      1. Zaklasyfikuj mysz jako „Fail to right (FTR)-Mobile” (brak obrócenia-mobilna), jeśli nie potrafi się obrócić i wykazuje ruch bioder przekraczający kąt 90° względem poziomu. Niektóre myszy mogą się obrócić po upływie więcej niż 4 s, ale nadal powinny być klasyfikowane jako FTR, z oceną mobilności na podstawie ruchu bioder.
      2. Zaklasyfikuj mysz jako „FTR-Lethargic” (brak obrócenia-letargiczna), jeśli nie potrafi się obrócić i wykazuje ruch bioder poniżej kąta 90° względem poziomu.
      3. Zaklasyfikuj mysz jako „FTR-Nonmobile” (brak obrócenia-niemobilna), jeśli nie potrafi się obrócić, a jej nogi drżą lub wibrują, lecz brak jest ruchu bioder. Kończyny mogą się prostować lub zginać, ale nie wykazują ruchu bocznego. Mysz jest wyraźnie chora i osiągnęła humanitarny punkt końcowy.
  4. Powtórz krok 4.3 po drugiej stronie myszy, zapisując wyniki dla obu stron.
    UWAGA: Sposób zapisywania obserwacji znajduje się w pliku uzupełniającym (Supplementary File).
  5. Ustal, czy mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy i wymaga eutanazji zgodnie z Tabelą 1 oraz opisem poniżej.
    1. Zaklasyfikuj myszy do różnych poziomów odruchu prostowania i mobilności na podstawie obserwacji z kroków 4.3 i 4.4. Mobilność myszy jest mierzona dla każdej strony, a zachowanie mobilne służy do ustalenia, czy mysz wymaga eutanazji.
    2. Uznaj za osiągające humanitarny punkt końcowy wszystkie myszy z odruchem prostowania (a) FTR-Nonmobile lub (b) FTR-Lethargic, które zostały znalezione poza gniazdem.
    3. W punktach czasowych monitorowania powyżej 20 h po zakażeniu, zaklasyfikuj każdą mysz z odruchem „brak obrócenia” (fail to right) po obu stronach jako osiągającą humanitarny punkt końcowy, ponieważ zgromadzone dane z wysoką dokładnością przewidują, że myszy te ostatecznie ulegną chorobie i nie wyzdrowieją.
  6. Oddziel myszy przeznaczone do eutanazji, zgodnie z ustaleniami z kroku 4.5. Jeśli monitorowana mysz nie jest uznana za osiągającą humanitarny punkt końcowy, umieść ją w drugim pustym gnieździe w nowej klatce bez samicy i kontynuuj pracę z pozostałymi noworodkami.
  7. Po zmonitorowaniu całego lęgu przenieś połowę materiału gniazdowego do klatki z samicą, formując gniazdo z wolnym miejscem w środku dla noworodków.
    UWAGA: Niewłaściwie uformowane gniazdo może spowodować rozproszenie myszy i ograniczyć opiekę, jaką może zapewnić samica.
  8. Przenieś noworodki z powrotem do klatki z samicą.
  9. Przykryj lęg w gnieździe, kładąc pozostały materiał gniazdowy na wierzchu i delikatnie dociskając go przy pokrywie, aby utrwalić materiał na miejscu.
  10. Wykonaj eutanazję noworodków oddzielonych w kroku 4.6 zgodnie z wymogami lokalnej instytucji.

5. Miareczkowanie zawiesiny treści ślepej

  1. Zainfekuj myszy wybraną dawką zakaźną (sekcja 3) i monitoruj wyniki (sekcja 4).
  2. Sprawdź, czy końcowy wynik odpowiada pożądanemu LD; jeśli nie, powtórz sekcje 3 i 4 z nowym miotem, stosując wyższą lub niższą dawkę zakaźną, korygując ją o 5%-10%.
    UWAGA: Dawki zakaźne mogą być zbliżone do tych przedstawionych na Rysunku 1B, jednak muszą zostać miareczkowane w każdej placówce i dla każdego szczepu myszy.
  3. Obserwuj również, czy myszy osiągają humanitarny punkt końcowy szybciej lub wolniej niż wynika to z oczekiwanej kinetyki na Rysunku 1B, a następnie powtórz sekcje 3 i 4 z nowym miotem, stosując wyższą lub niższą dawkę zakaźną, korygując ją o 5%-10%.

Wyniki

Żywotność zawiesiny treści kątniczej przechowywanej w -80 °C można badać w czasie poprzez seryjne rozcieńczanie i wysiewanie aliquotów zapasu zawiesiny treści kątniczej na agar sojowy z tryptonem z 5% krwią owczą, a następnie inkubację tlenową przez 24 h w 37 °C. Stwierdzono, że późniejsze przeliczanie liczby colony-forming unit (CFU) w preparacie zawiesiny treści kątniczej nie zmieniało się w okresie 6 miesięcy, a na żywotność nie wpłynęło przedłużone przechowywanie w -80 °C (Rycina 2). Każda mysz dawca dostarczyła średnio wystarczającej ilości zawiesiny treści kątniczej do zakażenia trzech do czterech miotów (dane nie pokazano).

Myszy, u których w 7. dniu życia (DOL 7) wywołano sepsę polimikrobową poprzez podanie zawiesiny treści kąkoliczki, zaczęły osiągać punkt końcowy etyczny w ciągu 12 h od podania czynnika, a sepsa polimikrobowa została w większości opanowana do 48 h po podaniu, co zaobserwowano na krzywej przeżycia Kaplana-Meiera opracowanej na podstawie danych od ponad 200 myszy (Rysunek 1A). Śmiertelność była zależna od podanej dawki czynnika, przy czym zmiana dawki o 5% skutkowała różnicą w przeżywalności wynoszącą około 15% (Rysunek 1B). Masę ciała myszy mierzono podczas każdej wizyty kontrolnej. Spadek masy ciała zaobserwowano u wszystkich zwierząt, przy czym w ciągu pierwszych 24 h po podaniu czynnika nie różnił się on między myszami, które ostatecznie przeżyły, a tymi, które nie przeżyły (Rysunek 1C). Po 24 h większość przeżywających zwierząt zaczęła odzyskiwać masę ciała, podczas gdy wszystkie zwierzęta, które nie przeżyły, nadal traciły na wadze i osiągały punkt końcowy etyczny. Jednak niewielka część przeżywających zwierząt, które zachowały odruch prostowania, również nadal traciła masę ciała lub nie zwiększała jej aż do końca eksperymentu, tracąc nawet do 20% początkowej masy ciała w ciągu 40 h od podania czynnika. Ze względu na nakładanie się spadku masy ciała u myszy, które przeżyły i tych, które nie przeżyły, zmiana masy ciała lub próg utraty wagi nie mogły zostać wykorzystane jako kryterium punktu końcowego etycznego, przy jednoczesnym zachowaniu celu dokładnego oddzielenia osobników przeżywających od nieprzeżywających.

Zachowanie myszy monitorowano zgodnie z protokołem oraz zgodnie z Tabelą 2. Przedstawiono migawki kategorii stanu zdrowia (Rycina 3A-C). Zdjęcia te ukazują różne kategorie stanu zdrowia myszy, którym nie udało się obrócić na brzuch po ułożeniu ich na grzbiecie, i wskazują różnicę między FTR-Mobile a FTR-Lethargic, co stanowi istotne rozróżnienie. Zdrowe myszy w tym wieku, niewrażone na czynnik wyzwalający, nie wykazują aktywności FTR-Lethargic; zatem kategoria ta jest markerem choroby i odpowiedzią na wyzwanie. Chore myszy wykazywały objawy FTR-Lethargic (Rycina 3B) i mogły regrować w stronę FTR-Nonmobile (Rycina 3C), gdzie górna noga pozostaje równolegle do dolnej nogi, przy minimalnym lub zerowym ruchu kołysania biodrem, co jest jednym z kryteriów humanitarnego punktu końcowego. Myszy mogły również dojść do regeneracji, zwiększając ruchomość bioder i przechodząc w stan FTR-Mobile (Rycina 3A). Wyniki odruchu prostowania i mobilności określano dla lewej i prawej strony każdej myszy, a najwyższy wynik wykorzystywano do ustalenia, czy mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy. Informacje behawioralne zebrano od ponad 240 zwierząt poddanych działaniu dawki letalnej 60 (LD60) zawiesiny treści ślepej kiszki i zaobserwowano 144 humanitarne punkty końcowe (Rycina 3D-F oraz Tabela 1). To podejście oparte na dowodach zostało wykorzystane do zdefiniowania i doprecyzowania humanitarnego punktu końcowego w czterech stadiach choroby, skategoryzowanych przez eksperymentatorów na podstawie zarówno różnic behawioralnych między osobnikami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, jak i ułamka osiągniętych humanitarnych punktów końcowych w każdym przedziale czasowym. Podczas wczesnych eksperymentów myszy FTR-Nonmobile, które nie wykazywały ruchu bioder, były konsekwentnie znajdowane martwe w ciągu 4-6 h od zaobserwowania tego zachowania. W zbiorze przedstawionych informacji wynik zdrowotny FTR-Nonmobile został użyty jako kryterium humanitarnego punktu końcowego. Od 12 do 21 h po wyzwaniu, podczas gdy myszy FTR-Nonmobile były uśmiercane, zarówno zwierzęta przeżywające, jak i nieprzeżywające wykazywały bardzo podobne wzorce behawioralne i nie można ich było rozróżnić w żaden inny sposób (Rycina 3D). Od 21 do 48 h po wyzwaniu większość przeżywających myszy odzyskała odruch prostowania, podczas gdy mniej niż 1% zaobserwowanych zachowań FTR występowało u zwierząt, które ostatecznie przeżyły eksperyment (Rycina 3E). Zatem myszy, którym nie udało się obrócić na brzuch z obu stron, stały się dodatkowym kryterium humanitarnego punktu końcowego w tym czasie. Między 12 a 20 h po wyzwaniu zaobserwowano 12,5% całkowitej liczby humanitarnych punktów końcowych, w porównaniu do 80,5% między 20 a 48 h oraz 7% po 48 h (Tabela 1). Cechą wyróżniającą myszy, które ostatecznie przeżyły, od tych, których stan pogorszył się do poziomu humanitarnego punktu końcowego, była utrata odruchu prostowania, niezależnie od mobilności bioder (Rycina 3F). Rzeczywiście, między 20 a 48 h po wyzwaniu łącznie 121 myszy nie zdołało obrócić się na brzuch z obu stron, z czego 116 z tych myszy ostatecznie osiągnęło humanitarny punkt końcowy (co stanowi 96% dokładności w identyfikacji myszy, które nie wyzdrowieją). Po 48 h od wyzwania zaobserwowano 11 myszy, którym nie udało się obrócić z obu stron, z czego 10 osiągnęło humanitarny punkt końcowy (dokładność 91%). Po 20 h od wyzwania liczba myszy, które utraciły odruch prostowania z obu stron, pozwala przewidzieć ostateczny wynik z dokładnością powyżej 90%; dlatego kryterium to dodano do kryteriów humanitarnego punktu końcowego, aby wcześniej identyfikować myszy niezdolne do regeneracji i zmniejszyć ich cierpienie (Tabela 1).

Częstotliwość monitorowania myszy zmienia się w czasie ze względu na różny wskaźnik śmiertelności po zakażeniu, co przedstawiono w Tabeli 1. Uznawano, że mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy w dowolnym momencie, jeśli nie była w stanie samodzielnie przyjąć pozycji wyprostowanej i wykazywała brak ruchomości bioder po obu stronach, lub jeśli mysz została znaleziona poza gniazdem, nie była w stanie samodzielnie przyjąć pozycji wyprostowanej i wykazywała letargiczne ruchy bioder. Przewidywano, że myszy w każdym z tych stanów nie będą w stanie ponownie dołączyć do miotu, a obserwacje wykazały, że w ciągu 4-6 h dochodzi u nich do stanu FTR-Nonmobile. Począwszy od 20 h po zakażeniu, dodano nowy humanitarny punkt końcowy, ponieważ przedstawione informacje wskazują, że zdecydowana większość myszy, u których występuje FTR po obu stronach, ostatecznie ulega chorobie.

Filmy, tabele i materiały przedstawione w niniejszym manuskrypcie stanowią efekywny zasób dydaktyczny w zakresie poprawnego przypisywania zachowań myszom poddanym badaniu. Siedmiu eksperymentatorów poproszono o obejrzenie filmu instruktażowego oraz zapoznanie się z protokołem i tabelami przed przypisaniem zachowań 60 zwierzętom poddanym badaniu. Identyfikacja kryteriów humanitarnego punktu końcowego była dokładna zarówno w rozróżnianiu myszy FTR-Nonmobile od myszy wykazujących inne zachowania (Rycina 4A), jak i myszy FTR od myszy zdolnych do samodzielnego obrócenia się w dopuszczalnym czasie (Rycina 4B).

Wykresy analizy przeżywalności i zmiany masy ciała; krzywe Kaplana-Meiera, czas po wyzwaniu, prawdopodobieństwo przeżycia.
Rysunek 1: Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera, miareczkowanie dawki zawiesiny treści kąkreczkowej oraz zmiana masy ciała po wyzwaniu zawiesiną treści kąkreczkowej. (A) Wynik przeżywalności noworodków myszy C57BL/6J po dostarczeniu wewnątrzbrzusznym zawiesiny treści kąkreczkowej w 7. dniu życia (DOL 7). Dane dla tego rysunku zostały połączone z niezależnych eksperymentów z zastosowaniem wielu dawek wyzwalających, z których w zakresie od 0,7 do 1,3 mg zawiesiny treści kąkreczkowej na gram masy ciała podano tym myszom. (B) Noworodki myszy poddane wyzwaniu dawką od 0,80 do 0,95 mg zawiesiny treści kąkreczkowej na gram masy ciała z jednej partii preparatu wykazują zależność dawka-odpowiedź między ilością podanej zawiesiny treści kąkreczkowej a procentem przeżycia.(C) Procentowa zmiana masy ciała w porównaniu do masy w momencie wyzwania, gdzie linia przerywana oznacza utratę 20% masy ciała od momentu wyzwania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres rozrzutu z linią regresji przedstawiający wiek względem Log10 CFU na mL; R²=-0,02374, p=0,523.
Rysunek 2: Stężenie CFU w zapasie zawiesiny treści kąkrecznicy przechowywanej w -80 °C nie zmienia się w okresie 6 miesięcy. Wpływ czasu przechowywania zawiesiny treści kąkrecznicy na stężenie CFU badano za pomocą regresji liniowej. Każdy punkt reprezentuje jedną alikwotę tej samej partii preparatu zawiesiny treści kąkrecznicy, poddanej rozcieńczeniom seryjnym i wysianej w okresie 6 miesięcy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie zachowania myszy z wykresami przedstawiającymi przeżywalność po wyzwaniu; wyniki analizy behawioralnej.
Rysunek 3: Kategorie ruchomości bioder myszy, które nie potrafią się wyprostować, oraz zachowania zwierząt w różnych odstępach czasu po wyzwaniu. Myszy poddane wyzwaniu sepsą, po położeniu na plecach, wykazują oznaki zachorowania, które można mierzyć stopniem ruchu bioder. (A) Myszy z brakiem odruchu prostowania (FTR)-Mobilne wykazują ruch kołyszący bioder górnej kończyny przekraczający kąt 90° względem poziomu. (B) Myszy FTR-Letargiczne wykazują ruch kołyszący bioder, ale w żadnym momencie podczas 4 s monitorowania nie przekraczają kąta 90° względem poziomu. (C) Niektóre myszy FTR-Niemobilne będą prostować nogę, zginając ją w kolanie, ale wykażą bardzo niewielki (kąty mniejsze niż 10°) lub żaden ruch kołyszący bioder, a nogi pozostaną do siebie równoległe. (D) Zachowania zwierząt 12–21 h po wyzwaniu pokazują, że tylko zachowania FTR-Niemobilne odróżniają osobników przeżywających od nieprzeżywających. (E) Od 21 do 48 h po wyzwaniu tylko 4 z 592 obserwowanych zachowań FTR (0,67%) należą do osobników przeżywających, co pozwala odruchowi prostowania przewidywać ostateczny wynik i służyć jako nowe kryterium humanitarnego punktu końcowego. (F) Po 48 h od zakażenia 6 z 131 myszy (4,55%), które posiadały odruch prostowania, przeszło do grupy FTR i zostało uśpionych do końca eksperymentu, co uzasadnia prowadzenie ciągłego monitorowania w całym okresie rekonwalescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Klasyfikacja odruchu prostowania szczeniąt; wykres słupkowy prawdziwych/fałszywych wyników pozytywnych/negatywnych według eksperymentatorów.
Rycina 4: Materiały instruktażowe pozwalają na dokładną klasyfikację behawioralną przez niezależnych eksperymentatorów. Eksperymentatorzy przeszkoleni poprzez oglądanie filmu towarzyszącego temu protokołowi sklasyfikowali filmy z 60 noworodków myszy do różnych grup zdrowotnych. (A) Określono zdolność do rozróżnienia humanitarnego punktu końcowego; średnio 97% zachowań zostało prawidłowo zakwalifikowanych jako FTR-Nonmobile lub nie, podczas gdy tylko 1% myszy FTR-Nonmobile zostało błędnie zidentyfikowanych. Dwa procent myszy błędnie zidentyfikowano jako FTR-Nonmobile. (B) Identyfikacja drugiego kryterium humanitarnego punktu końcowego, polegająca na prawidłowym rozróżnieniu między myszami FTR a tymi, które mają zdolność do prostowania się w ciągu 4 s od położenia na plecach, została przypisana prawidłowo w 97% ocen, podczas gdy tylko 0,96% myszy błędnie przypisano do grupy prostujących się, a 2% myszy błędnie przypisano do grupy FTR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stadium chorobyA: Wysoka zapadalność, brak śmiertelnościB: Wysoka zapadalność, niska śmiertelnośćC: wysoka zapadalność, wysoka śmiertelnośćD: niska zachorowalność, niska śmiertelność
Godziny po ekspozycji na patogen0−1212−2020−48>48
Częstotliwość monitorowania2 h po wyzwaniuco 4–6 hCo 4–6 h, co 8 h, bez nadzoru przez noc1–2 razy dziennie, w razie potrzeby częściej
Udział całkowitej liczby obserwowanych punktów końcowych humanitarnych 0/14418/144116/14410/144
Procent zaobserwowanych punktów końcowych z przyczyn humanitarnych0%12.5%80.5%7%
Kryteria humanitarnego punktu końcowego1. FTR-Nieruchomy po obu stronach1. FTR-Nieruchomy po obu stronach
2. Rozproszone z gniazda i wykazują letarg (FTR−Lethargic)2. Rozproszenie z gniazda oraz stan FTR−letargiczny
3. FTR po stronie lewej lub prawej (z dowolną punktacją mobilności)

Tabela 1: Częstotliwość monitorowania i kryteria humanitarnych punktów końcowych w różnych stadiach choroby. Częstotliwość monitorowania, obserwowane humanitarne punkty końcowe, odsetek humanitarnych punktów końcowych oraz kryteria humanitarnych punktów końcowych w różnych stadiach choroby.

Odruch prostowaniaMobilnośćCzas do momentu odwrócenia na plecyLimit czasowy pomiaru zakresu ruchu (mobilny / letargiczny / nieruchomy)Kryteria oceny ruchomości
PrawaMobilny4 s Dodatkowe 8 sMyszy wykonują kilka kroków pod rząd, utrzymując pęd do przodu i badając otoczenie. Szczenię nie przewraca się.
LetargicznyMysz jest w stanie zrobić krok, lecz zatrzymuje się i robi pauzę przed wykonaniem kolejnego. Szczenię może się przewrócić.
NieruchomyMysz nie wykonuje żadnych kroków po odzyskaniu równowagi. Szczenię może upaść.
Błąd po prawej stronieRuchomość stawów biodrowychTen sam czas 4 s wykorzystano do pomiaru odruchu prostowaniaEnergiczny ruch biodra z rotacją górnej części nogi poza 90° z pozycji poziomej przynajmniej raz w ciągu 4 s.
Ociężałe biodraRuch biodra do, lecz nie poza 90° z poziomu poziomego.
Stawy biodrowe nieruchomeKończyny mogą poruszać się poprzez wyprost i zgięcie, jednak biodra nie rotują. Szczenię wygląda na bardzo chore. 

Tabela 2: Tabela monitorowania i kryteria określania oceny stanu zdrowia myszy. Podane kryteria zostały wykorzystane do zdefiniowania grup kategorii zdrowia myszy oraz do zmniejszenia zmienności indywidualnej przy przypisywaniu ocen stanu zdrowia.

Dyskusja

Myszy noworodkowe po porodzie mają bardzo ograniczoną mobilność i nie są w stanie wyprostować się po umieszczeniu na plecach, nawet jeśli nie są kwestionowane. Do DOL 7, wieku myszy z wyzwaniem w tym modelu, zakres ruchu rozciągający się od Rights-Mobile do FTR-Mobile zaobserwowano u myszy bez wyzwania, z istotną różnicą, a mianowicie, że niekwestionowana mysz w tym wieku nie wykazywała zachowania FTR-letargiczne. Zaobserwowano, że tylko myszy z posocznicą wielodrobnoustrojową stały się ospałe FTR; Dlatego ta odpowiedź może być markerem ciężkości choroby. Zwracanie uwagi na odcięcie kąta 90° od poziomu dla ruchu bioder pozwala na konsekwentne i dokładne przypisanie ospałego lub ruchomego ruchu bioder u myszy. Wybrano przedział czasowy 4 s, aby sprawdzić, czy mysz może się wyprostować, ponieważ myszy bez wyzwań były w stanie konsekwentnie wyprostować się w tym przedziale czasowym. Unikano wielokrotnego pomiaru tej samej myszy, natomiast czas na wyprostowanie się i pomiar ruchomości bioder ograniczono do 4 s, aby uniknąć nadmiernego zmęczenia myszy, co w przeciwnym razie mogłoby wpłynąć na jej zdolność do pozyskiwania pożywienia i ciepła oraz mogłoby wpłynąć na jej rokowanie w sprawie poprawy. Zaobserwowano prostowanie się zarówno po lewej, jak i po prawej stronie, a wyższy z wyników wykorzystano do określenia, czy mysz znajdowała się w humanitarnym punkcie końcowym, ponieważ stwierdzono, że niektóre myszy wykazują FTR-Nonmobile po jednej stronie, ale mają większą mobilność po drugiej stronie i są w stanie ostatecznie wyzdrowieć.

System punktacji używany do oceny zdrowia myszy opierał się na zastosowaniu kategorycznych odcięć do tego, co jest spektrum ruchu, a zatem mógł być podatny na indywidualne odchylenia. Personel został przeszkolony razem, aby upewnić się, że każda osoba ocenia myszy tak samo; Jednak prawdopodobnie pozostanie pewien poziom subiektywności prowadzący do zmienności. Spójność punktacji oceniono, prosząc siedmiu badaczy, którzy wcześniej nie prowadzili monitorowania noworodków na myszach, aby poznali wymagania określone w tym protokole i filmie, a następnie niezależnie przypisali zachowania i określili humanitarny punkt końcowy. Zaobserwowano 97% dokładność przy punktacji przeprowadzonej na 60 myszach z prowizją, co sugeruje, że indywidualne uprzedzenia nie odgrywają znaczącej roli w przypisaniach behawioralnych tego modelu. Przedstawiony protokół monitorowania behawioralnego opiera się na obserwacjach zwierząt poddanych badaniu DOL 7, jednak myszy młodsze niż 6 dni w niekwestionowanym stanie zdrowia nie mogą konsekwentnie się naprawiać. W związku z tym opisane humanitarne kryteria punktu końcowego nie mogły być bezpośrednio zastosowane do młodszych myszy. Jeśli w tym modelu eksperymentalnym wykorzystuje się młodsze myszy lub jeśli stosuje się inny model prowokacyjny o różnej kinetyce choroby, należy opracować i pilotować odpowiednie humanitarne kryteria punktu końcowego, aby uniknąć eutanazji myszy, które w przeciwnym razie ostatecznie wyzdrowiałyby. System punktacji przedstawia solidną metodę poprawy klasyfikacji humanitarnych punktów końcowych, która po przetestowaniu i potwierdzeniu może potencjalnie zostać zastosowana w innych modelach.

Każde przygotowanie gnojowicy jelita ślepego lub użycie nowego szczepu myszy wymagało retitracji dawki gnojowicy jelita ślepego do podania w celu uzyskania podobnej dawki śmiertelnej. Każdy preparat został ustandaryzowany przez odczyt interesujący nas sam, a mianowicie przeżycie, a nie podający tę samą liczbę bakterii. Stężenie bakterii żywotnych w każdym preparatzie gnojowicy jelita ślepego różniło się nieznacznie, potencjalnie z powodu różnic w bakteriach komensalnych dawcy lub z powodu różnic w masie pozostawionej w sitku komórkowym gnojowicy jelita ślepego po filtracji. Podczas miareczkowania gnojowicy jelita ślepego pierwsze dwa mioty podzielono na dwie grupy, a każdej połowie miotu podano jedną z dwóch dawek, tak aby każda z dawek została przetestowana w dwóch miotach. Jeśli uzyskany wskaźnik przeżycia nie odpowiadał wymaganemu poziomowi, wówczas dawkę prowokacyjną zwiększano lub zmniejszano o 5%-10% i eksperyment powtarzano. Wykorzystano wiele miotów, aby uwzględnić różnice między miotami, które mogą powodować odporność lub zwiększoną podatność na sepsę w miocie. Ważne było dokładne mianowanie gnojowicy jelita ślepego przy każdym nowym przygotowaniu, aby zapewnić, że nowe miareczkowanie gnojowicy jelita ślepego było porównywalne z poprzednimi preparatami gnojowicy jelita ślepego. Zaobserwowano, że okresy nadmiernego hałasu i wibracji, szczególnie podczas zagęszczania asfaltu oraz budowy pobliskiego budynku i drogi, zwiększają naprężenia w zaporach. Wiązało się to ze zwiększonymi wskaźnikami kanibalizacji i wpłynęło na śmiertelność eksperymentów dotyczących przeżycia, dotykając nawet myszy bez wyzwań, co wskazuje, że mogą istnieć zewnętrzne wpływy na przeżycie noworodków, które również należy kontrolować.

Wcześniejsze metody przygotowania gnojowicy jelita ślepego obejmowały albo użycie świeżej gnojowicy jelita ślepego, albo przygotowanie zamrożonej gnojowicy jelita ślepego, przy użyciu różnych metod, w tym przechowywania w glicerolu, który nieuchronnie zostałby przeniesiony podczas wyzwania. Podczas gdy stosowanie świeżej gnojowicy jelita ślepego ma tę zaletę, że skład bakteryjny jest najbardziej zbliżony do oryginalnej zawartości jelita ślepego, istnieje ryzyko rozbieżności między poszczególnymi myszami-dawcami ze względu na zmienność bakterii komensalnych. Chociaż zostało to zminimalizowane dzięki użyciu dawców jelita ślepego od tego samego dostawcy z minimalnym czasem między przybyciem a postępem eksperymentu, może to stać się zbyt kosztowną opcją dla niektórych laboratoriów i stanowiło kolejne wyzwanie logistyczne związane z dostępnością myszy w tym samym wieku podczas rozpoczynania eksperymentu z gnojowicą jelita ślepego u nowonarodzonych myszy, które miały 7 dni. Zastosowano alternatywną metodę wykorzystania świeżej gnojowicy jelita ślepego, w której zawartość jelita ślepego wielu dorosłych dawców została zebrana, ponownie zawieszona w D5W, zamrożona w temperaturze -80 °C bez glicerolu i rozmrożona po jednej porcji na raz do eksperymentów. Wykorzystanie gnojowicy jelita ślepego dorosłego dawcy do badania sepsy noworodków może potencjalnie przenosić gatunki bakterii obecnych w gnojowicy jelita ślepego, na które nowonarodzona mysz nie była narażona, ale jest to strategia, która pozwala na badanie sepsy u noworodków myszy i była wykorzystywana do badania biologii noworodków myszy w ciągu ostatnich13 lat. Rozdział 14,15. Gnojowica jelita ślepego została rozcieńczona w D5W, aby zapewnić odżywienie bakteriom, co pozwoliło na ustanowienie aktywnej infekcji po wstrzyknięciu bakterii i miało na celu naśladowanie dostępności składników odżywczych w jamie otrzewnej podczas martwiczego zapalenia jelit. Glicerol nie został włączony jako środek stabilizujący w zamrażaniu bakterii ze względu na potencjalne negatywne skutki uboczne, które mogą wynikać z samego wstrzyknięcia glicerolu. Gdyby glicerol został zawarty w preparacie zawiesiny jelita ślepego, wówczas potencjalne uszkodzenia, które może wywołać sam glicerol, musiałyby zostać przetestowane poprzez włączenie wstrzyknięcia samego glicerolu (bez zawiesiny jelita ślepego) u myszy, co zwiększyłoby użycie myszy. Żywotność bakterii gnojowicy jelita ślepego badano po zamrożeniu gnojowicy jelita ślepego bez glicerolu i stwierdzono, że jest stała, bez zmian w stężeniu bakterii w oddzielnych podwielokrotnościach tego samego preparatu gnojowicy jelita ślepego przechowywanego w temperaturze -80 °C przez okres 6 miesięcy. Sugeruje to, że przechowywanie bez glicerolu jest wykonalne w celu zapewnienia spójnego wyniku biologicznego. Zastosowanie masowo przygotowanej mrożonej gnojowicy jelita ślepego pozwoliło również na wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, zmniejszając koszty i wykorzystując samce myszy, które w przeciwnym razie byłyby nadmierne z hodowli, zmniejszając w ten sposób marnotrawstwo myszy.

Identyfikacja nieudanych wyzwań u myszy była ważna, aby uniknąć dodawania dodatkowego szumu do systemu. Po poddaniu się dootrzewnowemu wstrzyknięciu gnojowicy jelita ślepego, myszy obserwowano pod kątem obecności wybrzuszenia pod skórą, co wskazywało na nieudane wstrzyknięcie, które w rzeczywistości było podskórne. U myszy obserwowano nieszczelności w miejscu wstrzyknięcia, zarówno bezpośrednio po usunięciu igły, jak i po umożliwieniu im wykonania kroku po wstrzyknięciu, ponieważ myszy czasami (rzadko) przeciekały dopiero po przesunięciu kończyny miejsca wstrzyknięcia o krok. Obecność wybrzuszenia lub nieszczelności po wstrzyknięciu skutkowała usunięciem myszy z analizy. W końcu każdy z tych objawów może skutkować innym wynikiem z powodu nieprawidłowej ilości wstrzykniętej gnojowicy jelita ślepego, ponieważ zaobserwowano, że 5% różnica w dawce prowokacyjnej wpływa na późniejsze przeżycie.

Eksperymenty prowokacyjne z gnojowicą jelita ślepego często wymagały różnych docelowych dawek śmiertelnych przy różnych dawkach dostosowanych do masy. Z tego powodu objętość wtrysku może wynosić od zaledwie 20 μl do nawet 100 μl. Proporcjonalny błąd eksperymentalny związany z objętością martwej igły również zmienia się wraz z objętością wstrzyknięcia, co zwiększa trudność bezpośredniego porównania różnych dawek. Dzięki prostej modyfikacji polegającej na standaryzacji objętości iniekcji, to źródło wariancji jest usuwane z eksperymentu.

System monitorowania zachowania noworodków myszy zastosowany w tym protokole jest pierwszym w swoim rodzaju. Naukowcy, którzy zamierzają prowadzić etyczne badania na nowonarodzonych myszach, często borykają się z wyzwaniem braku zasobów do oceny dobrostanu zwierzęcia w tym wieku. Prezentowany intuicyjny i spójny system monitorowania zaczyna wypełniać tę lukę w wiedzy. Co ważne, to oparte na dowodach podejście nie tylko podnosi jakość uzyskanych danych doświadczalnych, ale jednocześnie zmniejsza cierpienie zwierząt doświadczalnych.

Oświadczenia

Dr James Wynn otrzymuje wsparcie od National Institutes of Health (NIH)/National Institute of General Medical Sciences (R01GM128452) oraz NIH/Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD089939).

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Claire Harrison i Animal Care Facility w British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) za ich wsparcie w pracy ze zwierzętami, a także dla dr Po-Yan Cheng za ich wskazówki i wkład w monitorowanie i dobrostan zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 - 20 μ L końcówki do pipetVWR732-0799
1,8 ml Probówka do mikrowirówekCostar3621
100 - 1000 μ L końcówki do pipetVWR732-0801
1 - 200 μ L końcówki do pipetVWR732-0800
15 ml Probówka wirówkowaFroggaBioTB15-25
23G1igły Becton Dickinson305145tylko igła, a nie strzykawka, służąca do przypinania myszy do styropianu
28G 0,5 ml Strzykawka insulinowaBD329461
2 ml Fiolka kriogenicznaCorning430488
50 ml Probówka wirówkowaFisher scientific14-432-22
Pipeta 5 mlCostar4487
6 - 10-tygodniowe dorosłe myszy C57BL/6JJackson Laboratories664
7 + jednodniowe myszy noworodkowe C57BL/6JWyhodowane w domun.a
70 μ m Sitko do komórekFalcon352350
Defibrynowana krew owczaDalynnHS30-500
Dekstroza 5% wody (D5W)BaxterJB0080
Kleszcze preparacyjneVWR  82027-386
Nożyczki preparacyjne, ostra końcówkaVWR  82027-592
Nożyczki preparacyjne, ostra/końcówkaVWR82027-594
Etanol (HistoPrep 95% denaturowany alkohol etylowy)FisherbrandHC11001GLrozcieńczony do 70% podwójnie destylowaną wodą
Marker odporny na etanol; Marker laboratoryjnyVWR52877-310
EZ Anesthesia VaporizerEZ AnesthesiaEZ-155
Germinator 500, Narzędzie chirurgiczne do sterylizacji na sucho (sterylizator gorących kulek)Braintree ScientificGER 5287-120V
IsofluraneFresenius KabiCP0406V2
Micro SpatulaChemglassCG-1983-12
PipetaDrummond4-000-100
Klasyczna pipeta Rainin PR-1000Rainin17008653
Klasyczna pipeta Rainin PR-20Pipeta klasyczna Rainin
Klasyczna pipeta Rainin PR-200do 17008652Rainin
SartoriusBL 150 S
Kleszczyki do próbekVWR82027-440 / 82027-442
Kwadratowa butelka do przechowywania 1000 mlCorning431433
Płyta styropianowaDowolnan.a
Sure-Seal Komora eutanazja myszy/szczuraEuthanexEZ-178
Agar sojowy tryptycznySigma-Aldrich22091-2,5KG
VX-200 Lab Vortex MixerLabnet InternationalS0200
waga papierFisherbrand09-898-12B
17008650 Waga

Bibliografia

  1. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
  2. Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
  3. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
  4. Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
  5. Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
  6. Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
  7. Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
  8. Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
  9. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
  10. Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).
  11. Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
  12. Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
  13. Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).
  14. Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
  15. Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
  16. Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).
  17. Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
  18. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
  19. Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
  20. Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
  21. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
  22. Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
  23. Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. Humane endpoints in shock research. SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).
  24. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model sepsy noworodkowejprzygotowanie zawiesiny tre ci k kawnicymonitorowanie humanitarnych punkt w ko cowychindukowanie infekcji u m odych myszydawka dostosowana do masy cia aocena stanu zdrowiatest odruchu prostowaniaanaliza krzywej prze ywalno ciprotok dobrostanu zwierz t
Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.